O procedimento para analisar e classificar Streptomyces peletes a partir de um de dois dias de idade, a cultura cresceu de líquido encontra-se esquematicamente representado na Figura 1. Detalhes sobre o método são dadas abaixo. 1. Crescimento (incluindo a preparação de Mídia e amortecedores) <ol><li> Prepare 1 L de 10x tampão fosfato salino (PBS, 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2,4 g de KH 2 PO 4 em 1 L de água destilada ajustada a pH 7,4). No momento da utilização, adicionar 100 ml de 10x de PBS a 900 ml de água destilada para se obter 1 L de PBS. </li><li> Prepare 1 litro de meio YEME (3 g de extracto de levedura Disco, 5 g de Bacto peptona, 3 g de extracto de malte Oxoid, 10 g de glucose, 340 g de sacarose, água destilada até 1 L) e 100 ml de 2,5 M MgCl2. Esterilizar ambas as soluções em autoclave. Note-se que também outros meios de Streptomyces pode ser utilizado 4,14. </li><li> Adicionam-se 100 ml de meio YEME e 0,2 ml de 2,5 M MgCl2 para umaestéril balão de 250 ml Erlenmeyer equipado com molas de metal enrolada. Prepare tantos balões como amostras de bactérias para estudar. </li><li> Inocular cada frasco com 10 8 esporos de Streptomyces para obter uma concentração de esporos de 10 6 esporos / ml. Crescer as bactérias durante 2 dias a 30 ° C, agitando a 180 rpm. </li></ol> 2. Amostragem <ol><li> Transferir uma amostra de 5 ml de cada cultura para um tubo Falcon de 15 ml usando uma pipeta de 5 ml estéril. Agite suavemente a cultura, tendo a amostra para assegurar que a amostra é representativa de toda a cultura. </li><li> Quando as amostras são analisadas imediatamente com COPAS não são necessárias etapas de preparação da amostra. Manter a amostra em gelo e vá para o passo 3.1 do presente protocolo. Quando as amostras são analisadas em um ponto de tempo depois, fixar os peletes como descritos nos passos 2,3-2,5 deste protocolo. Note-se que a fixação também impede o crescimento das bactérias no sistema de tubagem, quando não adequadamente limpos após Analyses. Certifique-se de que a fixação com formaldeído não está dificultando análises a jusante. Por exemplo, o ARN não pode ser isolado a partir de pelotas de fungos após fixação com formaldeído. Em contraste, o ARN foi isolado com sucesso após a fixação com etanol a 70% 12. </li><li> Adicionar 600 ul de 37% de formaldeído a 5 ml de amostra e misturar por inversão do tubo de 3x. Fixar as amostras em gelo durante 30 min. </li><li> Centrifugar as amostras a 2500 x g num rotor fixado a 4 ° C durante 10 min. Remover cuidadosamente o sobrenadante e lava-se as peletes com 5 ml de PBS. </li><li> Repetir o passo 2.4, de modo que as peletes são lavadas 2x com PBS. As amostras podem ser armazenadas em PBS a 4 ° C durante várias semanas. </li></ol> 3. Análise COPAS <ol><li> Verifique se o COPAS Além disso, a bomba, o computador eo laser de argônio de 488 nm estão ligados e iniciar o software Biosort. Embora ligado, o laser será ainda em modus espera. </li><li> Verifique se o frasco de fluido do invólucro está cheio eofrasco de resíduos está vazio. </li><li> Clique em &#39;Start&#39; e depois em &#39;RUN&#39; para ligar o laser de argônio de 488 nm da espera para diante. Depois de