Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust uma bolsa de doutoramento Clínica (CAAT).

1. Fabricação de Padrões Parileno em SiO 2: Fluxo de Processo (Ver Figura 1) <ol><li> Projeto de configuração desejado parylene-C usando um pacote de software editor de layout, capaz de leitura / escrita CIF (Caltech Intermediate Form) ou arquivos GDS-II (Banco de Dados do Sistema Gráfico-II). CIF e GDS-II são os formatos de arquivo padrão da indústria para a disposição de arte circuito integrado. </li><li> Máscara foto Comissão fabricar a uma unidade de microeletrônica apropriadas, ou fazer em casa, se há disponibilidade. </li><li> Oxidar uma bolacha de silício em um forno horizontal atmosférica (1,88 H 2 O 2 e SLM 1,25 SLM) a 950 ° C durante 40 minutos para produzir um a 200 nm, camada de SiO2 (confirmar com a espessura de um pequeno ponto espectroscópica da reflectividade). </li><li> Primeiro o wafer oxidado com um promotor de adesão silano. Agora depositar parilene-C a 22 ° C a uma taxa de 1,298 nm / mg de dímero utilizando um sistema de deposição de vácuo, especificamente concebida para a deposição parileno. A 100nm de espessura de revestimento parilene-C, foi usado para todos os exemplos mostrados abaixo. </li><li> Próximo depósito hexametildissilazano (HMDS), o promotor de aderência sobre a bolacha revestidos por parileno usando um sistema de revestimento de foto-resist adequado. </li><li> Agora girar a bolacha a 4.000 rpm durante 30 segundos, enquanto a aplicação positiva fotorresistente (resultando numa espessura teórica de 1 mm), usando o mesmo sistema de revestimento foto-resistente como acima. </li><li> Mole cozer a bolacha durante 60 segundos a 90 ° C. </li><li> Inserir tanto o wafer e máscara de foto, pré-fabricado em um alinhador de máscara. </li><li> Expor o wafer foto-resistente revestida-com uma representação negativa UV da configuração parilene-C desejada. </li><li> Asse wafer expostas por 60 segundos a 110 ° C. </li><li> Remover todos expostos foto-resiste do wafer, através do desenvolvimento de uma solução desenvolvedor apropriado. </li><li> Etch fora do parylene desprotegido. Use um sistema de plasma de oxigênio etch (a uma pressão da câmara de 50 mTorr, 49 sccm O 2, com 100 W de potência de RF de 13,56 MHz, euma taxa de corrosão de 100 nm / min) para revelar o SiO subjacente 2. </li><li> Cortar o wafer usando uma serra corte em cubos apropriada (velocidade do fuso de 30.000 rpm, a velocidade de alimentação 7 mm / seg.) </li><li> Enxágüe fichas em H2O desionizada e seque com nitrogênio. </li><li> Armazene fichas (por tempo indeterminado) em caixas de poeira livre até que seja necessário. </li></ol> 2. Chip Limpeza e Ativação: Protocolo <ol><li> Retirar fotorresistente residual a partir de lascas por lavagem em acetona durante 10 seg. </li><li> Enxágüe em água deionizada destilada H 2 O 3x. </li><li> Certifique-se de ácido piranha fresco (uma proporção de 30% de peróxido de hidrogênio e ácido sulfúrico 05:03 98%). CUIDADO: Preparar ácido piranha com muito cuidado. Ele é um oxidante muito poderoso, é fortemente ácida, e a mistura de peróxido de hidrogénio com ácido sulfúrico é uma reacção exotérmica. Realize esta etapa em uma coifa ácido. Permitir 2 min para passar após a mistura do ácido piranha, mas usar dentro de 20 min. </li><li> Fichas limpas e de corrosão por imersão em piácido Ranha por 10 min. </li><li> Lavar 3x em chips de H2O desionizada e transferir para um prato de cultura estéril. </li><li> Agora ativar chips para padronização celular. Por exemplo, adicionar dois chips por poço para uma placa de 6 poços e, em seguida, adicionar 2 ml de soro fetal de bovino, de modo a imergir totalmente todos os chips. Executar esta, e todas as fases subsequentes de cultura de células, em condições estéreis num fluxo laminar para cultura de tecidos capuz. </li><li> Incubar fichas no soro por 3-12 h a 37 ° C. NOTA: Passos 2,4-2,7 devem ser realizados sequencialmente e sem demora entre as etapas. Se a ativação do soro é adiada por ≥ 24 horas depois de piranha-tratamento, padronização celular é prejudicada devido à redução da repulsão celular de SiO 2 regiões. Soluções de activação alternativo contendo proteínas de adesão celular específicos podem ser usados ​​em lugar de soro fetal bovino. Tais soluções podem alterar as características de adesão celular dos dois substratos contrastantes (ver resultados representativos para um exemplo). </li&gt; </ol> 3. Chaparia linhas de celulares on-Chip: Protocolo <ol><li> Retirar as fichas de sua solução de activação e lavagem, uma vez durante 10 segundos em uma solução salina equilibrada de Hank. </li><li> Coloque chip de um poço de cultura e a placa tipo celular escolhido como uma suspensão em meio de crescimento normal. Optimum densidade de revestimento celular depende tanto do tipo de célula e padrão geométrico de parylene-C on-chip. Uma densidade de 5 x 10 4 células / ml é um ponto de partida razoável. </li><li> Imagem é adaptado para a motivação subjacente para padronização celular, mas o comportamento de células vivas podem ser facilmente avaliada através de um microscópio de dissecação e uma câmera digital com uma lente de relé adequado. </li></ol>

