Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de USDA para Agricultura e Alimentação, da Agricultura e da Iniciativa de Investigação Alimentar concessão 2010-65108 - 20582 para KMJ Agradecemos Brian K. Washburn para a revisão crítica do manuscrito.

Realizando os passos 1, 2, 4, 6 e numa câmara de fluxo laminar estéril, é recomendado. 1. Preparação de M. truncatula A17 Mudas Nota: M. truncatula A17 sementes utilizadas nestes estudos são produzidos sob condições de estufa refrigerado a ~ 22 ° C, ou em uma sala de crescimento das plantas mantidas a 22-26 ° C com ~ 150-400 mmol / m -2 s -1 luz. <ol><li> Preparar placas de germinação de sementes: use 100 milímetros placas quadradas (15 mm de profundidade) e despeje autoclavado 1,1-1,2% w / v purificado agar 10 a uma profundidade de 3-5 mm. Cada placa será usado para germinar ~ 0,25-0,5 g de semente (equivalente a 63-125 sementes / placa). Nota: É fundamental usar células-testado cultura, agar purificado da planta para todas as placas descritos neste protocolo. O vendedor e informações de número de catálogo para o agar é listada na Tabela de Reagentes e Equipamentos específicos. </li><li> Escarificar / esterilizar o M. truncatula A17 sementes: Pesar sementes suficientes para o número desejado de mudas. (M. truncatula A17 sementes são ~ 4 mg cada) colocar sementes estéreis em frascos de 125 ml com tampas de folha estéreis (0,25-0,5 g de semente / balão, o que é ~ 63-125 sementes) e pipeta de 20 ml de concentrado (96%) H 2 SO 4 ao longo das paredes do balão. Nota: escarificação ácida vai esterilizar as sementes. Além disso, por pipetagem do ácido ao longo das paredes do balão, será re-esterilizar o interior do frasco, que tenha entrado em contacto com as sementes não esterilizados. </li><li> Quebra-se aglomerados de semente com uma pipeta de vidro esterilizado. Agitar cada frasco com frequência para 10-12 min. Pequenos, poços castanhos se tornará visível nas sementes. Estes são pequenos furos na casca da semente 11. Nota: Use proteção para os olhos e luvas ao trabalhar com H 2 SO 4 concentrado. </li><li> Retirar H 2 SO 4 e lavar as sementes: Quando, pelo menos, 10% das sementes têm pequenas covas castanhos, ou 12 min passaram, consoantevem em primeiro lugar, remover todo o ácido dos frascos com uma pipeta de vidro esterilizado. (Resíduos ácidos lugar para uma proveta de 1-2 L contendo, pelo menos, 300 ml de água da torneira. Isto irá diluir o ácido e evitar o sobreaquecimento.) Inclinação do balão para recolher o ácido que permanece na curva do balão e usar uma pequena pipeta de vidro para remover todo o ácido restante. Se o ácido residual permanece, ele vai reagir com a água de enxágüe, aqueça as sementes e matá-los. <ol><li> Lavar sementes vertendo rapidamente 100 ml de água ultrapura esterilizada em cada frasco. O volume em excesso de água irá diluir o ácido e evitar o sobreaquecimento e os danos sementes durante a reacção do ácido com a água. Deitar fora a água e chama-esterilizar o lábio da garrafa. </li><li> Lave as sementes 8-10x com 50 ml de água ultrapura estéril. Agitar o frasco durante cada enxaguamento. O frasco deve ser considerado estéril neste ponto e o lábio do balão deve ser inflamado antes de cada lavagem. </li></ol></li><li> Deixe as sementes absorvem durante a noite: Após oúltimo enxágüe, coloque 50 ml de água ultrapura estéril em cada frasco, recoloque a tampa da folha estéril em cada frasco e colocar a 4 ° C no escuro durante a noite. </li><li> Coloque as sementes na placa germinação: Após sementes deixando absorver durante a noite, despeje a água, lavar 2x com ~ 25 ml de água ultrapura, em seguida, adicione 20 ml de água ultrapura estéril, redemoinho para voltar a suspender as sementes e despeje-os em um prato germinação agar 1,1-1,2% de passo 1.1. Se as sementes permanecem no frasco, adicione mais água e despeje novamente. Distribua as sementes de cada frasco para uma placa (63-125 sementes / placa). <ol><li> Agitar a placa para distribuir as sementes. As sementes devem ser distribuídas uniformemente em uma banda de 4-5 cm de uma das extremidades da placa. Este será o &quot;top&quot; da placa. O &quot;fundo&quot; 5-6 cm deve ser mantida livre de sementes (Figura 2A). </li><li> Empate fora da água com uma pipeta estéril. Inclinar a placa a um ângulo de 45 ° para permitir o escoamento de água remanescente para a parte inferior da placa. Colocar a tampa sobre o tilplaca ted e proteger da luz. As placas devem ser autorizados a drenar 10-20 min. (Figura 2B). </li></ol></li><li> Configure germinação: Retire toda a água que se acumulam na parte inferior da placa inclinada com uma pipeta estéril. <ol><li> Recoloque a tampa e selar a placa com parafilme. Usar luvas e manter estéril (Figura 2C). </li><li> Empilhe as placas de germinação e ligue todos eles em um ângulo de 