Gostaríamos de agradecer a Sra. Christine A. Winters para excelente assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo Programa Básico de Neurociências do Programa NINDS intramuros Research, NIH (Z01 NS002610).

A abordagem descrita aqui foi desenvolvido utilizando instrumentos específicos, ferramentas e software. Porque laboratórios não vai usar a mesma configuração experimental da abordagem é generalizada sempre que possível. 1. Congelação rápida O método analítico para ser descrito é absolutamente dependente abordagens criogénicos para: 1) o &quot;criofixação&quot; de células ou tecidos de uma maneira que preserva quantitativamente a distribuição dos componentes do tecido difusíveis e elementos químicos que foram em células vivas, no momento da congelação e 2) a preparação de ultrafinos criosecções adequado para imagem e análise de TEM. Estas técnicas são brevemente descritos aqui, mas os detalhes necessários para reproduzir estes procedimentos em outros laboratórios estão fora do escopo deste artigo. Os leitores interessados ​​são encaminhados para excelentes artigos recentes 9,14. Atenção: Esta seção descreve o uso de liquetano efied, que é altamente inflamável e explosiva; devem ser tomadas precauções apropriadas. O operador deve também estar familiarizado com nitrogênio líquido (LN 2) as precauções de segurança, incluindo o revestimento protetor laboratório, óculos e luvas cryoresistant. Nota: Aqui e por toda parte, todas as ferramentas (fórceps, etc) usado para lidar com amostras congeladas devem ser pré-resfriada em LN 2 antes do uso para evitar o descongelamento acidental. Células cultivadas sobre lamínulas <ol><li> Preparar um dispositivo de congelação por condensação de imersão etano gasoso a -160 ° C na cavidade central LN 2-arrefecida. Encha até a marca e cobrir o poço com a tampa giratória de alumínio quando não estiver em uso. </li><li> Usando cunhas de papel de filtro, borrão lamelas de plástico de células cultivadas sob experimentalmente condições adequadas a um filme aquoso fino. Seque a partir da borda, de modo a evitar tocar no tecido, o filme residual ideais, determinada por tentativa e erro, é tão fino quanto possível, mas não tão them como a evaporar e permitir a secagem da superfície do tecido. </li><li> Segurando a lamela pela borda com uma pinça de fixação, mergulhe rapidamente em etano líquido, manualmente ou usando o êmbolo movido a gravidade. </li><li> Coloque a lamela congelado em uma tigela de isopor nas proximidades de LN 2, grande o suficiente para manipular o número desejado de lamelas em recipientes de armazenamento de longo prazo. Latas com tampa de rosca de alumínio que não aproveitar sob LN 2 são recomendados. </li></ol> Congelação rápida de fatias cerebrais em cultura <ol start="5"><li> Sob um microscópio de dissecação, ver e orientar uma fatia do hipocampo organotípica, imperturbável e ainda ligado à inserção da membrana cultura. Coloque pontos de referência sobre a membrana perto da borda da fatia com uma caneta de tipo Sharpie preto e fotografia. </li><li> Ainda sob o microscópio, cortar aprox. 5 x 5 milímetros quadrados de membrana com fatias individuais centradas nas praças. Evite tocar a fatia ou dobrar o membrane. </li><li> Montar uma fatia apoiado por uma membrana, amortecido por um ¼ de almofada agar diâmetro, em um disco de alumínio design personalizado feito para caber um cryoultramicrotome (descrito abaixo). Rapidamente congelar a fatia por pneumaticamente impulsionando-a contra um bloco de safira LN-2 arrefecido por meio de um dispositivo personalizado &quot;bater de congelamento&quot;. </li><li> Mover para armazenamento, tal como descrito para as células cultivadas. </li></ol> 2. Cryosectioning Ressalva: produzir com sucesso fitas de corte seco de cortes ultrafinos, enquanto simples e lógico, requer treinamento, paciência e prática considerável. <ol><li> Asse um cryoultramicrotome equipado com um cryoattachment e legal para -135 ° C. </li><li> Corte lamelas congelados em aprox. 