aproximadamente 60 segundos, quando o laser estiver ligado, clique em &quot;Concluído&quot;. </li><li> Verifique os medidores de pressão. As pressões para &#39;bainha&#39;, &#39;Amostra&#39;, &#39;classificador&#39; e &#39;limpa&#39; deve ler em torno de 4,0, 0,5, 2,7 e 10,9, respectivamente. </li><li> Clique na caixa de seleção ao lado de &quot;OK Pressão &#39;. O sistema, então, prepara a célula de fluxo e está pronto para uso. </li><li> Configurações padrão são assumidos com a &#39;Atraso&#39; em 11 e &#39;Largura&#39; 7. Os limites são fixados em 50 para &quot;sinal&quot; e 40 para &quot;TOF mínima», com TOF representando o vôo do tempo de serviço. (Para completar: todos os &#39;ganhos&#39; são definidos em 1, o gatilho está definido para EXT (Extinção) e no separador &quot;Configuração&quot; em &quot;Escolha taxa de varredura &#39;2,50 MHz é escolhido Coincidência é definido como&#39; avançado &#39;.). </li><li> Retire a água restante do copo de amostra de umad adicionar 0,1 ml de amostra Streptomyces do passo 2.2 ou 2.5 no copo juntamente com PBS (cerca de 50 ml). Verifique se o copo de amostra está bem fechada. </li><li> Clique em &#39;Acquire&#39; para iniciar a coleta de dados. Gerenciar a velocidade do fluxo de obter entre 30-50 eventos por segundo. Se o caudal for demasiado elevado, adicionar PBS para o copo de amostra. Se a velocidade de escoamento é muito baixa, adicionar mais amostra. </li><li> Quando pelo menos 2.500 eventos são coletados clique &#39;STOP&#39;. Para salvar todos os dados, clique em &quot;Loja&quot; e salve o arquivo para posterior análise estatística. O software Biosort vai salvar os dados em quatro arquivos, dos quais apenas o arquivo txt. Será utilizado para a análise posterior. </li><li> Limpar o copo de amostra através da remoção da amostra com uma seringa de 50 mL e lavar com 2x água. </li><li> Repita os passos 3,7-3,10 até são analisadas todas as amostras. </li></ol> 4. Análise de Dados <ol><li> Abra o arquivo txt. E descarte de dados com uma EXT inferior a 25 (usando, por exemplo, MS Excel). Estecorresponde a restos e fragmentos de hifas soltas (por Aspergillus niger todos os dados com uma EXT inferior a 150 são descartados) 4,12. Em seguida, salve todos os TOFS em uma coluna em uma planície de arquivos (para muitos arquivos de dados que pode ser automatizado na linguagem de programação R, disponível em: &#39;txt&#39;. <a href="http://www.r-project.org">http://www.r-project.org</a> ). </li><li> Certifique-se de SciLab (versão 5.3.2 ou mais recente de http://www.scilab.org/) é instalado juntamente com a biblioteca &quot;fittools &#39;, que está disponível, juntamente com o manual, a partir de: http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual% 20fittools.pdf </li><li> Iniciar SciLab e executar as funções necessárias da biblioteca fittools para modelar os dados. Em suma: Instalar a biblioteca fittools como mostra o manual (só precisava de uma vez). <ol><li> Carregar a biblioteca fittools. </li><li> Leia os dados (arquivos &quot;. Txt &#39;) no Scilab. </li><li>Entrar transformar os dados (log natural é a função de log padrão). </li><li> Coloque o modelo de 2 populações aos dados. </li><li> Traçar