<ol>
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Biomed. Mater. Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., MacLeod, N. K., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guided+growth+of+neurons+and+glia+using+microfabricated+patterns+of+parylene-C+on+a+SiO2+background.">Guided growth of neurons and glia using microfabricated patterns of parylene-C on a SiO2 background.</a> Biomaterials. 30, 2048-2058 (2009).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F., Curtis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+parylene-C+photooxidation+on+serum-assisted+glial+and+neuronal+patterning.">Effects of parylene-C photooxidation on serum-assisted glial and neuronal patterning.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 94, 47-58 (2010).</li><li>Delivopoulos, E., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+adhesion+and+growth+of+long+term+glial+and+neuronal+cultures+on+parylene-C.">Controlled adhesion and growth of long term glial and neuronal cultures on parylene-C.</a> PLoS One. 6 (9), (2011).</li><li>Hughes, M. A., Bunting, A., Cameron, K., Murray, A. F., Shipston, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+patterned+adhesion+and+repulsion+of+HEK+293+cells+on+micro-engineered+parylene-C/SiO2+substrates.">Modulating patterned adhesion and repulsion of HEK 293 cells on micro-engineered parylene-C/SiO2 substrates.</a> J. Biomed. Mat. Res. Mater. A. 101 (2), 349-357 (2013).</li><li>Unsworth, C. P., Graham, E. S., Delivopoulos, E., Dragunow, M., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+human+hNT+neurons+patterned+on+parylene-C/silicon+dioxide+substrates:+Combining+an+accessible+cell+line+and+robust+patterning+technology+for+the+study+of+the+pathological+adult+human+brain.">First human hNT neurons patterned on parylene-C/silicon dioxide substrates: Combining an accessible cell line and robust patterning technology for the study of the pathological adult human brain.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 154-157 (2010).</li></ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Imersão das fichas em ácido piranha serve não só para remover qualquer material orgânico residual, mas também grava as superfícies do substrato. Isso é fundamental para que a ativação efetiva com soro fetal bovino. Não fazer isso impede célula-padronização e altera profundamente o comportamento das células on-chip. Não há nenhuma exigência para esterilizar fichas após a limpeza com ácido piranha. Com efeito de esterilização por exposição aos raios UV demonstrou prejudicar padronização de células de uma forma dependente da dose 13. Cuidados devem ser tomados para lavar tudo photoresist residual após o processo de fotolitografia. Persistindo photoresist pode atuar como uma camada de cito-adesiva indesejado que substitui padrões ditados por parylene-C/SiO 2 geometria. A acetona é eficaz quando se utiliza o processo de fotolitográfica descritos acima e com os reagentes especificados. No entanto, outros tipos de material fotoresistivo pode necessitar de um solvente diferente. Para avaliar o impacto eo sucesso da difereetapas de fabricação nt, o ângulo de contacto dos dois substratos de contraste pode ser medido. Figura 2 ilustra as alterações que ocorrem durante o processo de activação de chip. É provável, contudo, que o adesivo específico e componentes proteicos repulsivas em soro acabará por permitir o chip-modeladas parilene para exercer as suas respectivas características cito-adesivas ou cito-repulsivo. Todos os resultados representativos utilizados fichas com uma espessura parylene de 100 nm, embora tenhamos modelada com sucesso usando camadas parylene tanto mais grossas e mais finas. Mais importante, esta técnica gravura fotolitográfico permite um controlo muito maior tridimensional de configuração parilene do que ilustrado aqui. Por exemplo, usando uma combinação de máscaras, é possível criar regiões parylene de espessura mista. Isso abre o caminho para a criação de culturas de células com topografia tridimensional definido, indo além das regiões simplesmente ditando de adesão celular / repulção, oferecendo potencialmente um meio de integrar canais microfluídicos para a construção. Como mostrado, no entanto, esta plataforma padronização não é universalmente eficaz em todos os tipos celulares. Linhagens celulares diferentes, com seus perfis molécula de adesão celular variados, sem surpresa se comportam diferentemente quando cultivadas nesta plataforma. Nós ainda não identificaram os principais componentes no soro, nem os receptores da membrana celular de cortesia, que se baseia essa plataforma célula-padronização. Ao fazê-lo, no futuro, promete ampliar a sua utilidade e especificidade. Por exemplo, uma linha de células &quot;não-padronização &#39;pode ser geneticamente modificado para expressar a molécula de adesão necessária e assim promover a padronização.