3 x 3 quadrados mm usando uma afiada, bisturi pré-resfriada. Incorporar pedaços com culturas voltado para cima num líquido viscoso &quot;cryoglue&quot; (uma mistura de 01:06 de etanol e 2-propanol 11), no padrão 3pinos de alumínio mm de diâmetro projetado para caber o chuck espécime micrótomo. Evite vazamento cryoglue na superfície da cultura. Solidificar cryoglue, baixando a temperatura para cryobox ≤ -160 ° C. <ul class="lalpha"><li> Para fatias de cérebro congelado, fixar firmemente os discos diretamente para um mandril espécime feito por medida por meio de um colar de parafuso. </li></ul></li><li> Apare áreas selecionadas dos espécimes congelados - por exemplo, áreas ricas em células de peças lamela ou áreas identificadas fatias - a um aprox. 250 x 250 um bloco rosto e ~ 100 microns de dimensão usando uma ferramenta de diamante de corte. </li><li> Fitas seco de corte de secções finas em ca. -160 ° C utilizando um diamante cryoknife 35 °, essencialmente como descritos no referencs 4, 9. Velocidade de corte e faca ângulo de folga são determinados empiricamente, um bom ponto de partida é 0,4-0,6 mm / s em 9 °. A espessura nominal, isto é, amostra de avanço, de secções hidratadas ié tipicamente de 80 nm, embora seções são realmente de 1,5 x 2,0 x mais grosso, principalmente devido à compressão. Para o corte satisfatório, um dispositivo anti-estática é essencial. Coloque a ponta de ionização do dispositivo 0,5-1 cm da borda de faca e ajustar a potência de saída até fitas satisfatórios de seções são produzidos. </li><li> Prepare sondas cílios colando (com epóxi) cílios para varas aplicador de madeira. Usando tal sonda, pegar e seções de transferência da parte de trás da faca Onto brilho descarregada, filmes de apoio pioloform revestido de carbono emitidos mais de 100 malha grades de cobre dobrar e descansam em um índio envelope meia folha dobrada em uma prateleira atrás de trabalho a faca. Dobre a metade superior da grade e envelope, pressione com uma ferramenta de prensagem a frio. </li><li> Transferência grades envolto a uma caixa de grade conveniente e guarde em uma lata de alumínio, tal como descrito no passo 1.4. </li></ol> 3. Cryotransfer de amostras para o microscópio eletrônico O instrumento principal para EPMAneste laboratório é um microscópio eletrônico analítico operado a 120 kV e equipado para criomicroscopia, ou seja, concebido com um vácuo limpo, anticontaminator espécime-área, um de alta sensibilidade câmera digital 2k x 2k e suporte da amostra cryotransfer. Verifique com antecedência alinhamento microscópio e condições de operação em ambos os modos de baixa e de alta ampliação e confirmar um vácuo coluna satisfatório, o ideal é ≤ 10 -7 Torr. Sintonize-se, se necessário. <ol><li> Confirme se o isolamento a vácuo do componente Dewar do cryoholder é satisfatória. Bomba como necessário. </li><li> Arrefecer o cryoholder à sua temperatura mínima, pelo menos -160 ° C, enquanto em alto vácuo dentro do estágio do microscópio; retire o cabo que liga o suporte à sua caixa de controle. Incline o goniômetro 45 ° no sentido horário antes de remover o suporte para minimizar LN 2 derramando sobre superfícies de operador e de microscópio. </li><li> Prepare o cryoworkstation bancada pelo resfriamento do isolar integranted copo de ≤ 160 ° C. </li><li> Transfer (rapidamente!) o cryoholder resfriado de microscópio crio a estação de trabalho. Recolha geada escudo do titular. </li><li> Recuperar sob LN 2 um sanduíche da rede de armazenamento e