uma curva com o histograma e modelo (opcional). </li><li> Bootstrap os dados (1000 repetições). </li><li> Ajustar o modelo para os conjuntos de dados bootstrap. </li><li> Seja o intervalo de confiança estimativas dos parâmetros 5. Isto irá fornecer informações sobre a fração de participação (p) das populações, os seus dois meios (μ 1 e μ 2) e os desvios-padrão de acompanhamento (α 1 e α 2). Além disso, os intervalos de confiança de 95% são determinados por remontagem com o modelo, depois bootstrapping (1000 repetições) 12,13,15. Quando os intervalos de confiança a que os meios não se sobrepõem e o intervalo de confiança de p está entre 0,025-0,975 o conjunto de dados pode ser explicada como uma combinação de duas populações de distribuições normais. (Nota tha fracção a participação de pequenas peletes é p, enquanto a participação de grandes aglomerados é 1 -. p) A relação entre o TOF e o diâmetro de uma pastilha de Streptomyces é igual a 0,57 × TOF + 159 mM 4. </li></ol></li><li> No caso de duas populações são encontradas uso das TOFS média como classificação parâmetros na COPAS como limites superior e inferior para classificar os pequenos e grandes pelotas posteriormente. Note-se que também os outros parâmetros de classificação podem ser seleccionadas em função das exigências do utilizador. </li></ol> 5. Pellet Sorting <ol><li> Carregar a amostra de Streptomyces que precisa de ser classificados como descrito no passo 3.7. </li><li> Definir &#39;Classificando Limites &quot;e fornecer detalhes sobre o mínimo (Lo) e máxima (Hi) valores TOF. Como alternativa, defina uma área, selecionando &#39;Regiões&#39; e depois &#39;Definir Portão Região&#39; para selecionar as bolinhas com as dimensões ou propriedades desejadas. </li><li> Coloque um tubo de 50 ml acoletar várias pastilhas que atendam aos parâmetros de classificação. Em alternativa, uma placa de micro-titulação pode ser usado para classificar peletes individuais. Vários pelotas (10 4 -10 5) são necessários para DNA e extração de proteínas. Uma única pastilha é suficiente para a análise de qPCR da expressão do gene, mas vários pelotas são necessários para RNA seqüenciamento. </li><li> Decida e definir o número de peças que precisam ser resolvidas e clique em &quot;Ordenar manualmente&quot; para classificar para os parâmetros selecionados. Quando a quantidade definida de peletes é atingido, a triagem termina automaticamente. </li><li> Remover sobra amostra com uma seringa de 50 ml do copo de amostra e lavar o copo com água 2x. Repita os passos de 5,1-5,5 se outras amostras precisam ser classificados. </li><li> Antes de encerrar as COPAS lave o copo de amostra com água para remover as pedras que faltam e limpar o copo de amostra com etanol 70% e / ou 2% de hipoclorito na água. Executar uma amostra de água clorada para limpar todo o sistema e repita isso com água. Vazio tele transbordar recipiente e limpe ou substitua o filtro que reside neste recipiente. </li><li> Quando terminar, clique em &#39;STOP&#39; para liberar a pressão do sistema. Quando o motor pára fechar o programa e clique em &quot;Shutdown sem purgação. Em seguida, desligue o computador, o COPAS, o laser, ea bomba. </li></ol>

