Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Friedrich Miescher de Pesquisa Biomédica, a Sociedade Max Planck, e do Programa Científico Fronteiras Humanas.

Todos os procedimentos com animais foram aprovados e realizados em conformidade com as diretrizes do Departamento de Cantão Basel-Stadt Veterinária. 1. Hardware e Software Setup <ol><li> Dois fótons configuração microscópio de varredura: <ol><li> Use um laser infravermelho pulsado como fonte de iluminação (largura de pulso &lt;120 FSEC). </li><li> Use uma cabeça de leitura composto por um scanner de ressonância 8 ou 12 kHz e um padrão galvanometer Nota:. Isso permite taxas de quadro de 40 ou 60 Hz em 750 x 400 pixels. A alta taxa de quadros é fundamental para minimizar a distorção da imagem de movimento do cérebro induzido. Além disso, a rápida varredura de ressonância resulta em um rendimento de sinal maior e reduz fotodegradação 16 e fototoxicidade. </li><li> Use uma alta velocidade z-passo piezo-eléctrico para sequencialmente imagens intercaladas tempo, adquirir em várias profundidades Nota:. Isto é opcional e utilizado para aumentar a produção de dados, em detrimento da taxa de quadros. </li><li> Use amecânica redutor para reduzir a exposição ao laser para o tecido. Ajustar a largura do redutor de acordo com a amplitude do scanner de ressonância Nota:. Devido à natureza sinusoidal do percurso de varrimento de um scanner de ressonância, o feixe de laser se move lenta comparativamente aos pontos de resposta de verificação. Para evitar danos do tecido nesses pontos de rotação em que a exposição do laser é maior, um redutor mecânico é introduzido no plano focal entre a verificação e lentes de tubo que interrompe o feixe de laser. </li><li> Para aquisição de dados usar um digitalizador de alta velocidade (800 MHz) em combinação com um gate array programável em campo (FPGA) Nota:. Os filtros passa-alta FPGA e escaninhos do sinal PMT em pixels. A combinação do filtro passa-alto em FPGA e o filtro de passagem baixa efectiva no resultado amplificador PMT em um filtro passa-banda centrado aproximadamente em torno da frequência de repetição do laser (80 MHz). FPGA código de exemplo é fornecido como um complemento. </li></ol></li><li> Instalação de esteira pneumática com base no design de Dombeck e colegas 2 <ol><li> Ligue o suporte da esfera para uma linha de fornecimento de ar usando um tubo de, pelo menos, 10 mm de diâmetro interno de alimentação de ar. Maximizar a seção transversal do titular bola de entrada de alimentação de ar e coloque uma ampla quantidade de tubulação entre o principal suprimento de ar e suporte a bola Nota:. Seção transversal aumentada e aumento do comprimento do tubo de alimentação de ar reduz a geração de ruído. </li><li> Coloque uma bola de espuma de poliestireno (20 cm de diâmetro) em um suporte de bola e 3D-impressos personalizados. </li><li> Se o paradigma comportamental requer apenas para a frente (ou para trás) a locomoção, para restringir o movimento da bola para o (tom) de eixo horizontal através da inserção de um pino (por exemplo, uma agulha hipodérmica 19 G), no lado da bola Nota:. Animais tipicamente adaptar a a configuração muito mais rápido neste reduzido paradigma rotação. </li><li> Movimento faixa da bola usando um ou dois ratos de computador ópticopara detectar o movimento em torno de dois ou todos os três eixos, respectivamente Nota:. Os ratos de computador deve idealmente operar com um diodo infravermelho para menos interferência com a imagem latente. </li></ol></li><li> Configuração do ambiente de realidade virtual <ol><li> Prepare o ambiente de realidade virtual Nota:. Um exemplo de ambiente baseado em Panda3D, um motor de jogo disponível gratuitamente, é fornecido como um complemento. Os objetos do ambiente virtual são gerados usando Wings3D, um modelador 3D de código aberto. O programa de exemplo lê informações de posição em um cartão de aquisição de dados e traduz isso em movimento no ambiente virtual. O código também realiza a transformação não-linear necessário para o ambiente a ser projetada em uma tela toroidal. A construção detalhada do ecrã toroidal tenha sido descrita em outro lugar 14,17. </li><li> Utilize projetores LED ou telas de computador LED backlit para apresentar o ambiente virtual. Integrar um cir gatingcuit para rápido cintilação dos LEDs durante o exame Nota:. Um problema inerente em dois fótons de imagem durante a estimulação visual é vazamento de luz proveniente do sistema de estimulação visual, que pode ser reduzido, protegendo o objetivo. No entanto, a fuga de luz do sistema de estimulação visual pode ser totalmente abolida por sincronizar a saída de luz do projetor para os pontos de rotação do scanner de ressonância (quando os dados não são adquiridos), como é feito com arenas de LED usados ​​para estimulação visual durante o exame em 18 de Drosophila. Isso resulta em uma alternância de alta velocidade efectiva de estimulação visual e de aquisição de dados (ver Figura 2). A frequência de cintilação (24 kHz) é ordens de magnitude acima