lugar na mesa de trabalho do cryoworkstation. Um anel de retenção de amostra bem do detentor também é colocada sobre a mesa. </li><li> Abra o envelope de índio e mover a grade dobrável fechada para o bem do espécime cryoholder. Fixe a grade com anel de retenção usando a ferramenta chave fornecida e fechar o escudo geada. </li><li> Remover rapidamente o cryoholder do cryoworkstation e inserir na câmara do microscópio e passar a seqüência de bombeamento, o mais rapidamente possível. Na inserção, deve haver uma interrupção mínima da coluna de vácuo. </li><li> Retornar goniômetro a 0 ° de inclinação. Volte a ligar e reenergizar a caixa de controle e verifique se a temperatura da amostra é ≤ 150 ° C. </li><li> Encher o Dewar dosuporte do espécime e permitir a vácuo e temperatura para se recuperar totalmente. </li></ol> 4. Levantamento Visual das Seções <ol><li> Recolha o escudo geada do titular para expor amostra e ligar o feixe de elétrons. </li><li> Visualmente avaliar a amostra com pequeno aumento, normalmente 250X, e baixa iluminação. Tal como ilustrado na Figura 1, as secções deve ser fino e suave, não dobradas ou sobrepostas, liso e bem ligados à película de suporte, e, geralmente, não tapada por barras de grelha. </li><li> Opcionalmente fotografar seções selecionadas. (NOTA: Evite a exposição do feixe, desde cortes congelados hidratado são muito suscetíveis a danos induzidos por feixe.) Use o palco automatizado goniômetro digital para armazenar coordenadas de seções selecionadas. </li></ol> 5. Liofilização de Seções <ol><li> Liofilizar secções, aumentando a temperatura até cerca de titular. -100 ° C durante ~ 30 min. </li><li> Recool titular a -160 ° C ou abaixo. </li><li&gt; Antes de imagem, desligue unidade de controle cryoholder e cabo do controlador fisicamente desconexão para evitar imagem deriva devido a ciclos térmicos e / ou vibração pickup. </li></ol> 6. Imagens de células e organelas Imagens estruturais das secções liofilizadas são obtidas em ca. -160 ° C como de baixa dose, imagens de perda de zero gravados digitalmente usando uma câmera CCD de varredura lenta 2k x 2k controlado por software apropriado. <ol><li> Ative o EM no modo de oi-mag. </li><li> Escolha e imagem em ~ 2000 X (como TIFF, veja a Figura 2), as células selecionadas e áreas subcelulares de interesse nas seções de alta qualidade cujas localizações foram previamente gravadas e armazenadas. (NOTA: As seções secas são agora bem menos frágil e menos suscetíveis a danos por feixe de elétrons. </li><li> Avaliar as imagens a fim de selecionar as regiões de interesse (ROIs) para análise de raios-X. Este passo pode opcionalmente ser realizado fora de linha, no caso em que a EM pode ser transformadodesligado e a amostra deixada aquecer até à temperatura ambiente. </li></ol> 7. Aquisição de X-ray Spectra Espectros de raios-X pode ser gravado usando qualquer um dos vários comerciais ou de design personalizado de raios-X sistemas de análise minimamente que consistem em um raio-X (EDX) detector de energia dispersiva, eletrônica pulso processadores associados e aquisição e exibição de software compatível. (O sistema utilizado neste laboratório é descrito na Tabela 1.) <ol><li> Configurar o EM para a aquisição de raios-X por inserção do detector de EDX para a coluna (se necessário), retirando-se o objectivo da abertura, e a inserção de centragem e quaisquer aberturas de radiação parasita. Ajustar o cryoholder à temperatura mais baixa a que a contaminação geada da amostra é evitada, mas, pelo menos, abaixo de -100 ° C. </li><li> Incline o suporte de 20 ° em direção ao detector. </li><li> Sob condições de imagem de campo amplo, e assumindo que se pretende analisar a matriz de uma individual mitocôndrias, escolha uma mitocôndria