Este método nos permite projetar hidrogéis de colágeno 3D com níveis controlados de alinhamento de fibras para modelar ambientes encontrados em tecidos saudáveis e doentes do corpo. Esta técnica fornece uma abordagem microfluídica simples para projetar hidrogéis de colágeno alinhados, introduzir células e quantificar como as células se comportam em ambientes 3D topograficamente definidos. Demonstrando o procedimento estarão Neil Joshi, Mehran Mansouri, Ann Byerly e Justin Vidas para o meu laboratório.
Para começar, monte uma folha PDMS de 250 micrômetros de espessura em um suporte de plástico e corte o design microfluídico usando um cortador artesanal a uma profundidade de lâmina de 0,5 milímetros, velocidade de um centímetro por segundo e alta força. Usando um banho ultra-sônico, limpe os recortes do canal microfluídico por cinco minutos. Enxágue os canais sonicados em água deionizada e seque-os em uma placa quente a 100 graus Celsius por cinco minutos.
Guarde os canais em uma placa de Petri limpa e coberta até o uso. Para fabricar a camada de cobertura PDMS e funcionalizar a superfície para futuras modificações, prepare uma solução de 2% de aminopropiltrietoxisilano em um copo de vidro adicionando um mililitro de aminopropil trietoxisilano a 49 mililitros de acetona. Em seguida, diluir uma solução de glutaraldeído a 25% a 5% em água deionizada.
Faça dois mililitros de solução para cada 24 milímetros por 50 milímetros de tampa deslizante. Limpe as tampas em um sonicador de banho por cinco minutos usando IPA. Enxágue o IPA das lamínulas da tampa com água deionizada.
Uma película lisa de água na tampa indica que o IPA está completamente enxaguado. Seque a tampa desliza em uma placa quente por cinco minutos a 100 graus Celsius. Coloque as tampas secas em placas de Petri limpas, garantindo que elas não se sobreponham.
Usando uma varinha de descarga corona, exponha as tampas a uma descarga corona por um minuto cada. Remova as lamíneas da tampa dentro de cinco minutos após a exposição à coroa e mergulhe cada deslizamento da tampa na solução de aminopropiltrietoxisilano por 10 segundos, garantindo que a tampa fique submersa Em seguida, remova as lâminas da tampa da solução de aminopropiltrietoxisilano, mergulhe-as em acetona por 10 segundos e seque-as com ar comprimido. Coloque a tampa seca de volta na placa de Petri, com o lado tratado virado para cima.
Pipetar um mililitro de solução de glutaraldeído na superfície de cada lamínula. Cubra o máximo de superfície possível sem permitir que a solução se espalhe sobre a borda da tampa. Deixe a tampa em contato com a solução por 30 minutos e, em seguida, enxágue com água deionizada por 20 segundos.
Seque as tampas usando ar comprimido e coloque-as de volta nas placas de Petri, o lado tratado com plasma para cima Para cortar a laser a base magnética modular, corte os desenhos da camada de PMMA usando configurações de laser apropriadas, como o número de passadas e a potência. As configurações do laser devem ser ajustadas para que os ímãs possam ser pressionados na camada de PMMA. Lave a parte cortada a laser usando água e sabão para remover os detritos do processo de corte a laser.
Não use solventes, pois eles podem propagar micro-fissuras nas bordas cortadas a laser. Para montar a plataforma, empurre ímãs manualmente para a base cortada a laser. A espessura dos ímãs deve ser menor do que a espessura da base de PMMA para garantir que os ímãs estejam nivelados com a superfície da base.
Retire o suporte do adesivo sensível à pressão, ou folha de PSA, e prenda a base a uma tampa tratada com glutaraldeído com o lado funcionalizado voltado para cima. Coloque suavemente o recorte do canal PDMS na cavidade definida pelo quadro. Pressione para baixo com pinças de ponta larga para remover bolhas de ar e garantir contato conforme.
Coloque a albumina de soro bovino ou a tampa do canal tratado com BSA em cima do recorte do canal com o lado BSA voltado para baixo. Verifique se as portas de entrada e saída de fluido estão alinhadas com o canal. O aparelho está pronto para a injeção de colágeno I.
Coloque uma bomba de seringa, uma seringa estéril resfriada, uma solução de colágeno I neutralizado resfriada e uma agulha de bloqueio luer de ponta angular estéril de 20 graus de calibre 90 graus em um armário de biossegurança. Coloque a solução de colágeno I na seringa, evitando bolhas. Fixe a ponta da agulha à seringa, carregue a seringa na bomba da seringa, com a agulha virada para baixo e prima a agulha com solução de colagénio I.
Ajuste a bomba de seringa para a taxa de fluxo necessária entre 50 a 2.000 microlitros por minuto. Coloque os canais PDMS preparados em um macaco de laboratório e nivele com a agulha. Insira a agulha na porta de entrada do canal PDMS.
Injete o canal até que uma gota de 30 microlitros de colágeno eu colete no lado de saída. Abaixe o macaco de laboratório e separe suavemente a agulha do canal recém-preenchido. Repita até que todos os canais tenham sido preenchidos com solução de colágeno I.
Coloque os canais preenchidos nas placas de Petri ao lado de um lenço limpo e sem fiapos saturado com água deionizada para evitar a desidratação do gel de colágeno I recém-formado. Tampe a placa de Petri e coloque os canais carregados na incubadora por duas horas antes da etapa de descascamento. Para o peel-off e equilíbrio do meio, comece retirando a tampa do PDMS usando uma pinça para expor o gel de colágeno I polimerizado.
Adicione 650 microlitros de meio de crescimento endotelial ao poço. Alternativamente, conecte outro módulo para introduzir uma camada adicional de colágeno ou fornecer recursos de perfusão de mídia. Deixe os dispositivos na incubadora por no mínimo quatro horas para equilibrar o gel e o meio.
Substitua a mídia antes de semear por células. A funcionalização da tampa de vidro permitiu a decolagem do canal e a funcionalização da tampa PDMS com BSA impediu a fixação do colágeno I. O alinhamento das fibras de colágeno I permaneceu inalterado após a retirada da cobertura.
Imagens das HUVECs cultivadas no segmento alinhado da matriz mostraram maior alinhamento das fibras de actina em comparação com as HUVECs no segmento com fibras aleatórias. Nossa abordagem nos permite modelar o microambiente tumoral e quantificar como diferentes tipos celulares respondem. Também podemos introduzir canais de fluxo para apoiar experimentos de longo prazo.