do limiar de fusão de cintilação, acima do qual a cintilação não é mais percebida pelo animal. O diagrama de circuito electrónico da presente modificação de um projector de LEDs comerciais é mostrado na Figura 3. </li></ol></li><li> Filhoteil rastreamento <ol><li> Use uma câmera de vídeo baseado CMOS (30 fps) para rastreamento de posição da pupila. Certifique-se de que a câmara não contém um filtro de bloqueio de infravermelho Nota:. A pupila é visível em alto contraste durante as gravações, devido à luz difusa do laser de excitação de dois fótons de sair através do olho. Posição da pupila eo diâmetro é extraído em tempo real usando o software programado personalizado baseado no projeto de Sakatani e Isa 19. </li></ol></li></ol> 2. A injeção de Indicador de cálcio Genética e Janela Implant A injecção de um indicador de cálcio 20 e o implante da janela craniana 21 são executadas como previamente descrito com as seguintes adições: <ol><li> Injectar o vírus na região de interesse, utilizando uma pipeta de injecção de vidro preenchido com uma solução de vírus e ligado a um sistema de injecção sob pressão. Regule a pressão em função da pipeta interna-diâmetro, tipicamente ca. 70-140 mbar, para injectar cerca de 100 nl de uma solução de vírus ao longo de 1-2 min. Pulsos de injeção de baixo volume entregue em baixa frequência (0,05 pulsos seg a 2 Hz) deve ser usado para evitar transbordamento do vírus ao longo da pipeta durante a injeção Nota:. A fim de controlar o volume de injecção, a pipeta pode ser marcada pelo pequeno , comprimentos uniformemente espaçados (por exemplo, 0,5 mm) sob um microscópio estéreo. O deslocamento do menisco entre as marcações podem, então, ser utilizado para estimar o volume injectado. </li><li> Várias semanas após a injecção o que deverá resultar num bolo de células densamente marcados com um diâmetro de aproximadamente 500 um. A eficácia da expressão GECI na região de interesse depende da escolha de GECI e combinação promotor, bem como o título infeccioso e do serotipo do AAV recombinante usado Nota:. Como um exemplo representativo, a injecção de AAV2/1-EF1α-GCaMP5 com uma teta viraler de 8 x 10 12 GC / ml para o córtex visual primário de um rato provoca a expressão satisfatória em aproximadamente duas semanas após a injecção (Figura 1). </li><li> A barra de cabeça não deve obstruir o campo visual do mouse, mas deve ser rígida o suficiente para permitir a imagem estável durante comportamento. Isso normalmente requer dois pontos de fixação em ambos os lados da barra de cabeça (ver figura 1). Para prender firmemente a barra de cabeça para o crânio, certifique-se de maximizar e secar a área do crânio exposta, onde o bar cabeça será anexado. Além disso, utilizando um bisturi ou uma seringa, riscar o crânio para criar ranhuras superficiais, aumentando assim a área da superfície de colagem. Cubra o osso com adesivo tecidual antes de colocar a barra de cabeça com cimento dental. </li></ol> 3. Procedimento Experimental <ol><li> Duas a três semanas após a injeção do vírus, verifique a janela implante craniano para maior clareza e expressão sob epiiluminação de fluorescência. Limites claramente visíveis e bem definidas de vasos sanguíneos superficiais são uma boa indicação de que o implante janela é adequado para a imagem (veja a Figura 1). </li><li> Medir e ajustar a potência do laser para um valor inferior a 50 MW na amostra. </li><li> Ligue o fluxo de ar para a esteira esférica. </li><li> Para a fixação da cabeça sob o microscópio, anestesiar brevemente o animal com isoflurano para reduzir o stress. Colocar o animal em um recipiente anestesia isoflurano e esperar até parar de animais em movimento (aproximadamente 10 segundos). Retire o animal e imediatamente cabeça corrigi-lo sob o microscópio. </li><li> Posicionar o sistema de exibição visual tão próximo quanto possível para que o animal ainda permitir o acesso ao animal. O contacto inferior visuais o animal tem com o experimentador, a menos salientou o animal será durante a fase inicial da experiência. </li><li> Certifique-se a janela de implante craniano é livre de poeira e sujeira. Limpe com águase necessário. </li><li> Aplique o gel de ultra-som claro como o meio de imersão entre a janela craniana e objetiva de imersão em água. Isto resolve problemas de degradação da imagem lenta, devido à evaporação de água ou vazamento e alivia a necessidade de montar um cone na barra de cabeça para reter a água Nota:. Centrífuga o gel antes do uso para remover todas as bolhas de ar, e tomar cuidado para não criar qualquer ar bolhas durante a aplicação do gel. As bolhas de ar podem prejudicar seriamente a qualidade de imagem. </li><li> Enrole um pedaço de fita preta em torno do bar objetiva e cabeça para proteção contra luz. </li><li> Mova a arena ambiente virtual para a sua posição final e ajustar a câmera de vídeo para monitoramento dos alunos. </li><li> Definir o redutor de laser para coincidir com a amplitude de varredura utilizado durante o experimento. </li><li> Iniciar a gravação de dados. </li></ol>