para análise, movê-lo para o centro do campo e se concentrar. </li><li> Ir para o modo local (em alguns microscópios apenas convergir o feixe usando segundo foco do condensador) e aumentar a corrente de feixe até ca. 3 nA (como medido com um copo de Faraday ou semelhante) para um local de 100 nm. </li><li> Inicie o software de aquisição de espectro e começar a 100 aquisições segundo, que podem ser vistos tempo real no monitor de visualização. Guardar espectro registada (Figura 2). O formato EMSA padrão da indústria é o preferido. </li><li> Desligue o EM e transferir o arquivo (s) de múltiplos espectros para um (offline) workstation análise. </li></ol> 8. Análise de raios X Os espectros A análise qualitativa Um espectro de EDX (Figura 2, inserção) é, essencialmente, uma trama xy da intensidade dos raios-X versus a energia. Spectra conter informações qualitativas e quantitativas sobre a composição elementar de tele analisou o volume, em que a energia &quot;característica&quot; de um pico identifica o elemento que dá origem a esse pico, enquanto a intensidade reflete a quantidade desse elemento. Os picos característicos montar na parte superior de um fundo que varia lentamente, o &quot;contínuo&quot;. (A legenda da Figura 2 discute mais detalhes salientes de espectros de EDX.) A energia de pico para os colectores de toda a tabela periódica são definidos pela estrutura electrónica bem conhecido dos elementos, assim, todas as ligações de software EDX para uma base de dados que identifica automaticamente os componentes de um analito. Em um contexto fisiológico, os elementos de interesse geral que estão bem adaptados à análise EDX incluem Na (K α em 1,04 keV), P (2,01 keV), K (3,31 keV) e Ca (3,69 keV). <ol><li> Aproveite banco de dados de software disponíveis e rotinas de pico correspondentes para identificar os principais elementos nos espectros. Em uma amostra biológica esperar encontrar picos de Na, Mg, P, S, Cl, K, Ca e. (ATENÇÃO:Os dois últimos elementos se sobrepõem!) </li></ol> A análise quantitativa A análise quantitativa do espectro de EDX consiste em extrair a área integrada dos picos identificados e converter este valor para uma concentração. Para análise biológica, a abordagem é estabelecido o método de pico / contínuo Municipal 4,7,10, que tira partido do facto de que a intensidade do contínuo (definido acima e na Figura 2) é proporcional à massa seca do volume analisado . Assim, a relação da área de superfície / contínuo pico, quando em comparação com a mesma proporção em espectros de padrões de composição conhecida, especifica a concentração no compartimento celular alvo. Note-se que esta abordagem proporciona concentrações em unidades de moles por peso, geralmente expresso como mmol / kg de peso seco. Esta unidade é incomum e de interpretação podem exigir conversão adicional de, por exemplo, mmol / l de peso molhado ou mmol / mg proteína, como descrito elsewhere 4,10. <ol start="2"><li> Extrair as áreas de pico (e estimativas de erro) de elementos biológicos entre Z = 10-20 (0,5-4,0 keV), isto é, Na, Mg, P, S, Cl, K e Ca, usando uma das rotinas de ajuste construído em software de análise (ver Tabela 1, especialmente a nota 4). Este laboratório usa Simplex ou múltipla dos mínimos quadrados montagem. Note-se que este ajuste requer muita atenção para resolver a sobreposição entre K e Ca picos (ver Figura 2). </li><li> Integrar o continuum entre 1,45-1,61 keV. Regiões alternativa livre de interferência podem ser usados. </li><li> Calcular os rácios de pico / contínuo e depois concentrações por comparação com padrões. Propagar erros durante toda a análise. </li><li> Use software e fórmulas estatística padrão para calcular as médias que refletem a variabilidade biológica. </li></ol>