90 °. As sementes serão deitado sobre a superfície vertical do ágar. Totalmente sementes embebidas deve facilmente aderir ao ágar. As raízes irão crescer para baixo (Figura 2D). </li><li> Enrole a pilha de placas de germinação em folha para bloquear a luz e manter a 25 ° C durante 3 dias. </li></ol></li></ol> Nota: Se germinação rendimentos para menos de 3 dias, as raízes podem ser demasiado curto para alcançar o agar em microcosmos. Se germinação procede mais de 4 dias antes da transferência para placas microcosmo, a sobrevivência das mudas iráser pobre. Se M. ecótipos truncatula ou mutantes com taxas de germinação mais lentas devem ser comparados, o ecótipo lentamente-germinando devem ser autorizados a germinar mais de 3 dias. 2. Preparação de Microcosmos Placa individuais <ol><li> Prepare médio 12 (ver Tabela 1 para a composição), permitindo ~ 70 mL de meio de Jensen para cada microcosmos. Prepare em jarros ou frascos que são convenientes para o rápido vazamento (não mais do que 1-2 L por jarra) e deixar uma barra de agitação magnética no jarro durante a autoclavagem. <ol><li> Depois de meio esfriou para ~ 55-65 ° C, foram adicionados suplementos, e pH foi verificado (ver Tabela 1), despeje em rodada 100 mm de diâmetro, 15 milímetros pratos fundos. As placas devem ser derramado ~ 0,9-1 cm de profundidade (~ 70 ml / placa). </li><li> Componentes do meio de Jensen pode formar-se um precipitado turvo, de modo que é importante para retornar o jarro para a placa de agitação magnética periodicamente para evitar que os componentes se depositem. Os precipitados podem ser vistível na chapa após a sua solidificação, e não afecta o desempenho, enquanto eles estão distribuídos uniformemente entre as placas. </li><li> Empilhar as placas durante o vazamento para evitar a formação de condensação sobre as tampas da placa. </li></ol></li><li> Depois placas de Jensen ter solidificado, entalhe ambas as placas e tampas com uma espátula de peso que foi dobrado em forma de U 5 (Figura 3A). Aqueça a curva da espátula com um gravador até vermelhos quentes, notch 5-6 placas e, em seguida, aquecer novamente. Quando a tampa é colocada no entalhe da chapa com entalhe, isto irá criar um portal de forma oval através da qual o ramo do plântulas vão aumentar (Figura 3B). Se as placas entalhadas serão armazenados, embrulhe individualmente com filme de parafina .. </li></ol> 3. Preparação de Sinorhizobium meliloti culturas Dois dias antes da inoculação das plantas, iniciar culturas de todos S. meliloti cepas a serem inoculados em mudas. Cultures devem ser cultivados em LBMC (Luria-Bertani [Miller]) 13 meio suplementado com 2,5 mM de MgSO4, 2,5 mM de CaCl2, e antibióticos apropriados (meio TY, também funciona bem). Tão pouco quanto 2-3 ml de cada cultura será suficiente. <ol><li> Crescer a 30 ° C com agitação durante 2 dias até que as células são densos. </li><li> Para a maioria das vacinas de planta, fase de crescimento da S. meliloti, não é crítica. Normalmente, no final de log ou de células em fase estacionária primeiros são usados. </li></ol> 4. Layout de M. truncatula Mudas em Microcosmos individuais <ol><li> Após 3 dias, abra uma placa de germinação (preparado no passo 1) e inundar imediatamente com água ultrapura estéril. Dip fórceps em etanol e brevemente chama para esterilizar. Use uma pinça estéreis para empurrar suavemente as pontas das raízes de todas as mudas sob a água para evitar o ressecamento. Raízes irão variar de 2-6 cm de comprimento. A maioria será de 3-4 cm. Selecione mudas com raízes retas e não óbviodefeitos. </li><li> Verifique as tampas dos microcosmos médio do Jensen para o acúmulo de condensação. Flick a tampa para remover a condensação ou substituí-lo por uma nova tampa entalhado. Se houver um excesso de condensação na tampa, a raiz das mudas podem aderir à tampa e depois morrem após a condensação seca. </li><li> Usando a pinça, pegue delicadamente uma muda da placa de germinação pelos cotilédones e colocar a raiz no microcosmo meio de um Jensen. Certifique-se que a ponta da raiz está em contato com o ágar. </li><li> Remova cuidadosamente o tegumento se ele ainda está presente. Os casacos de sementes deve ser solto após imersão em água por 5-10 min. Gentilmente provocar o tegumento com a pinça até dá jeito, e descarte. Os cotilédones e aproximadamente 0,5 cm de filmagens devem se projetar para fora do U-entalhe na placa (Figura 4A). Cuidadosamente substituir a tampa da placa, com a L-entalhe da tampa durante a muda, a criação de um portal para a plântula (Figura 4B).Definir placas de lado em pilhas horizontais até que todas as mudas foram colocadas em microcosmos. </li><li> Use todas as mudas de cada placa germinação que olhar viável e tem uma raiz reta. (Se possível, deixe um prato de mudas não foram abertos para usar como substitutos