Este trabalho foi apoiado por uma concessão do NIH / NHGRI Genoma Acadêmico / Faculdade de Transição (K22 HG002908) para AMD e uma parceria estratégica entre o Instituto de Biologia de Sistemas e da Universidade de Luxemburgo. Os pedidos de estirpes ou plasmídeos devem ser dirigidas ao Aimée Dudley (aimee.dudley @ gmail.com).

1. Construção Coe e Caracterização <ol><li> Construir a estirpe diplóide heterozigótica para ser usado na transversal por meio de cruzamentos estirpes haplóides e seleccionar diplóides 2 ou utilizando uma estirpe heterozigótica que ocorre naturalmente. As cepas não deve abrigar GFP. </li><li> Confirmar que a estirpe é incapaz de crescer em meio YPD 2 + 200 ug / ml de G418. </li><li> Confirme se a tensão é capaz de esporular. MELHOR é compatível com a baixa eficiência cruzes esporulação, mas aumenta a freqüência baixa esporulação FACS tempo classificando necessário. <ol><li> Defina-se uma cultura D / N da estirpe em 5 mL de YPD e crescer com agitação a 30 ° C. </li><li> Lavar 0,5 ml da cultura O / N, três vezes com PBS (pH 7,4). </li><li> Agregar as células lavadas, remover o sobrenadante e ressuspender em 2 ml de meio de esporulação 7. </li><li> Agitar as células à temperatura ambiente e verifique diariamente para formação de tétrades usando um microscópio de luz de contraste de fase com uma objetiva de 40X. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> Estimar a viabilidade dos esporos da cruz por dissecção convencional 2,3 de um pequeno número (~ 20) de tétrades. Viabilidade Spore em cruzamentos entre diferentes contextos de tensão varia muito e de forma imprevisível. No entanto, uma expectativa a priori da viabilidade dos esporos pode ser utilizado para avaliar a eficiência de uma melhor experiência antes dos trabalho-e onerosas medidas de poupança e genotipagem das cepas. Portanto, esta etapa é altamente recomendável. </li></ol> 2. Transformação de diplóides com Biblioteca de códigos de barra dos Plasmids <ol><li> Inserir o plasmídeo com código de barras pCL2_BC na estirpe diplóide heterozigótica utilizando o protocolo de transformação descrito no Gietz e Woods 8 com as seguintes modificações. <ol><li> Depois as células foram incubadas com a mistura de transformação, a 30 ° C durante 20 min, adiciona-se DMSO a 8% do volume da mistura de transformação. A adição de DMSO foi encontrada para melhorar a eficiência de transformação in alguma tensão fundos 9. </li><li> Após o passo de choque térmico, sedimentar as células com uma breve centrifugação, decanta-se a mistura de transformação, e lavar suavemente as células em meio YPD. Em seguida, voltar a suspender as células em 1 ml de YPD e lhes permitir recuperar a RT durante 3 horas, sem agitação. </li></ol></li><li> Seleccionar transformantes por plaqueamento em YPD + G418 (200 ug / ml) em placas de agar. Para assegurar uma associação complexa de códigos de barras de plasmídeo, colher um grande número de colónias, por exemplo, placas com 5 ~ 2500 colónias por placa. </li><li> Uma vez que as colónias são visíveis (2-3 dias de crescimento a 30 ° C), juntar os transformantes por cuidadosamente raspando-os da placa em líquido YPD + G418 (200 ug / ml) + 15% de glicerol. Vortex esta suspensão celular, transferir para um frasco de criopreservação, e congelar a -80 ° C. Faça um estoque congelado separado para cada placa. Estes stocks congelados servir como as estirpes de partida para o Passo 3.1 e pode também ser usado para gerar mais tétradas numa data posterior, se desejado. </li&gt; </ol> 3. Esporulação da Biblioteca de células transformadas obter Barcoded Tetrads <ol><li> Reviver as células dos lotes congelados criados em 2,3 por crescimento S / N em 5 ml de YPD + G418 (200 ug / ml) a 30 ° C com agitação. </li><li> Lave as células a partir de O / N culturas 3x em PBS (pH 7,4) e, em seguida, voltar a suspender as células em meio de esporulação 7, com 200 ug / ml de G418. </li><li> Agitar culturas esporulação em RT e monitorar o