Descreveremos um método de micropatteria unicelular sem litografia à base de estêncil que supera muitos obstáculos associados à fotolitografia e à litografia macia. Os estêncil são reutilizáveis e o processo é barato e personalizável. Este método abriu um novo caminho para pesquisadores não-engenheiros estudarem a forma celular e a mecanotransdução induzida pela área em diversos contextos fisiológicos e patológicos.
Além disso, este protocolo permite a micropatterning de milhares de células que podem ser utilizadas para rastreamento de medicamentos de alto rendimento e modelagem de doenças em um prato. A demonstração visual facilitará a implantação de duas etapas cruciais: o desprendimento do deslizamento de cobertura do hidrogel, secando hidrogel suficientemente antes de colocar o estêncil. Prepare a solução de hidrogel de poliacrilamida em um novo tubo de centrífuga de propileno de 50 mililitros, conforme descrito no manuscrito.
Em seguida, para preparar a solução 5% fotoinitiador, dissolva os ingredientes em 700 microliters de 100% etanol. Os ingredientes não são solúveis em água, por isso certifique-se de dissolver totalmente por vórtice. Adicione 300 microliters de PBS para um volume final de um mililitro.
Trabalhando em gelo, diluir a solução de proteína de matriz de membrana do porão com mídia DMEM F12 gelada ou 1X PBS para a relação de diluição otimizada. Mantenha o gelo para uso posterior. Ao trabalhar com matriz de membrana de porão, certifique-se de sempre trabalhar no gelo e usar soluções geladas em pontas e tubos de pipeta refrigerados.
Coloque uma lâmpada de banco UV em um capô de segurança biológica. Em seguida, coloque os filmes de parafina esterilizados preparados anteriormente. Se os filmes de parafina não estiverem completamente secos, use um sistema de aspiração de vácuo para remover qualquer líquido residual.
Usando fórceps autoclavados, coloque seis tampas autoclaved no filme de parafina seis em cada placa de Petri. Para preparar a solução final de poliacrilamida transversal UV, diluir a solução fotoinitiadora com a solução precursora do hidrogel de poliacrilamida. Esterilize a solução usando uma unidade de filtro de 50 mililitros com um tamanho de poro de 0,22 micrômetro.
Em seguida, distribua 200 microliters de solução final de poliacrilamida cruzada UV em cada uma das seis tampas de vidro nas placas de Petri. Usando fórceps autoclavados, cubra cuidadosamente cada deslizamento de cobertura com um segundo deslizamento de tampa prendendo uma camada da solução entre as duas tampas. Coloque as placas de Petri contendo as tampas sob a lâmpada do banco UV com a tampa desfetada.
A cobertura do white paper na superfície não branca é importante para minimizar a perda de intensidade UV. Para proteção contra radiação UV, cubra a lâmpada com papel alumínio. Fotopolimerizar os hidrânis de poliacrilamida por cinco minutos.
Use uma lâmina de barbear para separar cuidadosamente cada par de tampas. Encha o reservatório contendo seis compostos de deslizamento de hidrogel com PBS. Depois de enxaguar por cinco minutos, devolva os compósitos de deslizamento de hidrogel para o filme de parafina na placa de Petri.
Obtenha um tubo de Sulfo-SANPAH a partir do armazenamento a menos 80 graus Celsius. Adicione 1.200 microliters de PBS pré-refrigerado ao tubo e misture por pipetação para cima e para baixo. Dispense 200 microliters do Sulfo-SANPAH diluído no filme de parafina na placa de Petri.
Coloque um composto de deslizamento de hidrogel sobre o Sulfo-SANPAH com o hidrogel entrando em contato com o Sulfo-SANPAH. Em seguida, coloque os compostos de deslizamento de hidrogel sob a lâmpada UV e exponha-os por cinco minutos para ativar o Sulfo-SANPAH. Se o Sulfo-SANPAH passar de laranja para marrom indicando ativação e incorporação bem sucedidas, proceda para os próximos passos dentro de 10 minutos.
Reabastecer o reservatório de polipropileno descartável com PBS fresco. Transfira os compostos de deslizamento de hidrogel ativados para o reservatório e enxágue-os brevemente para remover Sulfo-SANPAH desvinculado. Coloque os compostos de deslizamento de hidrogel no filme de parafina nas placas de Petri e cuidadosamente dab-los com lenços estéreis sem fiapos.
Coloque um estêncil em cima de cada composto de cobertura de hidrogel. Para garantir uma vedação apertada entre o estêncil e o composto, remova o excesso de umidade, esfregando com lenços de fiapos autoclavados. Dispense cuidadosamente a solução de proteína de matriz de membrana diluída colocando 200 microliters em cima de cada composto de deslizamento de hidrogel.
Incubar as construções durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, transfira os compósitos para uma placa de seis poços. Uma vedação apertada entre hidrogel e estêncil pode ser facilmente validada observando se a solução de proteína matricial foi mantida em cima do estêncil.
A não formação de uma vedação apertada leva ao rápido vazamento da solução proteica através dos orifícios. Imerque totalmente os compósitos na PBS. Usando pinças autoclavadas, desprende cuidadosamente os estêncil dos hidrogéis sem rasgar os hidrogéis.
Retire o PBS dos poços e reabasteça os poços com DMEM. Incubar a placa durante a noite a 37 graus Celsius. Depois de remover a placa da incubadora, examine o DMEM.
Se o DMEM não estiver nublado, os compostos de deslizamento de cobertura de hidrogel estarão prontos para serem usados para chapeamento celular. Estêncil foram fabricados contendo matrizes de quadrados e retângulos. Substratos de hidrogel micropattered foram criados a partir dos estêncil e ilhas de proteína matricial foram obtidos.
Também foram obtidas ilhas celulares. Por exemplo, ilhas de cardiomiócitos pluripotentes induzidos pelo homem. A concentração de proteínas matricial desempenhou um papel essencial na geração de padrões adequados.
Uma concentração ideal levou a uma distribuição homogênea de proteínas. Concentrações de solução de proteínas de matriz subótida levaram à padronização subótima. É fundamental usar a parte frontal do estêncil.
Se o lado de trás do estêncil for usado, o tamanho das ilhas de proteína matricial aumenta devido à direção do corte a laser. Embora o uso do lado traseiro do estêncil não tenha afetado significativamente a largura dos padrões retangulares, a altura aumentou significativamente levando a uma redução na proporção pretendida. A padronização baseada em estêncil foi aplicada a substratos de elastômero de silício.
Os cardiomiócitos padronizados nos substratos de elastômero de silício foram visualizados por imunocitoquímica de troponina cardíaca T em baixa ampliação e por proteína sarcomerica alfa-actinina em alta ampliação. A padronização baseada em estêncil também foi aplicada ao padrão dois cardiomiócitos lado a lado em hidrogéis com rigidezs diferentes. A descoberta de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem e protocolos de diferenciação correspondentes tornou este um modelo humano in vitro ideal para estudar oncogênese e patogênese.
No entanto, uma grande limitação do uso do sistema IPS é a ausência de estrutura para o microambiente que tem composição bioquímica particular e rigidez para interagir com as células. A padronização pode ser combinada com microscopia de força de tração e ensaios imunocitoquímicos para caracterizar a estrutura e função dos cardiomiócitos. A análise dos tipos de células derivadas do IPS, no nosso caso cardiomiócito, em uma morfologia mais fisiológica abre oportunidades para estudar cardiomiócitos desafiadores no prato de cultura.
A técnica também pode ser aplicada a muitos outros sistemas, como placas de triagem de alto conteúdo. A forma e o substrato podem ser prontamente ajustados à aplicação.
