FILM-FRET é uma técnica poderosa que torna possível confirmar interações proteína-proteína suspeitas ou previstas. Neste protocolo, apresentamos uma forma de analisar dados em casos particulares de doadores desequilibrados e quantidades de aceitação. O FILM-FRET é capaz de fornecer informações sobre as interações proteína-proteína diretamente em células vivas.
É importante investigar interações proteicas pessoais no ambiente celular nativo, em particular quando a proteína fluorescente é expressa no nível endógeno. Comece cultivando bactérias auxiliares de P.aeruginosa, E.coli TOP10 e E.coli cada em cinco mililitros de LB sem antibiótico a 30 graus Celsius enquanto treme durante a noite. No dia seguinte, meça a densidade óptica das culturas e misture uma quantidade igual de P.aeruginosa, E.coli TOP10 e E.coli em um microtubo de 1,5 mililitro.
Centrifugar o tubo por cinco minutos a 9, 300 vezes G para pelotar as bactérias, em seguida, descartar o supernascer e resuspend a pelota em 50 microliters de LB. Emplaque uma mancha da mistura no ágar LB pré-aquecido e incuba-o por cinco horas a 37 graus Celsius. Após a incubação, raspe o local com um laço de inoculação estéril e resuspenque-o em um mililitro de LB. Placa 100 microliters desta suspensão bacteriana em ágar LB contendo 10 microgramas por niótrofe cloramfenicol e 30 microgramas por mililitro gentamicina e incubar dois dias a 37 graus Celsius para eliminar as bactérias E.coli TOP10 e E.coli helper. Resuspend uma colônia em um mililitro de LB e incuba-lo a 37 graus Celsius com agitação orbital por quatro horas, em seguida, centrifugar o tubo por três minutos a 9.300 vezes G e descartar 950 microliters de supernante.
Resuspenda a pelota em 50 microliters de LB e isolar a mistura em ágar LB contendo sacarose e sem cloreto de sódio. Incubar a placa durante a noite a 30 graus Celsius. Localmente colônias isoladas em ágar LB e ágar LB contendo 15 miligramas por mililitro gentamicina, a fim de verificar a sensibilidade da gentamicina.
Coloque um deslizamento de vidro microscópio sobre uma superfície horizontal plana e organize dois slides de vidro cobertos com duas camadas de fita adesiva ao seu redor. Pipeta uma gotícula de 70 microliter de 1%derretido surgiu no slide de vidro e colocar um quarto slide em cima para achatar a gotícula de agarose. Pressione suavemente por cerca de um minuto.
Retire o slide superior e solte cerca de três microliters de bactérias em três a quatro pontos em diferentes locais na almofada de agarose. Cubra a almofada de agarose com uma mancha de vidro de microscopia e fixe-a com parafina derretida para selá-la no escorregador de vidro começando pelos quatro cantos. Coloque o slide de microscopia no palco com o deslizamento de tampa voltado para o objetivo.
Gire a torre do cubo do filtro para selecionar o cubo eGFP e abra o obturador da lâmpada de fluorescência e envie a luz de fluorescência em direção à ocular do microscópio. Concentre o objetivo nas bactérias usando o botão do microscópio. Selecione uma região de interesse na amostra usando o joystick que controla o estágio motorizado.
Envie o caminho de emissão de fluorescência de volta para o detector, em seguida, volte a torre do cubo do filtro para selecionar o cubo dicâmico para o laser de 930 nanômetros e definir a potência laser para 20 miliwatts. Defina o tamanho da região de interesse para 30 micrômetros que ajusta a tensão que opera os espelhos galvo e define a faixa de seus movimentos. Ligue o detector e comece a digitalizar a amostra.
Escolha o campo de visão para imagens movendo finamente o estágio da interface do computador. Isso pode ser feito na configuração movendo a cruz na imagem no software de controle de microscópio que definirá o novo centro da imagem e pressionará o estágio de movimento. Um bom campo de visão para aquisição deve conter de 10 a 30 bactérias imóveis, todas em foco.
Se estiver interessado em extrair dados de film-FRET de células únicas, certifique-se de que as bactérias estejam bem individualizadas. Abra o software de imagem e verifique se a taxa de contagem de fótons não é muito alta para evitar um efeito de acúmulo que pode influenciar as medições ao longo da vida. Se necessário, diminua a intensidade do laser para manter a taxa de contagem de fótons baixa.
Ajuste os parâmetros de aquisição, incluindo o tempo de coleta de aquisição. Pressione o botão de partida e aguarde a conclusão da aquisição. Para analisar os dados, abra o RStudio e crie um novo projeto.
Crie uma nova pasta na pasta principal do projeto e nomeie-a para dados e, em seguida, mova todas as análises para esta pasta. Abra um novo arquivo de script ou o script suplementar flim_analysis.r. Instale o pacote FlimDiagRam dedicado para análise de dados de filme e ligue para o pacote no espaço de trabalho.
Funções de distribuição cumulativa empíricas das vidas de fluorescência medidas para as diferentes cepas bacterianas são mostradas aqui. Se o FRET ocorrer, as funções ão deslocadas para as vidas mais curtas. É importante notar que o FRET não pode ocorrer quando a interação das duas proteínas resulta em uma longa distância entre os dois fluroforos, o que não pode ser distinguido da ausência de interação.
Portanto, pode ser necessário rotular as proteínas em diferentes posições para maximizar as chances de sondar a interação. Devido à grande diferença nas expressões proteicas entre PvdA e PvdL, o mesmo complexo não resulta em dados semelhantes film-FRET. Estequiometrias desequilibradas levam a diferenças na contribuição do livre em comparação com as proteínas vinculadas rotuladas por doadores na distribuição de vida da fluorescência registrada.
O enredo do diagrama pode ser usado para fornecer informações críticas sobre a estequiometria. No mutante PvdA-eGFP mCherry-PvdL, a quantidade de PvdA rotulado por doadores é muito maior do que a quantidade de mCherry-PvdL. Entre todos os doadores presentes na amostra, apenas alguns deles estão interagindo com o PvdL.
O único valor tau um centrado em aproximadamente 2,3 nanossegundos sugere que cada doador PvdA-eGFP só pode ser transferido com um aceitador mCherry-PvdL. Quando a rotulagem é invertida, espera-se que a maioria das proteínas eGFP-PvdL interajam com PvdA-mCherry, o que é confirmado pelos valores alfa um mais altos. Os valores tau um tornaram-se mais distribuídos sugerindo que múltiplas proteínas PvdA podem se ligar a uma única proteína PvdL.
A configuração FLIM está se tornando disponível em um número crescente de instalações de imagem. Amostras de imagem em um FILM-FRET não são mais complicadas do que a imagem em microscopia de vídeo.