para mudas murchas pouco antes da inoculação.) </li><li> Depois de colocar para fora todas as mudas, que lhes permitam sentar-se no microcosmos do Jensen horizontal enquanto o S. suspensões do inóculo meliloti estão sendo preparados. </li></ol> 5. Preparação de S. meliloti inóculo Suspensões <ol><li> Verifique S. meliloti culturas periodicamente após a inoculação para ter certeza de que eles estão crescendo. Após dois dias de crescimento, o OD 600 deve situar-se entre 2 e 4. </li><li> Pipetar 0,5 ml de cada cultura para um tubo esterilizado de 1,5 mL e centrifuga-se para sedimentar. Remover o sobrenadante. </li><li> Lave as células duas vezes em qualquer 0,85% estéril água ultrapura NaCl ou estéril. Ressuspender as células em 0,5 ml de 0,85% steirritar NaCl ou água ultrapura. </li><li> Medir a OD 600 de uma diluição de ressuspenso S. 1/10 meliloti culturas a partir do passo 5.3. Com base na leitura, efectuar uma suspensão de cada cultura em água ultrapura esterilizada em OD 600 = 0,05. Se a densidade de células é muito alto, a nodulação pode ser inibida. Adicione o suficiente da suspensão diluída de modo a que 100 uL pode ser inoculadas em cada muda. A nebulosidade do OD 600 = 0,05 suspensão deve ser apenas quase imperceptível a olho nu. </li></ol> 6. Inoculação e Selagem de Microcosmos <ol><li> Imediatamente antes de inoculações começando, verifique se há mudas murchas que não sobreviveram a transferência para microcosmos médio do Jensen. Substitua essas mudas com mudas frescas de placas de germinação. </li><li> Abra cada microcosmo e inocular 100 mL da S. apropriado meliloti suspensão na raiz de mudas. Recoloque a tampa e reserve em stac horizontalks de 6-10 microcosmos. Para cada S. tensão meliloti a ser comparado, inocular pelo menos 15 plantas. Para as estirpes que têm diferenças sutis na produtividade simbiótica, inocular 30-35 plantas. Deixe pelo menos 10 plantas não inoculado como controle negativo. Inocular 30-35 plantas com S. meliloti 1021 ou outra linhagem selvagem apropriado para servir como controle positivo. </li><li> Após o S. suspensão meliloti teve tempo para adsorver sobre a superfície da raiz eo líquido suspensão tem embebido no agar (pelo menos 20 min.), envolva cada placa individualmente com filme de parafina. As placas devem ser embrulhados até à borda da fossa, mas o filme de parafina não deve bloquear o crescimento da muda (Figura 4C). </li><li> No momento do envolvimento, fazer uma verificação final para raízes aderidas ao interior da tampa da placa. Para remover raízes aderidas da tampa, colocar a placa plana no banco e tocar ou apertar a tampa para bater a raiz de volta para a agar surface. </li><li> Alinhe os portais de mudas de cada pilha de 6-10 placas. Coloque a pilha num ângulo de 90 ° com as mudas apontando para cima (Figura 4D). A viscosidade do filme parafina vai realizar as placas no lugar o tempo suficiente para envolver toda a pilha em papel alumínio, deixando uma faixa de 1-2 cm desembrulhou onde as mudas emergir (Figura 4E). A folha vai proteger as raízes da luz. </li><li> Coloque os envolvidos folha pilhas em câmara de crescimento iluminada ou sala de crescimento a 21-25 ° C, 60-70% de umidade relativa e 100-175 mmol / m -2 s -1 luz em um ciclo de 16 escuro luz hr / 8 horas ( Figura 1A). Sob estas condições de crescimento, a incubação prolongada a níveis de luz superior a 200 umol / m -2 s -1 podem ter um efeito prejudicial sobre o crescimento da planta. </li></ol> 7. O exame do sistema radicular e quantificação de simbióticas fenótipos As plantas podem ser mantidos nomicrocosmos para até 9 semanas. <ol><li> Número de nódulos pode ser quantificado em uma série de pontos de tempo por retirar a folha de cada pilha e contando nódulos. Desenvolvimento de nódulos nas plantas inoculadas com S. meliloti 1021 tipo selvagem são aparentes por 10-14 dias após a inoculação. </li><li> Produtividade simbiótica também pode ser medido em cada ponto de tempo, medindo o comprimento do rebento emergente. </li><li> Quantificação final de produtividade simbiótica é normalmente realizada em 7 semanas após a inoculação por retirar a parte aérea e medir a massa fresca da parte aérea. Esta etapa pode ser realizada mais tarde e 9 semanas, se o crescimento for mais desejado. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Há várias etapas do protocolo que são críticos para o sucesso: 1) A necessidade do uso de purificada, planta de célula de cultura testados agar não pode ser subestimada. Este não é crítica para plântulas de alfafa, mas que é crucial para o crescimento de M. truncatula A17. 2) É importante para germinar sobre placas de agar de mudas verticais como descrito no Passo 1. A técnica amplamente utilizada de germinação de mudas em uma superfície horizontal invertida em uma placa de 15 milímetros de pro...