<ol>
	<li>Aronova, M. A., Kim, Y. C., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+EFTEM+mapping+of+near+physiological+calcium+concentrations+in+biological+specimens.">Quantitative EFTEM mapping of near physiological calcium concentrations in biological specimens.</a> Ultramicroscopy. 109, 201-212 (2009).</li><li>Aronova, M. A., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+mapping+by+electron+energy+loss+spectroscopy+in+biology.">Elemental mapping by electron energy loss spectroscopy in biology.</a> Methods Mol. Biol. 950, 209-226 (2013).</li><li>Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+neurodegenerative+diseases.">Calcium signaling and neurodegenerative diseases.</a> Trends Mol. Med. 15, 89-100 (2009).</li><li>Fernandez-Segura, E., Warley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+probe+X-ray+microanalysis+for+the+study+of+cell+physiology.">Electron probe X-ray microanalysis for the study of cell physiology.</a> Methods Cell Biol. 88, 19-43 (2008).</li><li>Gibson, G. E., Starkov, A., Blass, J. P., Ratan, R. R., Beal, M. 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Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li><li>LeFurgey, A., Bond, M., Ingram, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frontiers+in+electron+probe+microanalysis:+application+to+cell+physiology.">Frontiers in electron probe microanalysis: application to cell physiology.</a> Ultramicroscopy. 24, 185-219 (1988).</li><li>Newbury, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+X-ray+mapping:+X-ray+spectrum+imaging+above+100+kHz+output+count+rate+with+the+silicon+drift+detector.">The new X-ray mapping: X-ray spectrum imaging above 100 kHz output count rate with the silicon drift detector.</a> Microsc. Microanal. 12, 26-35 (2006).</li><li>Pierson, J., Vos, M., McIntosh, J. R., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+electron+cryotomography+of+vitreous+cryo-sections.">Perspectives on electron cryotomography of vitreous cryo-sections.</a> J. Electron Microsc. 60, S93-S100 (2011).</li><li>Pivovarova, N. B., Hongpaisan, J., Andrews, S. B., Friel, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depolarization-induced+mitochondrial+Ca+accumulation+in+sympathetic+neurons:+spatial+and+temporal+characteristics.">Depolarization-induced mitochondrial Ca accumulation in sympathetic neurons: spatial and temporal characteristics.</a> J. Neurosci. 19, 6372-6384 (1999).</li><li>Pivovarova, N. B., Nguyen, H. V., Winters, C. A., Brantner, C. A., Smith, C. L., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+calcium+overload+in+a+subpopulation+of+mitochondria+triggers+delayed+death+in+hippocampal+neurons.">Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. 24, 5611-5622 (2004).</li><li>Ritchie, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+simulation+in+DTSA-II.">Spectrum simulation in DTSA-II.</a> Microsc. Microanal. 15, 454-468 (2009).</li><li>Stanika, R. I., Winters, C. A., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+NMDA+receptor-dependent+calcium+loading+and+mitochondrial+dysfunction+in+CA1+vs.+CA3+hippocampal+neurons.">Differential NMDA receptor-dependent calcium loading and mitochondrial dysfunction in CA1 vs. CA3 hippocampal neurons.</a> Neurobiol. Dis. 37, 403-411 (2010).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+hemotaxis+receptor+Tsr.">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the hemotaxis receptor Tsr.</a> J. Microsc. 216, 76-83 (2004).</li></ol>