<ol>
	<li>Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers. , (2007).</li><li>van Wezel, G. P., McDowall, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+the+secondary+metabolism+of+Streptomyces:+new+links+and+experimental+advances.">The regulation of the secondary metabolism of Streptomyces: new links and experimental advances.</a> Nat. Prod. Rep. 28, 1311-1333 (2011).</li><li>Ann&#233;, J., Maldonado, B., Van Impe, J., Van Mellaert, L., Bernaerts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+production+and+streptomycetes.">Recombinant protein production and streptomycetes.</a> J. Biotechnol. 158, 159-167 (2012).</li><li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+two+distinct+mycelial+populations+in+liquid-grown+Streptomyces+cultures+using+a+flow+cytometry-based+proteomics+approach.">Analysis of two distinct mycelial populations in liquid-grown Streptomyces cultures using a flow cytometry-based proteomics approach.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 96, 1301-1312 (2012).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Bistability Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=epigenetics,+and+bet-hedging+in+bacteria.">epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).</li><li>Davey, H. M., Winson, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+flow+cytometry+to+quantify+microbial+heterogeneity.">Using flow cytometry to quantify microbial heterogeneity.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 5, 9-15 (2003).</li><li>Betz, J. W., Aretz, W., H&#228;rtel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+flow+cytometry+in+industrial+microbiology+for+strain+improvement+programs.">Use of flow cytometry in industrial microbiology for strain improvement programs.</a> Cytometry. 5, 145-150 (1984).</li><li>Bell, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flow+cytometric+method+for+rapid+selection+of+novel+industrial+yeast+hybrids.">A flow cytometric method for rapid selection of novel industrial yeast hybrids.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 1669-1672 (1998).</li><li>Pulak, R., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+analysis,+sorting,+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system.">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> C. elegans: methods and applications. , 275-286 (2006).</li><li>Buszczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carnegie+protein+trap+library:+a+versatile+tool+for+Drosophila+developmental+studies.">The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies.</a> Genetics. 175, 1505-1531 (2007).</li><li>Carvalho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screen+for+tuberculosis+progression.">A high-throughput screen for tuberculosis progression.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>de Bekker, C., van Veluw, G. J., Vinck, A., Wiebenga, L. A., W&#246;sten, H. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+Aspergillus+niger+microcolonies+in+liquid+shaken+cultures.">Heterogeneity of Aspergillus niger microcolonies in liquid shaken cultures.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1263-1267 (2011).</li><li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+liquid+shaken+cultures+of+Aspergillus+niger+inoculated+with+melanised+conidia+or+conidia+of+pigmented+mutants.">Heterogeneity in liquid shaken cultures of Aspergillus niger inoculated with melanised conidia or conidia of pigmented mutants.</a> Stud. Mycol. 74, 47-57 (2013).</li><li>Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Streptomyces Genetics. , (2000).</li><li>Vinck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyphal+differentiation+in+the+exploring+mycelium+of+Aspergillus+niger.">Hyphal differentiation in the exploring mycelium of Aspergillus niger.</a> Mol. Microbiol. 58, 693-699 (2005).</li><li>Reichl, U., King, R., Gilles, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pellet+morphology+during+submerged+growth+of+Streptomyces+tendae+by+image+analysis.">Characterization of pellet morphology during submerged growth of Streptomyces tendae by image analysis.</a> Biotechnol. Bioeng. 39, 164-170 (1992).