Compreender os mecanismos que determinam a adesão celular e padronização de materiais sintéticos é importante para aplicações tais como engenharia de tecidos, descoberta de drogas e a fabricação de biossensores 1-3. Muitas técnicas estão disponíveis e em evolução, cada um levando vantagem dos fatores biológicos, químicos e físicos que influenciam a miríade de adesão celular. Aqui, descrevemos uma técnica de células-padronização que utiliza processos inicialmente desenvolvidas para fins de fabricação de microeletrônicos. Como tal, a plataforma está bem colocado para permitir a integração a jusante de tecnologias de microeletrônica, tais como AAM, na plataforma de padronização. A interface entre a membrana celular e um material adjacente é bidireccional e complexo. In vivo, as proteínas da matriz extracelular e fornecem a estrutura e força de impacto sobre o comportamento das células através de interacções com receptores de adesão celular. De igual modo, as células em vitro interagir com substratos sintéticos via camadas absorvidas de proteínas 4, enquanto influências físico-químicas também modular a adesão. Por exemplo, uma superfície de polímero pode ser tornado mais &quot;molhável&quot; (hidrofílico) por iões ou irradiação de luz ultravioleta, ou decapagem por tratamento com ácido ou hidróxido de 5. Métodos estabelecidos para a padronização de células tirar proveito destes e de outros mediadores da adesão celular. Exemplos incluem a impressão a jato de tinta 6, microcontact carimbar 7, imobilização física 8, 9 microfluídica, manipulação em tempo real de 10, e padronização seletiva molecular montagem (SMAP) 11. Cada um tem vantagens e limitações específicas. Um fator-chave no nosso trabalho, no entanto, é integrar padronização celular com sistemas microeletromecânicos (MEMS). MEMS referem-se extremamente pequenos dispositivos mecânicos que funcionam com energia elétrica. Isto coincide com a nanoescala equivalente, nanoelectromechsistemas mecânicos. Este conceito tornou-se prática apenas quando as estratégias de semicondutores habilitado fabricação a ter lugar em microescala. Técnicas de microfabricação desenvolvidos originalmente para eletrônicos semicondutores têm sido inadvertidamente encontrado útil para outros usos, como a eletrofisiologia celular, por exemplo. Um objetivo a jusante chave é combinar essas tecnologias de microeletrônica com um processo de padronização de células de alta fidelidade (formando um dispositivo bioMEMS). Várias técnicas de células-padronização existentes e de outro modo confiáveis ​​e práticas são incompatíveis com essa idéia. Por exemplo, o alinhamento preciso de quaisquer microelectrónica ou biossensores embutidos é fundamental para a sua eficácia, mas é extremamente difícil de conseguir utilizando uma técnica tal como microcontact estampagem. Para contornar esse problema, estamos trabalhando em uma plataforma de padronização com base em 2 SiO que usa photolithographically impresso parylene-C. Fotolitografia envolve a transferência de recursos geométricos deuma máscara para um substrato por meio de iluminação UV. Uma máscara é projetado usando um programa de desenho assistido por computador apropriado. Mediante uma placa de vidro, uma camada fina de crómio não transparente representa o padrão geométrico desejado (uma resolução característica de 1-2 mm é possível). O substrato a ser modelado é revestida com uma fina camada de material fotosensitivo (um polímero sensível ao UV). O polímero revestido é então alinhada e trouxe em contato próximo com a máscara. Uma fonte de UV é aplicada de tal modo que as áreas não protegidas são irradiadas e, portanto, tornam-se solúveis e removível na próxima etapa de desenvolvimento, deixando uma representação parilene-C do padrão de máscara de trás. Este processo originou durante o desenvolvimento de dispositivos semicondutores. Como tal, as bolachas de silício são frequentemente utilizadas como um substrato. Deposição de fotolitografia de parylene-C em SiO 2, portanto, é um processo simples e confiável que rotineiramente ocorre em instalações de salas limpas microeletrônicos. Enquanto parylene temvárias características desejáveis ​​de bioengenharia (quimicamente inerte, não bio-degradável), um fator restritivo de utilização direta na padronização celular é a sua adesividade celular inata pobres, atribuída em parte à sua extrema hidrofobia. No entanto, parilene-C tem sido anteriormente utilizada indirectamente para a padronização de células, por exemplo, como uma casca-de distância modelo celular 12,13. Esta abordagem é limitada pela baixa resolução e requer várias etapas. O processo aqui descrito utiliza um passo em vez de corrosão ácida, seguido por incubação de soro, para assegurar que as regiões de parileno-C tornar célula-adesiva, por meio de uma combinação de redução e na hidrofobicidade da proteína de ligação do soro. O resultado final é uma estrutura composta de dois substratos diferentes, o que, depois da activação biológica, manifestam respectivas características cito-adesivas ou cito-repulsivo e assim representa uma plataforma pattering celular eficaz. É importante notar, não há necessidade de introduzir um g biológicaentos para a instalação de salas limpas como os substratos padronizados podem ser armazenados indefinidamente antes de ser utilizado (após o que são activados utilizando soro fetal de bovino ou de outra solução de activação). Esta plataforma padronização parylene-C/SiO 2 é, portanto, um bom candidato para uma coalizão com os componentes de MEMS, como os processos de fabricação tão estreitamente espelhar as utilizadas para a fabricação de microeletrônica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1784">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Layout editor software package&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. CleWin 5.0 from WieWeb, http://www.wieweb.com/ns6/index.html</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:615px;">Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Bespoke photo mask</td>
			<td colspan="2">e.g. Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland, www.compugraphics-photomasks.com</td>
			<td>Either fabricate in-house of facilities exist or commision</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">3&#34; Silicon wafers</td>
			<td>e.g. Siltronix, Archamps, France, http://www.siltronix.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Atmospheric horizontal furnace</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sandvik, http://www.mrlind.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>For oxidising silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Small spot spectroscopic reflectometer</td>
			<td>e.g. Nanometrics NanoSpec 3000 reflectometer, www.nanometrics.com/</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>To measure depth of silicon dioxide layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silane adhesion promoter</td>
			<td>e.g. Merck Silane A174 adhesion promoter. Merck Chemicals, www.merck-chemicals.de/</td>
			<td style="width:215px;">1076730050</td>
			<td>Pre-applied to wafer to encourage parylene deposition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parylene-C&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Ultra Electronics, www.ultra-cems.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010</td>
			<td style="width:572px;">SCS equipment, Surrye, UK, www.scscoatings.com/</td>
			<td style="width:215px;">Model PDS2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter</td>
			<td style="width:572px;">e.g. SpiChem, www.2spi.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:383px;">Automated track system for dispensing photoresist on wafers.</td>
			<td>e.g SVG (silicon Valley Group) 3 inch photo-resist track,&#160;</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist.&#160; Pre-bake oven cures the resist.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Photo-resist: Rohm &#38; Haas</td>
			<td style="width:572px;">Rohm &#38; Haas, www.rohmhaas.com/</td>
			<td style="width:215px;">&#160;SPR350-1.2 positive photo-resist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Phot-mask aligner</td>
			<td>e.g. Suss Microtech MA/BA8 mask aligner, www.suss.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microchem MF-26A developer</td>
			<td>Microchem MF-26A developer, www.microchem.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Removes exposed reogions of photoresist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Plasma etch system</td>
			<td>e.g. JLS RIE80 etch system, JLS Designs, www.jlsdesigns.co.uk</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Removes exposed regions of parylene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Wafer dicing saw</td>
			<td>e.g. DISCO DAD 680 Dicing Saw, DISCO Corporation, Japan, www.disco.co.jp</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetone&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Fisher Scientific, www.fishersci.com/</td>
			<td style="width:215px;">A929-4&#160;</td>
			<td>To wash off residual photoresist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% Hydrogen Peroxide&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:215px;">H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">98% Sulphuric Acid</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:215px;">435589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:572px;">Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com</td>
			<td style="width:215px;">10437</td>
			<td>Standard chip activation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:572px;">Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com</td>
			<td style="width:215px;">14170</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell patterning on photolithographically defined 
parylene-c: sio2 substrates