Os autores relatam nenhum conflito de interesse.

O método analítico baseado em microscópio electrónico aqui apresentada permite a detecção, identificação, quantificação e de vários elementos de interesse biológico, incluindo Na, K, P, e especialmente Ca. Estas análises podem ser realizadas em subcelular, por exemplo, intra-organelos, a resolução devido à possibilidade de localizar e identificar as estruturas de interesse nas imagens de criocortes preparados a partir de amostras rapidamente congelados de elevada qualidade. Note que nenhuma colo...

Os íons de cálcio são, indiscutivelmente, a entidade sinalização celular mais importante e versátil em biologia, desempenhando um papel essencial nos processos normais tão diversas como a transmissão sináptica e expressão gênica. Por outro lado, o cálcio é igualmente importante na morte celular. Em particular, a desregulamentação de cálcio é um fator-chave na lesão neuronal no AVC, Parkinson, Alzheimer e outras doenças neurodegenerativas 3,5. Assim, é extremamente importante para entender quantitativamente como o cálcio é distribuído no interior das células, e como isso muda após estímulos fisiológicos ou fisiopatológicos. Este objectivo é complicada pelo facto de que o cálcio é distribuído de forma dinâmica entre dois estados físicos - livre em solução ou ligada a um substrato - e que as concentrações de cálcio celular mudar ao longo de várias ordens de grandeza, como consequência da estimulação. Embora existam vários métodos avançados disponíveis para a análise de free de cálcio intracelular, a determinação das concentrações de cálcio total em compartimentos intracelulares definidos é realisticamente limitados a uma abordagem, isto é, electrões microanálise (EPMA). EPMA é uma técnica que os casais um espectrômetro de raios-X de um microscópio eletrônico de transmissão (TEM). O canhão de elétrons TEM foca, uma sonda de elétrons submicron parado em uma região subcelular de interesse e os raios-X específicos do elemento emitidas como resultado do bombardeio de elétrons são coletados e analisados ​​(ver referências 7, 4 para análises técnicas detalhadas). Vantagens de EPMA incluem resolução de nível organela única e sensibilidade submillimolar. Na prática, no entanto, requer técnicas de criofixação EPMA especializados e instrumentação para a preparação e análise de amostras. Aqui, são descritas as ferramentas, técnicas e instrumentos adequados para a medição de cálcio intracelular utilizando EPMA. Cálcio intramitocondrial é de i especialnterest em conta o papel fundamental que mitocondriais execuções de sobrecarga de cálcio em doenças neurodegenerativas.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS/MATERIALS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermanox plastic coverslips</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>72280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>For 6-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryopins</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>16701952</td>
			<td>Grooved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood applicators</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>72300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folding EM grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>4GC100/100</td>
			<td>100 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium foil</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>13982</td>
			<td>0.25 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing device</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>KF-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slam freezing device</td>
			<td>LifeCell</td>
			<td>CF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>UC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoattachment for microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>FC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond cryotrimming tool</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Cryotrim 45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond cryoknife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Cryo 35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antistatic device</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Hauf Static Line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo electron microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>EM912 Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM cryo specimen holder</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>CT3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-scan CCD camera, 2k x 2k</td>
			<td>Troendle (TRS)</td>
			<td>Sharpeye</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Olympus SIS</td>
			<td>iTEM suite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ED x-ray detector</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Linksystem Pentafet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse Processor</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>XP-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCI backplane card</td>
			<td>4pi Systems</td>
			<td>Spectral Engine II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Any OS9-compatible model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray analysis software</td>
			<td>NIST</td>
			<td>DTSA, DTSA II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<ol>
				<li>The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line.</li>
				<li>A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at <a href="http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4" target="_blank">http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4</a>.</li>
				<li>The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online.</li>
				<li>The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (<a href="http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm" target="_blank">http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm</a>)</li>
			</ol>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of total calcium in neurons by electron probe x-ray microanalysis

Neste artigo as ferramentas, técnicas e instrumentos adequados para medidas quantitativas de conteúdo elementar intracelular utilizando a técnica conhecida como microanálise eletrônica (EPMA) são descritos. Cálcio intramitocondrial é um foco especial por causa do papel crítico que a sobrecarga de cálcio mitocondrial desempenha nas doenças neurodegenerativas. O método baseia-se na análise de raios-X produzidos por um microscópio electrónico (EM) por interacção de um feixe de electrões com o espécime. A fim de manter a distribuição natural de elementos difusíveis em amostras de microscopia electrónica, EPMA requer &quot;criofixação&quot; de tecido, seguido pela preparação de criocortes ultrafinos. Congelamento rápido das células em cultura ou culturas organotípicas de fatias é realizada por imersão em etano líquido de congelação ou de congelação por bater contra um bloco de metal fria, respectivamente. Criosecções nominalmente 80 nm de espessura são cortadas seco, com uma faca de diamante em ca. -16076: C, montado no / grelhas de cobre revestidas com carbono pioloform, e cryotransferred num crio-EM usando um suporte cryospecimen especializado. Depois de inspecção visual e de mapeamento de localização no ≤ -160 ° C, e dose baixa de electrões, criocortes congeladas-hidratado são a -100 ° C durante ~ 30 min liofilizada. Imagens de nível Organelle de criosecções secos são registrados, também em baixas doses, por meio de uma câmera CCD-scan lento e regiões subcelulares de interesse selecionadas para análise. Raios-X emitidos por ROIs por um, focado, sonda de elétrons de alta intensidade estacionário são recolhidos por um raio-X de energia dispersiva (EDX) espectrômetro, processada pela eletrônica associados, e apresenta-se como um espectro de raios-X, ou seja, um lote de intensidade dos raios-X vs energia. O software adicional facilita: 1) identificação dos componentes elementares por suas &quot;características&quot; energias de pico e de impressões digitais e 2) análise quantitativa por extração de áreas de pico / fundo. Este artigo termina com dois exemplos que ilustram típicoAplicações EPMA, aquele em que a análise mitocondrial de cálcio fornecidos uma visão crítica sobre os mecanismos de lesão excitotoxic e outro que revelaram a base da resistência isquemia.