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A citometria de fluxo permitiu a análise em alta velocidade de um grande número de células individuais, o que contribuiu para a nossa compreensão da heterogeneidade em populações clonais 6. Citometria de fluxo regular não é viável para a análise das pelotas de micélio multicelulares de estreptomicetos e fungos. O nosso trabalho mostrou que a análise de alto rendimento de peletes de Streptomyces é viável utilizando COPAS. O procedimento descrito aqui é simples, rápido e altamente reprodutível. O parâmetro fundamental para manter em mente durante a operação do instrumento é a velocidade do fluxo, o que não deve exceder os 100 eventos / s (passo 3.8 do presente protocolo). Se a concentração de sedimento, e, por conseguinte, também a velocidade de escoamento, torna-se demasiado elevado, os valores de TOF será calculado mal porque o instrumento não detectar peletes individuais. Suficientemente diluindo a amostra por adição de PBS supera este problema. Limitações O uso COPAS Mais<html> d aqui tem um diâmetro de bocal de 1 mm, o que é adequado para medir partículas com um tamanho variando 30-700 mM. Por conseguinte, este bocal permite medir pelotas formadas por estreptomicetes. No caso de fungos filamentosos as micro-colónias pode ser maior, o que limita a aplicabilidade geral do COPAS Plus. O COPAS XL pode medir partículas de até 1.500 uM de tamanho, mas a sua sensibilidade na gama inferior de diâmetro é menor em comparação com a do COPAS Plus. Tanto o COPAS Plus e do COPAS XL não pode analisar partículas menores do que 30 mm. Isto implica que os esporos microbianas individuais ou células não pode ser analisado. Além disso, o COPAS não pode analisar com precisão pequenos agregados de células ou esporos e as muito pequenas micro-colónias. Por isso, os analisadores de célula regulares deve ser usado. Esta limitação é ultrapassada pela Biosorter da União biométrica, que pode analisar partículas na gama de 1-1,500 fim. O prêmio de compra, porém, é superior. t &quot;&gt; Solução de problemas O COPAS é um instrumento robusto que é fácil de operar. No entanto, às vezes pelotas não são detectados após o carregamento de uma amostra no copo de amostra e iniciar a medição. A causa é tipicamente um tubo de entrada entupida, o que pode ser facilmente resolvido premindo o comando &quot;limpa&quot;. Isso vai forçar as pelotas de volta do sistema de tubulação para o copo de amostra. Uma razão alternativa pode ser que a tampa não está correctamente colocado no recipiente de amostra. Isto leva à perda de pressão e o fracasso concomitante para detectar peletes. Significado e direções futuras Nós aqui focado na análise do tamanho da pelota, mas a configuração COPAS também é capaz de analisar e classificar com base em fluorescência e densidade. Detecção de fluorescência nos permite analisar a expressão gênica baseada em jornalistas como GFP. Além disso, a composição das células pode ser avaliada. Ainda mais potente é a opção para separar pastilhas de acordo com estes parâmeters. Grânulos classificados podem ser usados ​​para as análises a jusante, incluindo todos os estudos-genómica. De fato, anteriormente classificadas 60.000 grandes e 200.000 pequenas pelotas, e demonstrou que o proteoma foi significativamente diferente entre grandes e pequenas pelotas 4. Assim, esta tecnologia fornece novas pistas para melhorar estreptomicetos como fábricas celulares. O principal benefício da tecnologia COPAS é o tempo. Estudos anteriores sobre os sedimentos celulares foram realizadas utilizando a microscopia, e isto limita o número de aglomerados que podem ser analisadas até várias centenas 16. Estudos de microscopia já sugeriu a existência de duas populações de pelotas em Streptomyces culturas adulto líquidos 16. Na verdade, duas populações de peletes foram detectadas independentemente das condições de cultura, em um grande número de diferentes estreptomicetos 4. Esta heterogeneidade de tamanho não é restrita a estreptomicetos filamentosos, mas também foi observada em fungos filamentosos 12 &lt;/ Sup&gt;. Em todos os casos, os mecanismos subjacentes à heterogeneidade ainda não são conhecidas. A possibilidade de classificar pastilhas de acordo com o tamanho e a fluorescência nos permite desvendar tais mecanismos.