<ol>
	<li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Miniature+Head-Mounted+Two-Photon+MicroscopeHigh-Resolution+Brain+Imaging+in+Freely+Moving+Animals.">A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals.</a> Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).</li><li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake,+mobile+mice.">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56, 43-57 (2007).</li><li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation.">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nat. Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li><li>Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice-specific+sequences+in+parietal+cortex+during+a+virtual-navigation+decision+task.">Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task.</a> Nature. 484 (7395), 62-68 (2012).</li><li>Huber, D., Gutnisky, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+dynamic+representations+in+the+motor+cortex+during+sensorimotor+learning.">Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning.</a> Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).</li><li>Keller, G. B., Bonhoeffer, T., H&#252;bener, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+mismatch+signals+in+primary+visual+cortex+of+the+behaving+mouse.">Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse.</a> Neuron. 74 (5), 809-815 (2012).</li><li>Akerboom, J., Chen, T. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging.">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> J. Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Zhao, Y., Araki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca2++indicators.">An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators.</a> Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).</li><li>Mittmann, W., Wallace, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo.">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nat. Neurosci. 14 (8), 1089-1893 (2011).</li><li>Katona, G., Szalay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+two-photon+in+vivo+imaging+with+three-dimensional+random-access+scanning+in+large+tissue+volumes.">Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes.</a> Nat. Methods. 9 (2), 201-208 (2012).</li><li>Mank, M., Santos, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging.">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nat. Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li><li>Margolis, D. J., L&#252;tcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+cortical+population+activity+imaged+throughout+long-term+sensory+deprivation.">Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation.</a> Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).</li><li>Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo.">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).</li><li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation.">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li><li>H&#246;lscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rats+are+able+to+navigate+in+virtual+environments.">Rats are able to navigate in virtual environments.</a> J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).</li><li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRT+letter:+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching).">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching).</a> Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).</li><li>Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+Reality+for+Mice,+mousevr.blogspot.com.">Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com.</a> Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).</li><li>Sakatani, T., Isa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+spontaneous+saccade-like+rapid+eye+movements+in+C57BL/6+mice.">Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice.</a> Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).</li><li>Golshani, P., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+2-photon+calcium+imaging+in+layer+2/3+of+mice.">In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice.</a> J. Vis. Exp. (13), (2008).</li><li>Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Schmidt-Hieber, C., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+spatial+navigation+in+the+medial+entorhinal+cortex.">Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex.</a> Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A chave para o sucesso do comportamento de imagem de dois fotões é a estabilidade da preparação de duas maneiras: <ol><li> No decurso da implantação janela dias pós, as respostas inflamatórias do tecido pode conduzir a uma melhoria da formação de tecido de granulação e cartilagem que vai dificultar, ou mesmo impedir imagiologia. </li><li> Durante o experimento, o cérebro tem que ser suficientemente estável para evitar artefatos de movimento a partir de corromper sinal de fluorescência atividade relaci...