progresso esporulação diariamente até novas tétrades pararam formando. </li><li> Uma vez que a cultura contém tétradas bem formadas e relativamente poucas duplas, remover culturas de agitação e deixar à temperatura ambiente durante pelo menos 7 dias. Enquanto alguns cruzamentos podem ser passíveis de digestão em placa e perturbações logo tétradas ter formado (avaliada como descrito em 7.3), a incubação adicional (7-10 dias nas nossas experiências) é essencial para outros cruzamentos. Portanto, esta etapa é altamente recomendável. </li></ol> 4. Estabelecero FACS Portões para Tetrad Sorting O meioticamente expressa fusão SPS2-GFP no plasmídeo pCL2_BC permite tétradas na cultura esporulação ser detectadas e isoladas a partir da cultura por meio de fluorescência. O protocolo seguinte foi desenvolvido para uma FACSAria II. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. FACS portões. Uma série de quatro portas sequenciais é utilizada para isolar as tétradas. As portas mostrado em (A) e (B) permite reduzir o número de aglomerados. Eventos fluorescentes são selecionados com o portão em (C). O histograma (D) tem dois picos. Eventos no pico esquerda são principalmente tétrades (imagem inserido à esquerda), e eventos no pico direita são geralmente tétrades com uma gema ligada (imagem ampliada direita). Um portão final éaplicada a este histograma para selecionar os eventos que são principalmente tétrades (barras vermelhas). Este valor foi modificado de Ludlow, et al 1. <ol><li> Carregue a cultura esporulado em um classificador de FACS e configurar dois de dispersão e de dispersão lateral portas para a frente para excluir detritos, as células agregadas, e várias células por gotículas (Figuras 2A e 2B). </li><li> Deve haver uma população de células fluorescentes, que quando se utiliza a construção repórter SPS2-GFP incluem duplas e 10 tétradas. Portão da GFP vs FSC para incluir esses eventos fluorescentes (Figura 2C). </li><li> Dependendo da estirpe de fundo que pode ser necessário incluir um portão adicional para remover aglomerados que incluem tétradas e outras células. Se isso for necessário, inspecionar um histograma FSC dos eventos fluorescentes e especificar um portão que inclui eventos de menor FSC (Figura 2D, os eventos fechados estão em vermelho). </li><li> Verificar a eficiência de t<html> ele gating regime classificando ~ 1.500 tétrades sobre uma lâmina de microscópio e contando a proporção de tétrades a não-tétrades usando um microscópio de contraste de fase em aumento de 400X. A percentagem de tétradas pode ser estimada com precisão pela contagem de apenas ~ 200 eventos classificados, mas triagem ~ 1500 reduz a quantidade de tempo gasto na procura de células sobre a lâmina de microscópio. Em alternativa, a razão de tétradas a não tétradas pode ser avaliada durante a etapa 4.5. </li><li> Verifique periodicamente se o classificador está relatando com exatidão o número de eventos, classificando 25 tétrades sobre uma lâmina de microscópio e examinar as células contidas na gota usando um microscópio de contraste de fase em aumento de 400X. Deve haver 25 tétradas na gotícula. Repetir 3-4x para avaliar a variação do instrumento FACS. </li></ol> 5. Seleção Tetrads para um placa de ágar &quot;width =&quot; 500 p_upload/51401/51401fig3highres.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Colocação da placa de ágar sobre o classificador de SCAF. Para classificar tétradas em uma pequena gota de solução de Zymolyase colocado no meio de uma norma (circular) da placa de ágar, um padrão de 100 mm (rectangular) placa de 96 poços é primeiro colocado na etapa da separação de células e o classificador é programado para depositar tétradas num poço específico (neste caso, D5). Em seguida, a placa de ágar circular está colocado em cima da placa de 96 poços e alinhado de modo que a queda de Zymolyase está centrada sobre o bem especificadas. <ol><li> Aquece-se a quantidade desejada de YPD + G418 (200 ug / ml) para