As células do cérebro tipicamente sustentar lesão excitotoxic como resultado da liberação de neurotransmissores patológico que ocorre em condições de isquemia. EPMA foi fundamental para descobrir como a capacidade das mitocôndrias neuronais de sequestrar grandes quantidades de cálcio subjacente ao mecanismo de lesão. A fotografia de microscopia electrónica na Figura 3 ilustra o aparecimento de mitocôndrias nos criocortes liofilizados de neurónios do hipocampo em cultura rapidamente congela...

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Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

Este artigo descreve a aplicação de microscopia eletrônica cryoanalytical para a medição quantitativa de teor de cálcio total e distribuição em resolução subcelular em espécimes biológicos fisiologicamente definidos.

Medição de cálcio total em neurônios por Electron Probe X-ray Microanálise

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

measurement-total-calcium-neurons-electron-probe-x-ray

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K visualizações.  National Institutes of Health.  Este artigo descreve a aplicação de microscopia eletrônica cryoanalytical para a medição quantitativa de teor de cálcio total e distribuição em resolução subcelular em espécimes biológicos fisiologicamente definidos. 

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Neurociência

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

Em larga escala de gravação de Neurônios por sondas de silicone móveis em Comportando Roedores

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

De gravação simultânea de sinais de cálcio dos neurônios identificados e comportamento alimentar de Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Respostas de imagem de cálcio nos neurônios GFP-tagged fatias de cérebro de rato Hipotalâmicos

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the structure of neurites is critical to understanding how these processes move materials and signals that support synaptic communication. Electron microscopy (EM) has been traditionally used to assess the ultrastructural features within neurites; however, the exposure to organic solvent during dehydration and resin embedding can distort structures. An important unmet goal is the formulation of procedures that allow for structural evaluations not impacted by such artifacts.
Here, we have established a detailed and reproducible protocol for growing and flash-freezing whole neurites of different primary neurons on electron microscopy grids followed by their examination with cryo-electron tomography (cryo-ET). This technique allows for 3-D visualization of frozen, hydrated neurites at nanometer resolution, facilitating assessment of their morphological differences. Our protocol yields an unprecedented view of dorsal root ganglion (DRG) neurites, and a visualization of hippocampal neurites in their near-native state. As such, these methods create a foundation for future studies on neurites of both normal neurons and those impacted by neurological disorders.

To preserve neuronal processes for ultrastructural analysis, we describe a protocol for plating of primary neurons on electron microscopy grids followed by flash freezing, yielding samples suspended in a layer of vitreous ice. These samples can be examined with a cryo-electron microscope to visualize structures at the nanometer scale.

Preparação de primário neurônios para visualizar Neuritos num Estado Frozen-hidratado Usando Cryo-Electron Tomografia

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Fosfato de cálcio transfecção de primário neurônios do hipocampo

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Imagem de cálcio Ratiometric de neurônios individuais se comportando Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional abnormalities of LC impact several brain regions including cortex, hippocampus, and cerebellum and may contribute to depression, bipolar disorder, anxiety, as well as Parkinson disease and Alzheimer disease. These disorders are often associated with metal misbalance, but the role of metals in LC is only partially understood. Morphologic and functional studies of LC are needed to better understand the human pathologies and contribution of metals. Mice are a widely used experimental model, but the mouse LC is small (~0.3 mm diameter) and hard to identify for a non-expert. Here, we describe a step-by-step immunohistochemistry-based protocol to localize the LC in the mouse brain. Dopamine-&#946;-hydroxylase (DBH), and alternatively, tyrosine hydroxylase (TH), both enzymes highly expressed in the LC, are used as immunohistochemical markers in brain slices. Sections adjacent to LC-containing sections can be used for further analysis, including histology for morphological studies, metabolic testing, as well as metal imaging by X-ray fluorescence microscopy (XFM).

The locus coeruleus is a small cluster of neurons involved in a variety of physiological processes. Here, we describe a protocol to prepare mouse brain sections for studies of proteins and metals in this nucleus.

Localização do Locus Coeruleus no cérebro do rato

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.