Plataformas padronização celular apoiar objetivos de pesquisa gerais, tais como a construção de redes neuronais in vitro pré-definidos ea exploração de alguns aspectos centrais da fisiologia celular. Para combinar facilmente padronização celular com Multi-Eletrodo Matrizes (AAM) e à base de silício &quot;laboratório em um chip&quot; tecnologias, um protocolo de microfabricação compatível é necessária. Descreve-se um método que utiliza a deposição do polímero parilene-C em SiO 2. Fotolitografia permite padronização precisa e confiável de parylene-C com resolução de nível micro. A subsequente activação por imersão em soro fetal bovino (ou outra solução de activação específica) resulta em um substrato no qual as células cultivadas aderem, ou são repelidos por, parileno ou SiO 2 regiões, respectivamente. Esta técnica permitiu padronização de uma ampla gama de tipos de células (incluindo as células primárias murino hipocampo, HEK 293 linha celular, teratocarcinoma neurônio-like humanoA linha de células, as células granulares do cerebelo de murino primários, e as células-tronco do tipo derivado de glioma humanas primárias). Curiosamente, contudo, a plataforma não é universal, reflectindo a importância das moléculas de adesão de células específicas. Este processo de padronização celular é rentável, confiável e importante pode ser incorporado em microfabricação padrão (de fabricação de chips) protocolos, abrindo o caminho para a integração da tecnologia microeletrônica.