Dois fótons de imagem de cálcio (indicadores geneticamente codificados como GCaMP5 7 ou R-GECO 8 ou corantes sintéticos como OGB ou Fluo4) emergiu como um poderoso método de medir a atividade neuronal em ratos comportando 1-6. Ele permite a medição simultânea da actividade de centenas de células de acção quase único potencial resolução, até cerca de 800 um abaixo da superfície do cérebro 9,10. Além disso, por meio de indicadores de cálcio geneticamente codificados (Gecis) atividade neuronal pode ser medido cronicamente 5,11,12, e em tipos de células geneticamente definidas 13. Juntos, estes métodos proporcionam um grau de resolução temporal e espacial, que abre um grande número de novas possibilidades para o estudo de computação neuronal in vivo. A intervenção cirúrgica é necessária para expor e rotular o cérebro do rato para a imagem latente. As células são tipicamente transfectados utilizando um recombinante vir adeno-associado<html> nos sistema (AAV) para entrega GECI e uma janela craniana é implantado no local da injecção para ter acesso óptico ao cérebro. Uma barra de cabeça é então ligado ao crânio para fixação da cabeça sob o microscópio de dois fotões. A concepção e implementação dessas medidas é fundamental, como a maioria dos problemas com a imagem acordado surgem de instabilidades na preparação. Idealmente o procedimento descrito aqui deve permitir a imagem crônica de até vários meses após a cirurgia. Para ativar o comportamento visualmente guiado durante dois fótons de imagem, o rato fixo cabeça fica em um ar apoiado esteira esférica, que ele pode usar para navegar em um ambiente de realidade virtual. Locomotion do mouse sobre a esteira é acoplado ao movimento no ambiente virtual que é exibido em uma tela toroidal em torno do 14,15 mouse. Variáveis ​​comportamentais, tais como locomoção, estímulo visual, e posição da pupila podem ser gravadas 6. t &quot;&gt; Nós descrevemos os procedimentos envolvidos em dois fótons de imagem crônica em camundongos explorando um ambiente de realidade virtual Os principais pontos abordados são:. redução de artefatos de movimento, a redução do vazamento de luz, a maximização do número de células gravadas simultaneamente, e minimização de danos foto. Nós também fornecemos detalhes sobre como configurar a esteira apoiada pelo ar, controle de aluno eo ambiente de realidade virtual. Os procedimentos descritos aqui pode ser usado para geração de imagens de populações de células marcadas com fluorescência em camundongos fixos na cabeça em um potencialmente grande variedade de paradigmas comportamentais .

<table><tbody><tr><td>Cover slips (diameter = 3-5 mm)</td><td>Menzel</td><td></td><td>window implant</td></tr><tr><td>InSight DeepSee laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td>microscope</td></tr><tr><td>12 kHz Resonance scanner</td><td>Cambridge Technology</td><td>G1-003-30026</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Galvometer</td><td>Cambridge Technology</td><td>G6215H</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>National Instruments</td><td>NI 5772</td><td>microscope</td></tr><tr><td>FPGA</td><td>National Instruments</td><td>PXIe 7965R</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Acquisition card</td><td>National Instruments</td><td>PCIe 6363</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Emission filter 525/50</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Piezo-electric z-drive</td><td>Physikinstrumente</td><td>P-726.1CD</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Controller for Piezo-electric drive</td><td>Physikinstrumente</td><td>E665 LVPZT</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Objective 16X, 0.8NA</td><td>Nikon</td><td>CFI75</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Current amplifier</td><td>Femto</td><td>DHPCA-100</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Photomultiplier tube</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td>microscope</td></tr><tr><td>USB Camera without IR filter</td><td>ImagingSource</td><td>DMK22BUC03</td><td>pupil tracking</td></tr><tr><td>Objective 50 mm</td><td>ImagingSource</td><td>M5018-MP</td><td>pupil tracking</td></tr><tr><td>Macro adapter rings</td><td>ImagingSource</td><td>LAexSet</td><td>pupil tracking</td></tr><tr><td>Optical computer mouse</td><td>Logitech</td><td>G500</td><td>motion tracking</td></tr><tr><td>Styrofoam ball 20 cm</td><td>e.g. idee-shop.de</td><td>08797.00.15</td><td>virtual environment</td></tr><tr><td>LED projector</td><td>Samsung</td><td>SP-F10M</td><td>virtual environment</td></tr><tr><td>Acquisition card</td><td>National Instruments</td><td>NI 6009</td><td>virtual environment</td></tr><tr><td>Panda3D game engine</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.panda3d.org/&quot;&gt;www.panda3d.org&lt;/a&gt;</td><td>virtual environment</td></tr><tr><td>Numpy library for Python</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.scipy.org/&quot;&gt;www.scipy.org&lt;/a&gt;</td><td>virtual environment</td></tr><tr><td>Scipy library for Python</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.scipy.org/&quot;&gt;www.scipy.org&lt;/a&gt;</td><td>virtual environment</td></tr><tr><td>NI-DAQmx driver</td><td>National Instruments</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ni.com/&quot;&gt;www.ni.com&lt;/a&gt;</td><td>virtual environment</td></tr><tr><td>Ultrasound gel</td><td>Dahlhausen</td><td>5701.0342.10</td><td>imaging</td></tr></tbody></table>