Streptomycetes são bactérias filamentosas do solo que são bem conhecidos pela sua aptidão para fazer antibióticos, bem como os compostos que podem ser utilizados como agentes imunossupressores ou para combater infecções fúngicas ou 1,2 cancro. Além disso, estes organismos produzem enzimas que são de interesse para uma grande variedade de aplicações industriais 3. A maioria destes compostos comercialmente interessantes são produzidas em bioreactores. Crescimento de estreptomicetos em biorreactores é caracterizada pela formação de estruturas complexas de hifas interligado, conhecidos como aglomerados ou peletes. Estas estruturas multicelulares são altamente heterogênea em relação ao tamanho 4 e pode chegar a tamanhos que são mais de um milhão de vezes maior do que uma bactéria unicelular, como Escherichia coli, Bacillus subtilis. Apesar da heterogeneidade é considerada como uma característica benéfica em sistemas biológicos naturais 5, considera-se uma armadilha de produção na indústria. Biocultivos reator tem que ser reproduzível e controlável para obter os maiores rendimentos possíveis. Uma compreensão detalhada do papel de cada um dos tipos de pelotização em um biorreator, é fundamental para melhorar estreptomicetos como uma fábrica de células. A citometria de fluxo é utilizada para analisar as células individuais de uma população de 6. Cytometers fluxo podem adquirir informações multiparamétrica por características das células (como tamanho, densidade e multicolor de fluorescência) medir simultaneamente. Desta forma, as propriedades das células pode ser correlacionada contribuindo assim para a nossa compreensão da heterogeneidade dentro de uma cultura e a existência de populações distintas de células 6. Instrumentos mais especializados tornaram possível classificar as células de acordo com os parâmetros definidos pelo usuário. Por exemplo, os mutantes podem ser rastreados. Após a separação, tais células mutantes podem ser cultivadas para posterior caracterização. Isso já provou ser útil, entre outros,para melhorar a produtividade de linhagens 7,8. Os bicos de citómetros de fluxo geralmente permitem a passagem de células, com um diâmetro máximo de cerca de 10 um. Por isso, os aglomerados de estreptomicetos não podem ser analisados ​​com os citómetros de fluxo normal. Eles, no entanto, podem ser analisados ​​com o Complexo Objeto Parametric Analyzer e Sorter (COPAS). Como cytometers fluxo regulares, COPAS pode adquirir dados multiparamétricos de partículas de uma maneira alta taxa de transferência. Dependendo do tipo de COPAS 10-1,500 mM partículas de tamanho podem ser analisados. Além disso, ele permite a triagem de partículas individuais que podem ser utilizados para o cultivo ou análises a jusante, tais como o isolamento do ADN, ARN, ou proteínas. COPAS foi inicialmente concebido para a análise e classificação de pequenos organismos multicelulares, como os nematóides Caenorhabditis elegans 9 e embriões de Drosophila e larvas 10. Os instrumentos também têm sido utilizados para um peixe-zebra 11ª para filamentosas 12,13 fungos. Os últimos organismos também formar peletes miceliais que são ainda maiores do que aqueles formados por bactérias filamentosas. Nós demonstramos recentemente que o uso de COPAS também é viável para estreptomicetes 4. Nós aqui descrever o procedimento experimental para utilizar as COPAS avaliar heterogeneidade sedimento em Streptomyces coelicolor, incluindo detalhes sobre a metodologia para classificar pelotas acordo com o tamanho. Por favor note, contudo, que este método também pode ser utilizado para a análise de outros estreptomicetos formador de pelota.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="992">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Copas PLUS</td>
			<td style="width:183px;">Union Biometrica</td>
			<td style="width:119px;">PLUS</td>
			<td style="width:479px;">Large particle flow cytometer including lasers and software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3264</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difco Yeast Extract</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>210933</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxoid Malt Extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OXLP0039B</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Media components. Add after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:212px;">Formaldehyde Solution</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td style="width:479px;">Fixation of pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hypochlorite Solution&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">71696</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EtOH</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20816.367</td>
			<td>For cleaning of the instrument</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:212px;">Erlenmeyer Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td>214-1132</td>
			<td>Culture flask for growing Streptomyces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Springs</td>
			<td style="width:183px;">Verenfabriek De Spiraal</td>
			<td style="width:119px;">Custom-Made</td>
			<td>Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Sterile Centrifuge Tube (15 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Syringes (50 ml)</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td>Z683698&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sorting of streptomyces cell pellets using a complex object parametric analyzer and sorter