A interação entre a planta hospedeira leguminosa Medicago truncatula A17 ea bactéria rizóbio Sinorhizobium meliloti 1021 é um dos sistemas modelo mais tratável para o estudo do desenvolvimento de nódulos de raiz e simbiose de fixação de nitrogênio. Os genomas de ambos os parceiros simbióticas foram seqüenciados 1,2 e ambos planta e bactéria são passíveis de manipulação genética 3,4. Análise dos fenótipos de ambas plantas e bactérias mutantes requer a capacidade de observar as fases de desenvolvimento de nódulos e para quantificar a produtividade simbiótica com o tempo. Aqui nós descrevemos um método para a observação do desenvolvimento de nódulos de raiz de M. truncatula cv. Jemalong A17 inoculados com S. meliloti 1021 dentro de microcosmos individuais feitas a partir de padrão, rodada 100 mm de diâmetro, 15 milímetros placas de laboratório profundas (Figura 1A). O tiro é exposta e cresce através de um portal dentada no lado da placa (Figures 1B, 1C e 1E). Raízes estão contidos dentro dos microcosmos e mantida estéril, ao mesmo tempo permitindo a observação através da tampa da placa (Figura 1D). Uma vez que o rebento é acessível, o seu crescimento não é limitado e pode ser medida em intervalos periódicos, sem comprometer a esterilidade da raiz. O método de criação de microcosmos entalhado de placa foi desenvolvida originalmente por Leigh, et ​​al. 5 para o cultivo de plantas de luzerna, mas não foi amplamente adoptada a despeito das suas muitas vantagens sobre os outros métodos. Uma variação deste método foi também desenvolvido para a análise da interacção entre as raízes das plantas e micorrizas 6. Temos agora adaptado e optimizado desse método para o crescimento de M. plantas truncatula. As vantagens deste protocolo mais mais frequentemente utilizados métodos estão descritos abaixo. Existem vários métodos que estão atualmente em uso largo para estudos nodulação de M. truncatula inoculada com S. meliloti 7. O método mais vulgarmente utilizado para a preparação em larga escala de raízes noduladas é crescimento em caixões aeroponia 7. Neste método, as plantas são suspensas sobre um recipiente grande e raízes são arejadas com uma mistura de S. meliloti e solução nutriente 7. Este método é prático se apenas um genótipo de S. meliloti é para ser testado. Uma vez que ele requer aerossolização de concentrações elevadas de bactérias, existe uma alta probabilidade de contaminação cruzada entre os caixões inoculados com diferentes estirpes bacterianas. Outro método que é frequentemente utilizado para preparar grandes quantidades de plantas inoculadas é o crescimento em banheiras ou vasos de perlita, vermiculita, areia ou argila calcinada que são infundidos com solução nutritiva e inoculado com S. meliloti 7. Este método requer o uso de banheiras ou vasos abertos, e exige rega e reposição da solução nutritiva. Outra desvantagem dos vasos é que as plantasdeve ser removido a partir desta matriz de partículas, para exame das raízes e nódulos. Outra desvantagem deste método é que uma grande área de espaço da incubadora é necessária quando muitos S. diferente genótipos meliloti são para ser comparado, por um recipiente separado devem ser utilizados para cada genótipo bacteriano. O &quot;jar Leonard&quot; é uma variação deste método 8,9. Um frasco de Leonard é composto por dois vasos esterilizados empilhadas uma em cima da outra e ligadas por uma mecha. O meio de crescimento é colocado no recipiente inferior e puxado através do pavio por acção capilar dentro de uma matriz de crescimento de perlite, vermiculite, areia ou argila calcinada no recipiente superior. A plântula (s) são colocados na matriz de crescimento e inoculadas com S. meliloti. Este método não necessita de rega, mas o exame das raízes e nódulos requer que a plântula ser removido da matriz de crescimento de partículas. Existem vários métodos que permitem a análise simples de roots. Uma delas é a transparência &quot;bolsa de crescimento&quot; de plástico 7. Uma desvantagem deste método é que a rega frequente é necessário uma vez que apenas ≤ 10 ml de meio líquido é óptima para o crescimento de M. truncatula em bolsas 7. Experimentos bolsa também são normalmente limitados a ~ 2 semanas 7, devido a avaria da torcida papel dentro da bolsa. Dois outros métodos que são vulgarmente usados ​​são semelhantes para o nosso método em que as plantas são cultivadas em agar e as raízes são visíveis, mas estes métodos também apresentam desvantagens que o nosso procedimento evita. Nestes métodos, as plantas estão completamente contidos 24,5 centímetros x 24,5 cm placas de agar seladas em torno da parte superior com fita cirúrgica poroso ou cultivadas em tubos de agar inclinado tapados por meio de tampões de algodão ou de tampas de plástico 7. Ambos estes métodos permitem um fácil exame das raízes e pode ser mantido estéril. No entanto, os tubos de ágar inclinado são normalmente cultivadas com apenas 20 ml de ágar média 7 e requerem irrigação e de nutrientes addition para crescimento a longo prazo de plantas. Plantas cultivadas dentro dos 24,5 centímetros x 24,5 centímetros de ágar microcosmos placa tem umidade e nutrientes para o crescimento de longo prazo suficiente, mas o tiro crescendo rapidamente torna-se restrita dentro do microcosmo placa fechado e gás etileno podem acumular-se inibir a nodulação 7. No processo descrito aqui, o tiro é exposta e cresce livremente fora do microcosmos contendo ~ 70 mL de meios de comunicação, permitindo que o crescimento a longo prazo. O processo descrito aqui pode ser útil não só para o estudo de nodulação de plantas leguminosas, mas também para o estudo de fenótipos raízes de outras plantas, de tamanho médio. A diferença entre estes microcosmos e uma planta tradicional policarbonato frasco de cultura de tecidos é que as raízes em microcosmos placa descritos aqui crescer sobre a superfície vertical do agar em vez de para baixo numa camada de agar horizontal na parte inferior do frasco. Isto permite que a raiz para ser levantada da superfície de agar com um mínimo dAmage de pêlos radiculares e adesão mínima de agar à superfície radicular, o que facilita a análise dos pêlos radiculares por microscopia.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agar purified, plant cell culture-tested</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7921</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

