Este protocolo é significativo porque é, pelo nosso conhecimento, o primeiro a descrever um novo metal à base de centrífuga para purificação de pórsome cinético a partir de nódulos simbióticos de soja. A grande vantagem dessa técnica é que, em combinação com o RNA-Seq, permite o estudo da relação e organizada em um tecido complexo como o nódulo simbiótico. Para começar, pese aproximadamente 0,2 gramas de nódulos intactos em um prato de pesagem, e transfira-os para um tubo pré-resfriado de dois mililitros.
Em seguida, adicione 1,2 mililitros de tampão de extração de pórsome, deixe a amostra descongelar por dois minutos e homogeneize com um moedor de tecido até a interrupção completa e homogeneização dos nódulos. Em seguida, incubar as amostras no gelo com agitação suave por 10 minutos ou até que todas as amostras tenham sido processadas e centrífuga a 16.000 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius para pelotar os detritos. Então, recupere o supernatante, e repita o passo da centrífuga.
Depois de recuperar cuidadosamente o extrato citosolico esclarecido, transfira uma alíquota de 200 microliter para um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro limpo para isolamento total. Em seguida, despeje 4,5 mililitros da camada de sacarose de 33,5% nos tubos de centrífugas e adicione 4,5 mililitros da camada de 12% cuidadosamente e lentamente com uma micropipette P-1000. Em seguida, coloque os tubos no gelo até a adição do extrato citosolico esclarecido.
Carregue um mililitro do extrato citosolico esclarecido em cima da almofada de sacarose, tubos cuidadosamente na parede lateral do tubo. Em seguida, transfira os tubos de ultra centrífugas para baldes pré-resfriados, e centrífugas a 217,874 G por duas horas a quatro graus Celsius. Depois de descartar o extrato citosolico restante e a almofada de sacarose, suspenda a pelota polissômica com 200 microliters de tampão de re-suspensão pré-resfriado.
Em seguida, incubar por 30 minutos no gelo e, em seguida, transferir a suspensão polissomal para tubos pré-resfriados de 1,5 mililitro para prosseguir com a extração de RNA. Após homogeneizar as amostras com 750 microlitres do reagente de isolamento RNA incubar por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 200 microliters de clorofórmio frio, e agite os tubos vigorosamente por 15 segundos.
Em seguida, incubar em temperatura ambiente por 10 minutos. Centrifugar a 12.000 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius para separação de fase, e transferir 500 microliters da fase aquosa superior para um tubo limpo sem perturbar a fase orgânica rosa. Em seguida, adicione 375 microliters de isopropanol frio e 0,5 microliters de Glicogênio livre RNAs.
Depois, misture bem por pipetar para cima e para baixo. Incubar a mistura por 10 minutos a quatro graus Celsius, e centrífuga a 12.000 vezes G por 15 minutos. Em seguida, descarte o supernascido, e lave o RNA precipitado com um mililitro de frio, 75% de etanol.
Misture por um breve vórtice. Em seguida, centrífuga a 7.500 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernatante e seque a pelota de RNA.
Em seguida, dissolva a pelota em 50 microliters de água livre rnas, e incubar a 65 graus Celsius por cinco minutos. Avalie a concentração e integridade do RNA com eletroforese capilar altamente sensível e, ou eletroforese em um gel de agarose livre de 2%RNAs. Após estimar o volume amostral, adicione 0,1 volumes de três acetatos de sódio molar, três volumes de etanol frio e 0,5 microliters de RNAs, glicogênio livre.
Em seguida, misture-os completamente. A eletroforese capilar foi realizada para várias frações totais e polissômicas associadas à amostra de RNA, que demonstraram bandas de RNA ribossômicas afiadas, sem qualquer aparência manchada. No entanto, isso não se reflete nos valores do RIN, pois variam entre 5,9 e 7,5, o que corresponde a amostras não intactas.
O bioanalífero não conseguiu identificar os picos 18S e 25S como visto nos eletroferogramas, tanto para amostras de RNA total quanto polisso. Não havia sinal visual de degradação da amostra. No entanto, uma amostra foi analisada para visualizar o resultado de uma amostra quase inteiramente degradada, para comparação.
O mais importante é trabalhar em condições de preservação de pórsome e RNA durante todo o protocolo. Após sequenciar os padrões padrão de frações de RNA totais e par para a expressão genética analisada pode ser usado para identificar genes expressos diferenciais na transcrição e no nível de tradução.