Streptomycetes são bactérias filamentosas do solo que são utilizados na indústria para a produção de enzimas e antibióticos. Quando cultivadas em biorreactores, estes organismos formar redes de hifas interligado, conhecido como peletes, que são heterogéneos no tamanho. Aqui nós descrevemos um método para analisar e pelotas tipo de micélio usando um objeto complexo Parametric Analyzer e Sorter (COPAS). Instruções detalhadas são dadas para a utilização do instrumento e a análise estatística dos dados de base. Nós ainda descrever como pelotas podem ser classificados de acordo com as configurações definidas pelo usuário, o que permite o processamento a jusante, como a análise do RNA ou proteína. Usando esta metodologia o mecanismo de crescimento heterogêneo subjacente pode ser combatida. Isto irá ser útil para melhorar estreptomicetos, como uma fábrica de células, considerando o facto de que a produtividade se correlaciona com o tamanho da pastilha.

Medições Copas de pelotas de Streptomyces Estreptomicetos formar peletes do micélio em culturas líquidas, que têm uma ampla gama de tamanhos. Para analisar a distribuição de tamanho de sedimento, um líquido de dois dias de idade, cultivadas Streptomyces coelicolor cultura foi submetida a grande fluxo de partículas de citometria usando um COPAS Profiler Além disso equipado com um bocal de 1 mm. A saída típica COPAS é um gráfico de dispersão, como visualizado na Figura 2A. O eixo dos x representa o tempo-de-voo (TOF), que se correlaciona com o tamanho da pastilha (isto é, leva mais tempo para pastilhas de maior dimensão para passar o feixe de laser). O eixo y mostra a extinção, que representa a densidade óptica do objecto. Cada ponto no gráfico de dispersão corresponde a um evento individual, ou seja, uma única pelete passar o feixe de laser. É importante ressaltar que quando a amostra é muito concentrada (ou seja, quando o laser detecta mais de 100 eventos / s), o COPAS freqüentemente não consegue detectar indivíduo pellets. Isto leva a valores TOF falsos que são demasiado elevados. A diluição da amostra reduz os valores médios TOF, até um ponto em que uma maior diluição já não faz impacto TOF. Este ponto é atingido quando foram analisados ​​cerca de 100 pelotas / seg. Traçando os pontos de dados em um histograma indica que os tamanhos não estão normalmente distribuídos (Figura 2B). A distribuição parece estar inclinado para a direita. Log transformando o conjunto de dados também não conduziu a uma distribuição normal (Figura 2C). Para avaliar se a distribuição de tamanho pode ser explicado assumindo que uma mistura de duas distribuições normais os dados foram modelados matematicamente 12,15. Modelação de facto indicou que a distribuição de tamanho pode ser explicado assumindo que a existência de duas populações distintas de peletes. A população de pequenos peletes consistiu de 92% de todos os peletes com um tamanho médio de 248 um, enquanto que a população de grande pelpermite (8% de todas as pastilhas) tinha um tamanho médio de 319 um (note que duas populações são assumidos de existir quando a fracção de participação é entre 2,5-97,5%). Classificando de pelotas de Streptomyces acordo com o tamanho Micro-colônias das populações de grandes e pequenas pelotas foram ordenados. Para este fim, os tamanhos médios de aglomerados de duas populações foram utilizados para definir os limites para a triagem. Pellets menores do que 248 um foram considerados a partir da pequena população pelota, ao passo que os pontos maiores do que 319 um foram considerados a partir da grande população de sedimento (Figura 3), de modo a limitar a triagem de peletes a partir da porção de sobreposição das duas tamanho distribuições. A análise microscópica dos peletes ordenados mostrou seus tamanhos distintos (Figura 3). Os peletes recolhidos podem ser ainda utilizados para o ADN, ARN, ou isolamentos de proteínas. &lt;img alt = &quot;Figura 1&quot; fo: content-width = &quot;5 polegadas&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Representação esquemática da instalação experimental para medir e analisar pelotas Streptomyces usando COPAS. Para mais detalhes, consulte os procedimentos experimentais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2.jpg" /> Heterogeneidade Figura 2. Tamanho da pelota em culturas de Streptomyces adulto líquidos. Análise COPAS de S. 2 dias de idade cultura coelicolor YEME (A) indica que os tamanhos de pelotização (indicados como Time of valores vôo) são, normalmente, não distribuird (B), e também não tornar-se assim, quando transformado em registo (C). Em vez disso, foram detectadas duas populações de pelotas que diferem em TOF (e, portanto, tamanho). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3.jpg" /> Figura 3. O fraccionamento de peletes de acordo com o tamanho de Streptomyces. Peletes com um tamanho menor do que 248 um (indicado na rosa) foram consideradas pequenas peletes, que as peletes com um tamanho maior do que 319 um (indicado em azul) foram considerados como grandes aglomerados. A análise microscópica confirmou a diferença de tamanho. Note-se que estes tamanhos foram calculados a partir de dados log-transformados utilizando a relação descrita entre TOF e a diameter de uma bolinha de Streptomyces, o que equivale a 0,57 × TOF + 159 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter at JoVE.com

