Este protocolo é significativo para criar e determinar mutações desejadas no genoma de Pseudomonas aeruginosa, bem como o teste do efeito de mutações na redução da virulência em um modelo de rato reprodutível. A principal vantagem desta técnica é uma validação cromada e uma reprodutibilidade do modelo de infecção por camundongos. As bactérias estão constantemente funcionando, mudando continuamente.
Para retardar esse processo, usamos paradas congeladas, as ensacámo, penduramos em vários degraus em modificação antes de testá-los no modelo do mouse. Alguém que não esteja familiarizado com esses métodos provavelmente lutará com o desenvolvimento e seleção de possíveis recombinantes crossover para testar. Além disso, o manuseio dos camundongos para infecção será difícil para alguém que não esteja familiarizado com o trabalho animal.
Este método pode ser aplicado para testar outros patógenos e seus mutantes, bem como virulência infectar em camundongos. Em comparação com os modelos atuais, procedimentos com reprodutibilidade mais validação de clones antes e depois da infecção podem beneficiar outros pesquisadores no campo. A demonstração visual deste protocolo fornece insights para procedimentos extensivos que podem ser difíceis de entender ou compreender apenas através da leitura.
Comece por um crossover único, colônias recombinantes em Pseudomonas Isolation Broth, ou PIB. Inoculado e raia 10 microliters de cada cultura em placas PIA pré-aquecidas, complementados com 10% de sacarose. Em seguida, incubar as placas durante a noite a 37 graus Celsius.
No dia seguinte, retire as placas da incubadora e inspecione-as para crescimento. A colônia resistente à sacarose deve ser recombinantes de crossover duplo. Use palitos estéreis para remendar pelo menos 20 colônias em placas pré-aquecidas de PIA, PIA complementada com 10% de sacarose e PIA complementada com carbenicilina.
Incubar as placas durante a noite e examiná-las para crescer no dia seguinte. Os verdadeiros recombinadores de crossover duplo serão sensíveis à carbenicilina e resistentes à sacarose. Tela de 10 a 20 colônias para exclusão, usando a COLÔNIA PCR.
Pegue o crescimento de um suposto recombinante duplo crossover com um palito estéril e suspenda-o em 50 microliters de PBS. Ferva a suspensão a 100 graus Celsius por 10 minutos. Centrifuá-lo por três minutos a 13.000 vezes G e colocá-lo no gelo.
Em seguida, execute pcr de acordo com as instruções do manuscrito. Uma vez terminado o PCR, realize a eletroforese de gel agarose nos produtos. Produtos de amplificação menores indicam colônias em que a região de interesse foi suprimida.
Na manhã das injeções, descongele os criovias de células bacterianas a quatro graus Celsius por três a quatro horas. Mantenha os frascos no gelo após o descongelamento e injete os ratos dentro de duas horas. Transfira o conteúdo de cada criovial para um novo tubo de dois mililitros e centrifuá-lo a 4.500 vezes G por 10 minutos.
Descarte o supernatante e suspenda a pelota celular em um mililitro de PBS. Repita a centrifugação e suspenda as células na PBS para uma concentração final de 2,5 vezes 10 para a nona colônia formando unidades por mililitro. Pegue três amostras da suspensão final de cada cepa para validar concentração, genótipo e fenótipo.
Para cada cepa, alíquota de 1,5 mililitros da suspensão celular em um tubo de dois mililitros e prepare o PBS para injeções de controle. Reúna os camundongos e materiais necessários para injeções em uma sala cirúrgica de animais estéreis e limpe todas as superfícies com lenços higienizados antes de começar. Use dois pares de luvas de látex para limitar o risco de perfuração, se mordido, bem como um jaleco, óculos de segurança e máscara facial.
Remova o mouse da gaiola e pese-o, marcando a cauda com marcador permanente para rastreamento pós-injeção. Abra uma nova seringa de um mililitro com uma agulha calibre 27 e elasenhe 200 microliters de PBS estéreis. Pegue o rato atrás das orelhas, usando o polegar e o dedo indicador, e belisque para criar uma dobra de pele na nuca.
Em seguida, fixar a cauda na palma da mão usando o mindinho para segurar o rato plano e imóvel. Insira a agulha em um ângulo de 30 graus na cavidade peritoneal à esquerda ou à direita da linha média. Levante ligeiramente a agulha para garantir que ela não foi inserida em órgãos.
Em seguida, injete lentamente o PBS e retire a agulha. Um bolus no local da injeção é típico. Coloque a agulha no recipiente de disposição de afiadas designada e mova o mouse para uma gaiola separada.
Repita o procedimento com o próximo mouse e depois que todos os ratos de uma gaiola forem injetados, mova-os de volta para sua gaiola original. Depois de injetar o grupo de controle, injete os grupos de teste usando o mesmo procedimento. Quando todas as injeções estiverem completas, devolva os ratos para a sala de alojamento e limpe a área de trabalho com lenços higienizantes.
Para fotografar os animais, prepare o sistema de imagem definindo os parâmetros da câmera e aquecendo o palco. Defina o fluxo de oxigênio para 1,5 litros por minuto e isoflurano para 3,5% e mova o rato para a câmara anestésico, em seguida, para o estágio estabilizado da temperatura, após a anestesia. Posicione o mouse nas costas com os braços estendidos e encaixe um cone de nariz para administração de 2,5% de isoflurane durante a imagem.
Feche a porta e tire imagens bioluminescentes e raios-x do rato. Quando a imagem estiver completa, devolva o mouse à sua gaiola e monitore-o. Deve recuperar a consciência dentro de três a cinco minutos.
As exclusões genômicas direcionadas foram confirmadas pela COLÔNIA PCR com primers específicos que amplificaram a região de interesse. Colônias com a exclusão genômica produzem uma banda PCR mais curta em comparação com colônias do tipo selvagem. A injeção intraperitoneal da cepa atenuada de P aeruginosa, PGN cinco, resultou em 0% de mortalidade, equivalente à mortalidade observada com E.coli BL 21.
A injeção da cepa dos pais, no entanto, foi fatal para 80% dos camundongos. A progressão da infecção foi acompanhada por meio de cepas marcadas por bioluminescência e cepas atenuadas. A cepa atenuada permaneceu localizada no local da injeção até que a bioluminescência desapareceu, o que provavelmente coincidiu com a liberação da infecção.
O método apresentado apenas examinou a mortalidade produzida pela cepa. Aspectos imunológicos e toxicológicos mais profundos poderiam ser utilizados para determinar a dinâmica da infecção e o efeito final que a infecção tem que não resulta em morte. O mais importante no procedimento é a ampla validação feita, entre várias etapas desde a identificação inicial até o teste em animais.
Perder certas etapas de validação pode potencialmente levar a um resultado errado, já que as cepas testadas podem sofrer mutação e seleção, ou se contaminar. Com o desenvolvimento dessas duas técnicas, acreditamos que isso permitirá que nossos pesquisadores no campo da imunologia da infecção investiguem de forma mais eficaz o quão poderosa a interação do pacote leva ao fenótipo extremo, sepse e mortalidade. O impacto de diferentes nutrientes nas variantes pode ser comparado através da dosagem de tamanho de bactérias.