O processo de padronização fotolitográfica SiO2 com parileno-C encontra-se ilustrada na Figura 1. Uma vez preparada, a activação de fichas em soro fetal bovino permite uma ampla gama de tipos de células para ser modelado em cultura. Nosso grupo tem estampados com sucesso células murinas primários do hipocampo 14-16, a linha de HEK 293 células 17, o neurônio-como teratocarcinoma humano (hNT) linha de células 18, as células granulares do cerebelo murinos primários, e as células-tronco do tipo derivado de glioma humano primários. A Figura 3 ilustra padronização robusto de HEK 293 células em um padrão parylene consistindo de nódulos circulares com as extensões &quot;de cruz&quot;. Chip de activação neste exemplo era com soro fetal bovino. Em contraste, a Figura 4 ilustra o potencial para aumentar a plataforma de padronização usando soluções de activação alternativa. Usando uma solução de albumina de soro bovino (3 mg / ml) e<html> fibronectina (1 ug / ml) em HBSS, a preceito padronização anterior tenha sido invertido. A Figura 5 ilustra um tipo de célula diferente (uma linha principal-humano derivado da haste-como células derivadas de um glioma de alto grau). Aqui, a geometria do comportamento celular impactos padrão subjacente, com o padrão mostrado na Figura 4A a promoção do crescimento celular ao longo de processo fina parilene-C faixas, como mostrado nas Figuras 4B e 4C. Alguns tipos de células não padrão ao utilizar o protocolo de activação de soro fetal bovino estabelecida. Figura 6 ilustra 3T3 L1 crescimento até à confluência com nenhuma diferença cito-repulsivo ou cito-adesiva discernível entre parilene-C e SiO 2 regiões. pload/50929/50929fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Diagrama de fluxo que ilustra o processo para a fabricação de padrões parilene-C em SiO 2. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2.jpg" /> Figura 2. Fluxo diagrama que ilustra as mudanças no ângulo de contato para estampados parylene-C e SiO 2 domínios durante as etapas de ativação chip. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3.jpg" /> Figura 3. Imagem de células vivas de células HEK 293 cultivadas em parylene-C/SiO 2 após três dias in vitro. Chips incubados durante 3 horas em soro de bovino fetal após o que as células forambanhados em suspensão numa concentração de 5 x 10 4 células / ml. Parylene-C promove a adesão celular, enquanto nua SiO2 repele células. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4.jpg" /> Figura 4. Imagem de células vivas de células HEK 293 cultivadas em parylene-C/SiO 2 após três dias in vitro chips activados durante 3 horas em diferentes soluções de activação racionalizado:. A: soro fetal bovino, B: vitronectina (1 ug / ml) em HBSS, C: albumina de soro de bovino (3 mg / ml) + vitronectina (1 ug / ml) em HBSS, D: albumina de soro bovino (3 mg / ml) + fibronectina (156; g / ml) em HBSS. As células foram plaqueadas em suspensão, a uma densidade de 5 x 10 4 células / ml. Note-se como um tratamento diferente do chip resultou na reversão do dogma padronização anterior, com SiO 2 agora adesiva e parylene-C repulsivo. Parylene-C diâmetro nó 250 um, adaptado de Hughes et al. 17 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5.jpg" /> Figura 5. Imagens de imunofluorescência de células estaminais do tipo derivado de glioma humano primários cultivados em vários padrões de parileno-C sobre SiO 2 A:. Esquemático que ilustra o desenho reticular parilene mostrado em B e C </strong&gt; B:.. Micrografia de fluorescência de células fixadas (após 4 dias in vitro) corado para proteína ácida fibrilar glial (GFAP) C:. Micrografia de luz de células vivas no mesmo chip D: imagem de fluorescência ilustrando células GFAP-coradas numa parilene diferente E projeto:.. imagem de reflectância do nó e falou projeto parylene fotografada em D <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6.jpg" /> Figura 6. Imagens de células vivas de células 3T3 L1 cultivadas em parylene-C/SiO 2 depois de quatro dias in vitro. Chips ativados por 3 horas em soro fetal bovino após wAs células foram plaqueadas em Hich suspensão (3 x 10 4 células / ml). Neste caso, a plataforma não permite padronização, com células tornando-se igualmente confluente em parylene-C e SiO 2 regiões. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Parylene-C: SiO2 Substrates at JoVE.com