single-plant, sterile microcosms for nodulation and growth of the legume plant medicago truncatula with the rhizobial symbiont sinorhizobium meliloti

Bactérias simbióticas, rizóbios formar nódulos fixadores de nitrogênio nas raízes das plantas leguminosas hospedeiras compatíveis. Um dos sistemas modelo mais bem desenvolvidos para o estudo dessas interações é a planta Medicago truncatula cv. Jemalong A17 eo rizóbio bactéria Sinorhizobium meliloti 1021. Imagem repetida de raízes das plantas e de pontuação de fenótipos simbióticas requer métodos que são não-destrutivas para plantas ou bactérias. Os fenótipos simbióticas de algumas plantas e bactérias mutantes se tornam aparentes após períodos relativamente curtos de crescimento, e não necessitam de observação a longo prazo da interacção hospedeiro / simbionte. No entanto, diferenças sutis na eficiência e nódulo senescência fenótipos simbióticas que não são aparentes nos primeiros estágios do processo de nodulação exigem períodos de crescimento relativamente longo antes que eles possam ser marcado. Vários métodos têm sido desenvolvidos para o crescimento a longo prazo e observação deste par host / simbionte.No entanto, muitos destes métodos requerem rega repetidas, o que aumenta a possibilidade de contaminação por outros microrganismos. Outros métodos requerem um espaço relativamente grande para o crescimento de um grande número de plantas. O método descrito aqui, o crescimento simbiótica de M. truncatula / S. meliloti em estéreis, microcosmos uma única planta, tem várias vantagens. Plantas nestes microcosmos tem humidade e nutrientes suficientes para assegurar que a rega não é necessária para até 9 semanas, impedindo a contaminação cruzada durante a rega. Isso permite que os fenótipos de ser quantificado, que pode ser desperdiçada em sistemas de crescimento de curto prazo, tais como atrasos sutis no desenvolvimento de nódulos e nódulo senescência precoce. Além disso, as raízes e nódulos no microcosmos são facilmente visualizado através da tampa da placa, de modo que se-enraizamento das plantas por observação não é necessária.

A preparação e inoculação desses microcosmos placa é relativamente simples em comparação com a maioria dos outros métodos descritos na introdução. O uso desses microcosmos também permite o crescimento das plantas prolongada (até 9 semanas) sem rega ou a suplementação de nutrientes, manutenção da esterilidade de raiz, tanto fácil exame de raízes e proteção das raízes da luz, o crescimento sem restrições da parte aérea, de fácil acesso para a parte aérea para medição do comprimento, e a remoç?...

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Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti

Crescimento de plantas truncatula Medicago em simbiose com as bactérias fixadoras de nitrogênio meliloti Sinorhizobium em microcosmos, estéreis individuais feitas a partir de placas de laboratório padrão permite o exame freqüente de sistemas de raízes e nódulos, sem comprometer a esterilidade. As plantas podem ser mantidos em câmaras de crescimento para estes até 9 semanas.

Single-plantas, estéreis Microcosmos para a nodulação e crescimento da planta da leguminosa<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Com o rizóbio Symbiont<em&gt; Sinorhizobium meliloti</em

Rhizobial  bacteria form symbiotic, nitrogen-fixing nodules on the roots of compatible host  legume plants.  One  of the most well-developed model systems ...

single-plant-sterile-microcosms-for-nodulation-growth-legume-plant

Research

JoVE Journal

Environment

Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti

16.9K visualizações.  Florida State University.  Crescimento de plantas truncatula Medicago em simbiose com as bactérias fixadoras de nitrogênio meliloti Sinorhizobium em microcosmos, estéreis individuais feitas a partir de placas de laboratório padrão permite o exame freqüente de sistemas de raízes e nódulos, sem comprometer a esterilidade. As plantas podem ser mantidos em câmaras de crescimento para estes até 9 semanas. 

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Methods for Facilitating Microbial Growth on Pulp Mill Waste Streams and Characterization of the Biodegradation Potential of Cultured Microbes

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high quality paper. Black liquor is a pulping waste generated by the kraft process that has potential for downstream bioconversion. However, the recalcitrant nature of the lignocellulose resources, its chemical derivatives that constitute the majority of available organic carbon within black liquor, and its basic pH present challenges to microbial biodegradation of this waste material. Methods for the collection and modification of black liquor for microbial growth are aimed at utilization of this pulp waste to convert the lignin, organic acids, and polysaccharide degradation byproducts into valuable chemicals. The lignocellulose extraction techniques presented provide a reproducible method for preparation of lignocellulose growth substrates for understanding metabolic capacities of cultured microorganisms. Use of gas chromatography-mass spectrometry enables the identification and quantification of the fermentation products resulting from the growth of microorganisms on pulping waste. These methods when used together can facilitate the determination of the metabolic activity of microorganisms with potential to produce fermentation products that would provide greater value to the pulping system and reduce effluent waste, thereby increasing potential paper milling profits and offering additional uses for black liquor.

Industrial wastes can be collected and modified to analyze microbial growth. Lignocellulose extraction techniques provide components to analyze specific biodegradation ability. Gas chromatography-mass spectrometry identifies fermentation products of microorganisms grown on pulping waste. These methods determine the metabolic capacity of microorganisms to degrade pulping waste.

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high ...

Ambiente

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the exploration of renewable resources are necessary to overcome these challenges. Within the multinational framework MultiBioPro we are developing biorefinery pipelines to maximize the use of plant biomass. More specifically, we use poplar and tobacco tree (Nicotiana glauca) as target crop species for improving saccharification, isoprenoid, long chain hydrocarbon contents, fiber quality, and suberin and lignin contents. The methods used to obtain these outputs include GC-MS, LC-MS and RNA sequencing platforms. The metabolite pipelines are well established tools to generate these types of data, but also have the limitations in that only well characterized metabolites can be used. The deep sequencing will allow us to include all transcripts present during the developmental stages of the tobacco tree leaf, but has to be mapped back to the sequence of Nicotiana tabacum. With these set-ups, we aim at a basic understanding for underlying processes and at establishing an industrial framework to exploit the outcomes. In a more long term perspective, we believe that data generated here will provide means for a sustainable biorefinery process using poplar and tobacco tree as raw material. To date the basal level of metabolites in the samples have been analyzed and the protocols utilized are provided in this article.

Plant biomass offers a renewable resource for multiple products, including fuel, feed, food, and a variety of materials. In this paper we investigate the properties of tobacco tree (Nicotiana glauca) and poplar as suitable sources for a biorefinery pipeline.

Transcrição e Metabolite Profiling de Avaliação dos Árvore Tabaco e Poplar como matéria-prima para a indústria baseada em Bio

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).

O uso de alta resolução Termografia Infravermelha (Hrit) para o Estudo da Ice Ice nucleação e propagação de plantas

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

A New Application of the Electrical Penetration Graph (EPG) for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of electrical transmission between distant cells in an organism requires in vivo, artifact-free recordings of cells embedded within their native environment. The transmission of electrical signals from wounded to unwounded areas in a plant has since long piqued the interest of botanists. The phloem, the living part of the plant vasculature that is spread throughout the plant, has been postulated as a major tissue in electrical transmission in plants. The lack of suitable electrophysiological methods poses many challenges for the study of the electrical properties of the phloem cells in vivo. Here we present a novel approach for intracellular electrophysiology of sieve elements (SEs) that uses living aphids, or other phloem-feeding hemipteran insects, integrated in the electrical penetration graph (EPG) circuit. The versatility, robustness, and accuracy of this method made it possible to record and study in detail the wound-induced electrical signals in SEs of central veins of the model plant Arabidopsis thaliana1. Here we show that EPG-electrodes can be easily implemented for intracellular electrophysiological recordings of SEs in marginal veins, as well as to study the capacity of SEs to respond with electrical signals to several external stimuli. The EPG approach applied to intracellular electrophysiology of SEs can be implemented to a wide variety of plant species, in a large number of plant/insect combinations, and for many research aims.

A New Application of the Electrical Penetration Graph EPG for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Electrical Penetration Graph (EPG) is a well-established technique for studying the feeding behavior of stylet-bearing insects. Here we show a new application of EPG as a non-invasive tool for the acquisition of intracellular electrophysiology recordings of sieve elements (SEs), the cells that form the phloem vasculature in plants.

Um novo aplicativo do Electrical Penetration Graph (EPG) para aquisição e medição de sinais elétricos em Floema Sieve Elements

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of ...

A Gusseted Thermogradient Table to Control Soil Temperatures for Evaluating Plant Growth and Monitoring Soil Processes

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a series of incubators. A temperature gradient is passively established across the surface of the table between the heated and cooled ends and is lost quickly at distances above the surface. Since temperature is only controlled on the table surface, experiments are restricted to shallow containers, such as Petri dishes, placed on the table. Welding continuous aluminum vertical strips or gussets perpendicular to the surface of a table enables temperature control in depth via convective heat flow. Soil in the channels between gussets was maintained across a gradient of temperatures allowing a greater diversity of experimentation. The gusseted design was evaluated by germinating oat, lettuce, tomato, and melon seeds. Soil temperatures were monitored using individual, battery-powered dataloggers positioned across the table. LED lights installed in the lids or along the sides of the gradient table create a controlled temperature chamber where seedlings can be grown over a range of temperatures. The gusseted design enabled accurate determination of optimum temperatures for fastest germination rate and the highest percentage germination for each species. Germination information from gradient table experiments can help predict seed germination and seedling growth under the adverse soil conditions often encountered during field crop production. Temperature effects on seed germination, seedling growth, and soil ecology can be tested under controlled conditions in a laboratory using a gusseted thermogradient table.

Traditional thermogradient tables create a range of temperatures across the surface. Welding gussets perpendicular to the surface of a thermogradient table will control temperature in depth increasing possible research applications.

A Tabela Gusseted Thermogradient para controlar a temperatura do solo para avaliar o crescimento da planta e monitoramento de processos do solo

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a ...

Operation of a 25 KWth Calcium Looping Pilot-plant with High Oxygen Concentrations in the Calciner

Calcium looping (CaL) is a post-combustion CO2 capture technology that is suitable for retrofitting existing power plants. The CaL process uses limestone as a cheap and readily available CO2 sorbent. While the technology has been widely studied, there are a few available options that could be applied to make it more economically viable. One of these is to increase the oxygen concentration in the calciner to reduce or eliminate the amount of recycled gas (CO2, H2O and impurities); therefore, decreasing or removing the energy necessary to heat the recycled gas stream. Moreover, there is a resulting increase in the energy input due to the change in the combustion intensity; this energy is used to enable the endothermic calcination reaction to occur in the absence of recycled flue gases. This paper presents the operation and first results of a CaL pilot plant with 100% oxygen combustion of natural gas in the calciner. The gas coming into the carbonator was a simulated flue gas from a coal-fired power plant or cement industry. Several limestone particle size distributions are also tested to further explore the effect of this parameter on the overall performance of this operating mode. The configuration of the reactor system, the operating procedures, and the results are described in detail in this paper. The reactor showed good hydrodynamic stability and stable CO2 capture, with capture efficiencies of up to 70% with a gas mixture simulating the flue gas of a coal-fired power plant.

Operation of a 25 KWth Calcium Looping Pilot-plant with High Oxygen Concentrations in the Calciner

This manuscript describes a procedure for operating a calcium looping pilot-plant for post-combustion carbon capture with high oxygen concentrations in the calciner in order to reduce or eliminate the flue gas recycle.

Operação de um 25 KWth cálcio loop planta-piloto com concentrações de oxigênio alta no calcinador

Calcium looping (CaL) is a post-combustion CO2 capture technology that is suitable for retrofitting existing power plants. The CaL process uses limestone ...

Procedures of Laboratory Fumigation for Pest Control with Nitric Oxide Gas

Nitric oxide (NO) is a newly discovered fumigant for postharvest pest control. This paper provides detailed protocols for conducting NO fumigation on fresh products and procedures for residue analysis and product quality evaluation. An airtight fumigation chamber containing fresh fruit and vegetables is first flushed with nitrogen (N2) to establish an ultralow oxygen (ULO) environment followed by injection of NO. The fumigation chamber is then kept at a low temperature of 2 - 5 &#176;C for a specified time period necessary to kill a target pest to complete a fumigation treatment. At the end of a fumigation treatment, the fumigation chamber is flushed with N2 to dilute NO prior to opening the chamber to ambient air to prevent the reaction between NO and O2, which produces NO2 and may damage delicate fresh products. At different times after NO fumigation, NO2 in headspace and nitrate and nitrite in liquid samples were measured as residues. Product quality was evaluated after 2 weeks of post-treatment cold storage to determine effects of NO fumigation on product quality. Keeping&#160;O2 from reacting with NO is critical to NO fumigation and is an important part of the protocols. Measuring NO levels is challenging and a practical solution is provided. Possible protocol modifications are also suggested for measuring NO levels in the fumigation chambers as well as residues. NO fumigation has the potential to be a practical alternative to methyl bromide fumigation for postharvest pest control on fresh and stored products. This publication is intended to assist other researchers in conducting NO fumigation research for postharvest pest control and accelerating the development of NO fumigation for practical applications.