two-photon calcium imaging in mice navigating a virtual reality environment

Nos últimos anos, dois fótons de imagem tornou-se uma ferramenta valiosa na neurociência, uma vez que permite a medição crônica da atividade de células geneticamente identificados durante comportamento 1-6. Aqui nós descrevemos métodos para realizar imagem de dois fótons em rato córtex enquanto o animal navega um ambiente de realidade virtual. Nós nos concentramos nos aspectos dos procedimentos experimentais, que são fundamentais para a imagem em um animal se comportar em um ambiente virtual iluminado. Os principais problemas que surgem nesta configuração experimental que nós aqui endereço são: minimizar artefatos de movimento do cérebro relacionada, minimizando luz vazamento do sistema de projeção de realidade virtual, e minimizando o dano tecidual induzida por laser. Nós também fornecemos software de amostra para controlar o ambiente de realidade virtual e fazer o acompanhamento dos alunos. Com estes processos e os recursos que deveria ser possível converter um microscópio de dois fotões convencional para uso em comportando ratinhos.

A qualidade da imagem em dois fotões imagiologia de cálcio de populações de células marcadas com um GECI depende em grande parte a qualidade da janela craniana do implante. Duas semanas após a injeção do vírus da janela craniana devem ser inspecionados para maior clareza. Não deve haver nenhum tecido de granulação ou crescimento do osso visível (Figura 1A). Além disso, o padrão de vasos sanguíneos superficiais deverão permanecer inalterados e limites da vasculatura deve ser bem definida...

Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment at JoVE.com

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

Aqui nós descrevemos os procedimentos experimentais envolvidos em dois fótons de imagem de rato córtex durante o comportamento em um ambiente de realidade virtual.

Dois fótons de imagem de cálcio em camundongos Navegando um ambiente da realidade virtual

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

two-photon-calcium-imaging-mice-navigating-virtual-reality

Research

JoVE Journal

Behavior

30.9K visualizações.  Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research.  Aqui nós descrevemos os procedimentos experimentais envolvidos em dois fótons de imagem de rato córtex durante o comportamento em um ambiente de realidade virtual. 

Vídeo: Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

Vivo em 2-Photon Imagens de cálcio na camada 2 / 3 dos Ratos

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Biologia

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical neurons with two-photon microscopy has provided unique insights into cortical structure, function and plasticity. However, these studies are limited to head fixed animals, greatly reducing the behavioral complexity available for study. In this paper, we describe a procedure for performing chronic fluorescence microscopy with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely behaving mice. We used an integrated miniaturized fluorescence microscope paired with an implanted prism probe to simultaneously visualize and record the calcium dynamics of hundreds of neurons across multiple layers of the somatosensory cortex as the mouse engaged in a novel object exploration task, over several days. This technique can be adapted to other brain regions in different animal species for other behavioral paradigms.

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Here, we present a procedure for performing large-scale Ca2+ imaging with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely moving mice. Hundreds of active cells can be observed simultaneously using a miniature, head-mounted microscope coupled with an implanted prism probe.