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Este protocolo descreve um método de microfabricação compatível para padronização de células em SiO 2. Um projeto parylene-C predefinido é photolithographically impresso em SiO 2. Após a incubação com soro (ou outra solução de ativação), as células aderem especificamente (e crescer de acordo com a conformidade de) subjacente parylene-C, enquanto está sendo repelido por SiO 2 regiões.

Padronização celular em photolithographically Definido Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substratos

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

cell-patterning-on-photolithographically-defined-parylene-c-sio2

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

13.2K visualizações.  The University of Edinburgh.  Este protocolo descreve um método de microfabricação compatível para padronização de células em SiO 2. Um projeto parylene-C predefinido é photolithographically impresso em SiO 2. Após a incubação com soro (ou outra solução de ativação), as células aderem especificamente (e crescer de acordo com a conformidade de) subjacente parylene-C, enquanto está sendo repelido por SiO 2 regiões. 

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Parylene-C: SiO2 Substrates

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

Padronização de plasma de superfície litografia para a Criação de Redes de celular

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Bioengenharia

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Criando Two-Dimensional Substratos modelado para Confinamento de proteína e celular

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualização de Cortex organização e dinâmica em microorganismos, utilizando microscopia de fluorescência Total Internal Reflection

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Padronização de células co-cultura Usando duas fases aquosas Sistemas

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Usando Adhesive Padronização Construir 3D de papel microfluídicos

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

Padronização Subtractive rápida de camadas de células vivas com uma Probe microfluídicos

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Formação Light-mediada e padronização de hidrogéis para aplicações de cultura celular

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Um método versátil de padronização proteínas e células

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

Padronização bioativas proteínas ou peptídeos em hidrogel usando fotoquímica para aplicações biológicas

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. Both forms can be prepared with the same type I collagen. In general, the non-fibrous form promotes cell adhesion and proliferation. The fibril form (gels) provides more physiological conditions in many types of cells; therefore, gel culture is useful for examining physiological behaviors of cells, such as drug efficacy.
Researchers can select the appropriate form according to the purpose of its use. For example, in the case of keratinocytes, on-gel culture has been used as a wound healing model. FEPE1L-8, a keratinocyte cell line cultured on the non-fibrous form of type I collagen, promote cell adhesion. Notably, keratinocyte proliferation is slower on the fibril form than the non-fibrous form. Protocols for the preparation of type I collagen for cell culture are simple and have wide applications depending on the experimental needs.

Here, we present a protocol for the preparation of two different forms of culture substrates utilizing type I collagen. Depending on how collagen is handled, collagen molecules either maintain two-dimensional, non-fibrous form or reassemble into three-dimensional, fibril form. Cell proliferation on type I collagen is drastically affected by fibril formation.

Avaliação da proliferação queratinócito em duas e três dimensões tipo I colágeno substratos

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...