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Adulto líquidos culturas de Streptomyces são caracterizados por pelotas de micélio que são heterogêneos em tamanho. Nós aqui descrever um método para analisar e classificar essas pelotas de uma forma de alto rendimento. Essas pelotas podem ser usados ​​para análises posteriores, que irá fornecer pistas para compreender e controlar a heterogeneidade do crescimento.

Classificando de<em&gt; Streptomyces</em&gt; pellets de células usando um objeto complexo Parametric Analyzer e Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

sorting-streptomyces-cell-pellets-using-complex-object-parametric

Research

JoVE Journal

Biology

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

10.9K visualizações.  Leiden University.  Adulto líquidos culturas de Streptomyces são caracterizados por pelotas de micélio que são heterogêneos em tamanho. Nós aqui descrever um método para analisar e classificar essas pelotas de uma forma de alto rendimento. Essas pelotas podem ser usados ​​para análises posteriores, que irá fornecer pistas para compreender e controlar a heterogeneidade do crescimento. 

Vídeo: Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes. The device consists of three layers: first layer contains an array of microscale wells (500 &mu;m diameter and 150 &mu;m depth) that help to immobilize the islets while exposed to flow and maximize the exposed surface area of the islets; the second layer contains a circular perifusion chamber (3 mm deep, 7 mm diameter); and the third layer contains an inlet-mixing channel that fans out before injection into the perifusion chamber (2 mm in width, 19 mm in length, and 500 &mu;m in height) for optimizing the mixing efficiency prior to entering the perifusion chamber. The creation of various glucose gradients including a linear, bell shape, and square shapes also can be created in the microfluidic perifusion network and is demonstrated.

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes.

A Multi-Parametric Sistema Perifusion Islet dentro de um dispositivo Perifusion microfluídicos

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...

Biologia

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Separação de células de fluorescência Activated de Protoplastos Usina

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Cromatografia de afinidade lipídica mediada por vesículas com separação de células Magnetic Ativado (LIMACS): um novo método para analisar proteínas lipídios Interação

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Análise de célula específico<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Folhas utilizando ordenação células activadas por fluorescência

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimizado coloração e Proliferação Métodos de Modelagem para Monitoramento Divisão Celular usando Corantes Rastreamento celulares

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

A Plataforma de Produção de Proteína Complexo MultiBac no EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Análise de partícula única open-source para Microscopia Super-resolução com VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the mechanisms are not well understood. To investigate coral response to stressors, we need tools for analyzing cellular responses. In particular, we need tools that facilitate the application of functional assays to better understand how cell populations are reacting to stress. In the current study, we use fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate and separate different cell populations in stony corals. This protocol includes: (1) the separation of coral tissues from the skeleton, (2) creation of a single cell suspension, (3) labeling the coral cells using various markers for flow cytometry, and (4) gating and cell sorting strategies. This method will enable researchers to work on corals at the cellular level for analysis, functional assays, and gene expression studies of different cell populations.

Corals create biodiverse ecosystems important for both humans and marine organisms. However, we still do not understand the full potential and function of many coral cells. Here, we present a protocol developed for the isolation, labeling, and separation of stony coral cell populations.

Classificação celular ativada pela fluorescência para o isolamento de populações celulares escleracianas

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, prevent fracture. In the interest to both optimize peak bone mass and combat various musculoskeletal diseases (i.e., post-menopausal osteoporosis, anorexia nervosa, type 1 and 2 diabetes mellitus), incredible efforts have been made in the field of bone biology to fully characterize osteoblasts throughout their differentiation process. Given the primary role of mature osteoblasts to secrete matrix proteins and mineralization vesicles, it has been noted that these processes take an incredible amount of cellular energy, or adenosine triphosphate (ATP). The overall cellular energy status is often referred to as cellular bioenergetics, and it includes a series of metabolic reactions that sense substrate availability to derive ATP to meet cellular needs. Therefore, the current method details the process of isolating primary, murine bone marrow stromal cells (BMSCs) and monitoring their bioenergetic status using the Real-time cell metabolic flux analyzer at various stages in osteoblast differentiation. Importantly, these data have demonstrated that the metabolic profile changes dramatically throughout osteoblast differentiation. Thus, using this physiologically relevant cell type is required to fully appreciate how a cell's bioenergetic status can regulate the overall function.

Real-time cell metabolic flux assay measures the oxygen consumption rate and extracellular acidification rate, which corresponds to mitochondrial and glycolytic adenosine triphosphate production, using pH and oxygen sensors. The manuscript explains a method to understand the energy status of osteoblasts and the characterization and interpretation of the cellular bioenergetic status.

Usando o analisador de fluxo metabólico de células em tempo real para monitorar bioenergetics osteoblast

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids potential pitfalls caused by the heterogeneity of tissues and unleashes the powerful transcriptome analysis. The protocol described here demonstrates how to use the Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) method to isolate ribosome-bound RNAs from a small amount of EGFP-expressing cells in a complex tissue without cell sorting. This protocol is suitable for isolating cell-type-specific RNAs using the recently available NuTRAP mouse model and could also be used to isolate RNAs from any EGFP-expressing cells.

This protocol aims to isolate cell-type-specific translating ribosomal mRNAs using the NuTRAP mouse model.

Isole RNAs específicos do tipo celular de amostras de tecido heterogêneo congeladas sem triagem celular

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...