Multi-layer Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging em ratos com movimento livre com sondas de prisma e microscopia de fluorescência miniaturizada

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

Comportamento

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Neurociência

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultânea de dois fótons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrosplï¿½ico

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Imagem de cálcio em rato de azeitona inferior

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their activity in vivo in behaving mice. This paper describes a method for the implantation of a chronic cranial window to allow for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice. In combination with genetic strategies and viral injections, it is possible to label specific cells and regions of interest with structural or physiological markers. This protocol demonstrates how to combine viral injections to label neurons in the vicinity of GCaMP6-expressing astrocytes in the cortex for simultaneous imaging of both cells through a cranial window. Multiphoton imaging of the same cells can be performed for days, weeks, or months in awake, behaving animals. This approach provides researchers with a method for viewing cellular dynamics in real time and can be applied to answer a number of questions in neuroscience.

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Presented here is a protocol for the implantation of a chronic cranial window for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice.

Implantação de uma janela craniana para imagem repetida em vivo em ratos acordados

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

Imagem Simultânea da Dinâmica Microglial e Atividade Neuronal em Camundongos Acordados

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the other hand, two-photon imaging can resolve the activity of local neural circuits at the single-cell level. It is critical to make a large cranial window to perform multiple-scale analysis using both imaging techniques in the same mouse. To achieve this, one must remove a large section of the skull and cover the exposed cortical surface with transparent materials. Previously, glass skulls and polymer-based cranial windows have been developed for this purpose, but these materials are not easily fabricated. The present protocol describes a simple method for making a large cranial window consisting of commercially available polyvinylidene chloride (PVDC) wrapping film, a transparent silicone plug, and a cover glass. For imaging the dorsal surface of an entire hemisphere, the window size was approximately 6 x 3 mm2. Severe brain vibrations were not observed regardless of such a large window. Importantly, the condition of the brain surface did not deteriorate for more than one month. Wide-field imaging of a mouse expressing a genetically-encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6f, specifically in astrocytes, revealed synchronized responses in a few millimeters. Two-photon imaging of the same mouse showed prominent calcium responses in individual astrocytes over several seconds. Furthermore, a thin layer of an adeno-associated virus was applied to the PVDC film and successfully expressed GECI in cortical neurons over the cranial window. This technique is reliable and cost-effective for making a large cranial window and facilitates the investigation of the neural and glial dynamics and their interactions during behavior at the macroscopic and microscopic levels.

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

The present protocol describes making a large (6 x 3 mm2) cranial window using food wrap, transparent silicone, and cover glass. This cranial window allows in vivo wide-field and two-photon calcium imaging experiments in the same mouse.

In vivo Imagem de cálcio de campo amplo e de dois fótons de um rato usando uma grande janela craniana

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

An Open-Source Virtual Reality System for the Measurement of Spatial Learning in Head-Restrained Mice

Head-restrained behavioral experiments in mice allow neuroscientists to observe neural circuit activity with high-resolution electrophysiological and optical imaging tools while delivering precise sensory stimuli to a behaving animal. Recently, human and rodent studies using virtual reality (VR) environments have shown VR to be an important tool for uncovering the neural mechanisms underlying spatial learning in the hippocampus and cortex, due to the extremely precise control over parameters such as spatial and contextual cues. Setting up virtual environments for rodent spatial behaviors can, however, be costly and require an extensive background in engineering and computer programming. Here, we present a simple yet powerful system based upon inexpensive, modular, open-source hardware and software that enables researchers to study spatial learning in head-restrained mice using a VR environment. This system uses coupled microcontrollers to measure locomotion and deliver behavioral stimuli while head-restrained mice run on a wheel in concert with a virtual linear track environment rendered by a graphical software package running on a single-board computer. The emphasis on distributed processing allows researchers to design flexible, modular systems to elicit and measure complex spatial behaviors in mice in order to determine the connection between neural circuit activity and spatial learning in the mammalian brain.

Here, we present a simplified open-source hardware and software setup for investigating mouse spatial learning using virtual reality (VR). This system displays a virtual linear track to a head-restrained mouse running on a wheel by utilizing a network of microcontrollers and a single-board computer running an easy-to-use Python graphical software package.

Um Sistema de Realidade Virtual de Código Aberto para a Medição da Aprendizagem Espacial em Camundongos Contidos na Cabeça

Head-restrained behavioral experiments in mice allow neuroscientists to observe neural circuit activity with high-resolution electrophysiological and ...

Imagem de cálcio de dois fótons e campo amplo no colículo superior

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

Autor em destaque: Revelando a codificação neural e os mecanismos de processamento visual no colículo superior 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

Dois fótons de imagem de cálcio em camundongos Navegando um ambiente da realidade virtual

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo