A maioria das plantas na natureza são provavelmente interconectadas por fungos simpatizantes que habitam raízes chamadas fungos micorrizais. Este método examina explicitamente como as redes micorrizais comuns influenciam as interações vegetais e as consequências ecológicas subsequentes. Com este método, podemos examinar explicitamente o papel das redes micorrizais comuns, permitindo que todas as plantas sejam colonizadas por fungos, em vez de excluir fungos, o que resulta em plantas de mal crescimento.
Para começar a modificar recipientes comerciais de mudas tubulares com plástico flexível, use uma prensa de perfuração e segure o recipiente contra uma cerca na prensa de perfuração, e faça uma parada com um pequeno dowel que cabe dentro do recipiente para ajudar a mantê-lo no lugar durante a perfuração. Em seguida, faça dois furos, um acima do outro, nas laterais do recipiente, de modo que os orifícios estejam a cerca de um centímetro de distância. Corte o pedaço de plástico fino restante entre os orifícios para fazer uma abertura alongada, cerca de dois centímetros de largura, e cinco centímetros de comprimento.
Repita o corte dessas aberturas alongadas no lado oposto do recipiente. Para cobrir as ranhuras com malha de nylon, corte a malha poros de 40 micrômetros em até 9,5 centímetros por pedaços de 8,5 centímetros como há recipientes. Em seguida, usando cola quente industrial de alta resistência, fixe a malha de nylon externamente sobre os recipientes para cobrir ambas as aberturas, com alguma ligeira sobreposição no tecido.
Aplique cola quente ao redor das aberturas do recipiente, e ao longo das longas bordas da malha de nylon, e enrole o recipiente na malha de nylon, e membrana hidrofóbica, quando usada, para evitar queimar os dedos. Adicione uma camada de cola ao longo da borda do tecido onde as bordas da malha se sobrepõem, e pressione a borda sobre algum papelão para selá-la firmemente. Uma vez que a cola tenha esfriado, use fita flexível para fixar as extremidades superior e inferior do tecido ao recipiente, para evitar bordas soltas e rasgos.
Usando a mesma fita, cubra os pequenos orifícios nas laterais da extremidade cônica de cada recipiente para evitar o crescimento de raízes do recipiente para o resto da panela. Coloque um mármore de vidro no fundo de cada recipiente para evitar a perda do solo enquanto fornece drenagem e, em seguida, monte potes como descrito no manuscrito. Use recipientes sólidos e não modificados para um tratamento de controle que não envolva qualquer potencial para uma CMN se formar entre as plantas.
Adicione o fungo AM inóculo ao solo, misturando uniformemente peças de raiz picadas de 1,2 centímetros de comprimento com o solo. Selecione um solo desejado misturado com uma areia de sílica infértil ou contas de vidro para diminuir a concentração de nutrientes minerais disponíveis para as plantas. Posicione os recipientes preenchidos em espuma perfurada previamente construída nos vasos.
Para fazer uma mistura de areia de sílica pobre em nutrientes de drenagem adequada, misture areia de tamanho médio de partículas com areia de pequeno tamanho de partícula em um misturador de cimento. Encha o espaço intersticicial com esta mistura usando um funil para ajudar no preenchimento de pequenos espaços. Em seguida, o pré-tratamento de transplante, ou as chamadas plantas enfermeiras, das espécies desejadas em cada recipiente para sustentar fungos AM, que se espalharão entre os recipientes e estabelecerão redes micorrizais comuns.
Cultivar as plantas por dois a três meses a aproximadamente 24 graus Celsius em uma estufa para permitir o estabelecimento do CMN. Costuram plantas experimentais semeando em recipientes. Aguarde até que todos os recipientes tenham germinado mudas antes de remover plantas de enfermeiras de pré-tratamento, cortando seus brotos.
Para estabelecer tratamentos cmn, deixe alguns recipientes não movidos durante a duração do experimento. Para cortar fisicamente a higeia que se estende entre os recipientes modificados, gire alguns dos recipientes semanalmente, certificando-se de fazê-lo através de uma rotação completa, para evitar alterar involuntariamente as interações acima do solo. Imediatamente após a rotação, regar fortemente todos os potes para restabelecer o contato entre o substrato intersticicial e os lados dos recipientes.
A imersão de todos os potes com água após o corte das redes micorrizais comuns é fundamental para restabelecer o contato entre o recipiente e o substrato intersticial, evitando assim aeração não intencional dos recipientes. Fertilize plantas vizinhas com 0,5% de nitrogênio 15 nitrato de potássio enriquecido e cloreto de amônio. Fertilize o indivíduo alvo com um fertilizante nitrogênio 14 de igual concentração.
Re randomizar as posições dos potes ao longo do experimento, pelo menos mensalmente. Meça o crescimento semanalmente medindo o maior comprimento da folha, para monitorar quando o crescimento começa a desacelerar, certificando-se de colher antes que as plantas se tornem ligadas à raiz. Para colher, corte todo o tecido acima do solo e coloque plantas individuais em envelopes rotulados com seu tratamento, maconha e posição.
Em seguida, seque tecidos acima do solo a 60 graus Celsius em um forno de secagem de ar forçado, para o peso constante, e, em seguida, meça o peso seco de cada tecido vegetal. Deixe o solo secar de dois a três dias antes de remover os recipientes e colher as raízes. Após a colheita, escove suavemente o máximo de solo possível dos sistemas radiculares.
Lave as raízes em uma peneira com 250 mícrons de tamanho de poros, para evitar a perda de raízes. Depois de permitir que as raízes sequem, pese todo o sistema radicular. Corte o sistema radicular aleatoriamente e coloque os fragmentos em 50% de etanol.
Repesar o sistema radicular restante e armazená-lo em um envelope de papel rotulado para secar a 60 graus Celsius para avaliação do peso seco. Ao cultivar Andropogon gerardii Vitman em um experimento de planta-alvo, cortar ou prevenir CMNs diminuiu o peso seco acima do solo, sugerindo que os CMNs intactos promoviam o crescimento das plantas. Plantas com CMNs decepdas e sem CMNs responderam de forma semelhante aos seus tratamentos.
A concorrência, na qual o crescimento de um indivíduo suprime o crescimento de outro indivíduo próximo, foi detectada no tratamento intacto do CMN, mas não nos tratamentos cortados ou sem CMN. Comparações minuciosas de diferentes concentrações de tecido de folhas de nutrientes minerais, versus concentrações apenas de manganese, foram positivamente associadas com a planta-alvo acima dos pesos secos, em todos os tratamentos. O tecido vegetal-alvo foi avaliado para nitrogênio 15 em tecidos de folhas versus tamanho da planta, depois de adicionar o rótulo de nitrogênio 15 apenas aos recipientes dos vizinhos.
Plantas-alvo com CMNs intactas apresentaram maiores concentrações de nitrogênio 15, em comparação com ambos os outros tratamentos. Os CMNs intactos apresentaram uma inclinação fortemente positiva, significativamente diferente da quantidade de nitrogênio, da do tratamento de CMNs cortados, sugerindo que grandes plantas obtiveram mais nitrogênio de CMNs atingindo recipientes vizinhos, do que pequenos indivíduos-alvo. Em um experimento de campo usando núcleos rotacionados feitos de tubo de PVC, o micélio extraradical além dos tubos teve pouco efeito no crescimento do sabão durante o experimento de 13 meses.
No entanto, cortá-lo por rotação de tubos reduziu as concentrações de nitrogênio foliar, fósforo e cobre, substancialmente mostrado pelas plantas clorolóticas. Gire os recipientes na mesma direção em que o tecido é colado em cada recipiente para evitar o rasgo do tecido, e gire 360 graus para reduzir as mudanças acima do solo nas plantas. Este procedimento pode ser usado no campo com tubos de PVC modificados cheios de solo estéril para examinar o papel do micélio extra-anárquico na colonização radicular, e sua influência na absorção de nutrientes.
Esta técnica permite a comparação de plantas com redes micorrizais comuns, com plantas micorrizais que não são interligadas por redes, em vez de pequenas plantas sem micorrizas, como é mais frequentemente feito.