This paper describes nitric oxide (NO) fumigation protocols for postharvest pest control. Fumigation chambers are flushed with nitrogen (N2) to establish ultralow oxygen conditions before NO is injected. At the end, chambers are flushed with N2 to dilute NO before exposing products to ambient air to prevent exposure to NO2.

Procedimentos de laboratório de fumigação para controle de pragas com gás de óxido nítrico

Nitric oxide (NO) is a newly discovered fumigant for postharvest pest control. This paper provides detailed protocols for conducting NO fumigation on ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current measures to combat such pathogens have proved too conservative and, thus, not sufficiently effective, and they can potentially pose environmental risks. Therefore, it is extremely necessary to identify host-resistance factors to assist in controlling plant diseases naturally through the identification of resistant germplasm, the isolation and characterization of resistance genes, and the molecular breeding of resistant cultivars. In this regard, there is need to establish an accurate, rapid, and large-scale inoculation method to breed and develop plant resistance genes. The rice blast fungal pathogen Magnaporthe grisea causes severe disease symptoms and yield losses. Recently, M. grisea has emerged as a model organism for studying the mechanisms of plant-fungal pathogen interactions. Hence, we report the development of a plant virulence test method that is specific for M. grisea. This method provides for both spray inoculation with a conidial suspension and wounding inoculation with mycelium cubes or droplets of conidial suspension. The key step of the wounding inoculation method for detached rice leaves is to make wounds on plant leaves, which avoids any interference caused by host penetration resistance. This spray/wounding protocol contributes to the rapid, accurate, and large-scale screening of the pathotypes of M. grisea isolates. This integrated and systematic plant infection method will serve as an excellent starting point for gaining a broad perspective of issues in plant pathology.

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Here, we present a protocol to test plant virulence with the plant pathogen Magnaporthe grisea. This report will contribute to the large-scale screening of the pathotypes of fungi isolates and serve as an excellent starting point for understanding the resistant mechanisms of plants during molecular breeding.

O teste de infecção da planta: Spray e inoculação mediada por ferimento com o de patógeno vegetal Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for assessing plant responses to chemicals and other substances of interest is presented. This system is highly efficient in obtaining homogeneous and healthy seedlings of the C3 and C4 model species Arabidopsis thaliana and Setaria viridis, respectively. The sterile cultivation avoids algae and microorganism contamination, which are known limiting factors for plant normal growth and development in hydroponics. In addition, this system is scalable, enabling the harvest of plant material on a large scale with minor mechanical damage, as well as the harvest of individual parts of a plant if desired. A detailed protocol demonstrating that this system has an easy and low-cost assembly, as it uses pipette racks as the main platform for growing plants, is provided. The feasibility of this system was validated using Arabidopsis seedlings to assess the effect of the drug AZD-8055, a chemical inhibitor of the target of rapamycin (TOR) kinase. TOR inhibition was efficiently detected as early as 30 min after an AZD-8055 treatment in roots and shoots. Furthermore, AZD-8055-treated plants displayed the expected starch-excess phenotype. We proposed this hydroponic system as an ideal method for plant researchers aiming to monitor the action of plant inducers or inhibitors, as well as to assess metabolic fluxes using isotope-labeling compounds which, in general, requires the use of expensive reagents.

A simple, versatile, and low-cost in vitro hydroponic system was successfully optimized, enabling large-scale experiments under sterile conditions. This system facilitates the application of chemicals in a solution and their efficient absorption by roots for molecular, biochemical, and physiological studies.

Um flexível baixo custo sistema hidropônico para avaliar as respostas de planta para pequenas moléculas em condições estéreis

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for ...

An Optimized Rhizobox Protocol to Visualize Root Growth and Responsiveness to Localized Nutrients

Roots are notoriously difficult to study. Soil is both a visual and mechanical barrier, making it difficult to track roots in situ without destructive harvest or expensive equipment. We present a customizable and affordable rhizobox method that allows the non-destructive visualization of root growth over time and is particularly well-suited to studying root plasticity in response to localized resource patches. The method was validated by assessing maize genotypic variation in plasticity responses to patches containing 15N-labeled legume residue. Methods are described to obtain representative developmental measurements over time, measure root length density in resource-containing and control patches, calculate root growth rates, and determine 15N recovery by plant roots and shoots. Advantages, caveats, and potential future applications of the method are also discussed. Although care must be taken to ensure that experimental conditions do not bias root growth data, the rhizobox protocol presented here yields reliable results if carried out with sufficient attention to detail.

Visualizing and measuring root growth in situ is extremely challenging. We present a customizable rhizobox method to track root development and proliferation over time in response to nutrient enrichment. This method is used to analyze maize genotypic differences in root plasticity in response to an organic nitrogen source.

Um protocolo otimizado de Rhizobox para visualizar o crescimento da raiz e receptividade aos nutrientes localizadas

Roots are notoriously difficult to study. Soil is both a visual and mechanical barrier, making it difficult to track roots in situ without destructive ...