placas de pelo menos 1,5 horas, numa incubadora a 37 ° C posicionado perto do separador FACS. </li><li> Uma característica fundamental do protocolo de classificação é a capacidade de direcionar com precisão FACS classificadas tétrades para um local específico em uma placa de ágar que contém um conjunto de solução Zymolyase. Para fazer isso, coloque um &quot;marco&quot; placa de 96 poços em tele automatizado unidade de deposição de células (ACDU) do classificador. Prepara-se uma disposição tipo que irá separar 25 tétradas para um poço de um formato de 96 poços. Escolher bem perto do meio da placa, por exemplo, bem D5. Figura 3 mostra uma placa de Petri, e placa de 96 poços carregados num seleccionador de células. Classificando 25 tétrades por placa produz colônias bem separados. </li><li> Trazer uma pilha de 10 placas de agar do incubador a 37 ° C para o classificador. </li><li> Tomar uma placa de agar e de pipeta 25 ul de uma solução de Zymolyase (1 mg / ml em 0,7 M de sorbitol) para o ágar, perto do centro da placa. Em seguida, coloque a placa no marco placa de 96 poços, alinhando a gota Zymolyase sobre o alvo bem a partir do Passo 5.2, por exemplo, bem D5. </li><li> Inicie o tipo e depositar 25 tétradas para o meio da gotícula de Zymolyase na placa de agar. Em seguida, remover e cobrir a placa. </li><li> Repita os passos 5.4 e 5.5 até 25 de tétrades foram classificadas em gotas Zymolyase em cada prato na pilha. </li&gt; <li> E volta a pilha de placas contendo tétrade à incubadora a 37 ° C. </li><li> Repita os passos 5.3 a 5.7 até que todas as placas têm tétrades. </li></ol> 6. Separando Esporos <ol><li> Incubar cada pilha de placas de agar contendo tétrade a 37 ° C durante 1,5 horas. </li><li> Remover placas da incubadora, adicione 15-25 contas estéril 3 milímetros de vidro por placa, e agitar as placas como uma pilha (ou em duas pilhas de 5 placas) por 3-5 min. A melhor separação dos esporos é conseguido movendo as placas rigidamente de lado a lado ou de frente para trás. Não mova as placas de tal forma que os grânulos de &quot;redemoinho&quot; em torno da borda externa da placa. Deixar as contas sobre as placas quando terminar. </li><li> Coloque a pilha de placas com contas de enfrentar em uma incubadora de 30 ° C. Recuperar os próximos placas de pilha da incubadora 37 ° C, e repita o Passo 6.2. </li><li> Incubar as placas de O / N a 30 ° C. </li></ol> 7. Colheita Colônias <ol><li> Depoisuma incubação O / N a 30 ° C, colónias pequenas deverão ter formado sobre as placas. Retire cuidadosamente as placas da incubadora, sem perturbar as contas de vidro. </li><li> Remover as esferas de vidro com cuidado e rapidamente invertendo as placas ao longo de um recipiente de fundo. O recipiente deve ser profundo o suficiente para pegar as contas, sem que lhes permite saltar para cima e bater a placa de ágar. Tocar no fundo da placa, enquanto que é invertido pode ajudar a desalojar os grânulos que estão presas à placa. Estes grânulos pode ser reutilizado por lavagem com sabão, lavando bem com água desionizada e esterilização em autoclave. </li><li> Contar o número de colónias em cada placa e usar o número de colónias para estimar a eficiência da separação de esporos e de recuperação. Por exemplo, 25 tétrades por placa para uma cruz com perto de 100% de viabilidade poderia render um total de 100 colônias por placa. </li><li> De placas com número suficiente de colônias (&gt; 65 para uma alta viabilidade cruzes), células de transferência de cada colony em um poço separado de uma placa de 96 poços contendo meio YPD líquido + G418. Além disso, tome nota do que poços conter colônias de uma mesma placa de ágar; esta informação será utilizada para auxiliar o software atribuição tétrade. </li><li> Use o-bem placas de 96 líquidos para semear culturas para genotipagem e para salvar cepas como ações de glicerol congelados. Detalhes sobre sequenciação RAD-tag e análise da sequência pode ser encontrada em Ludlow et ai 1. </li></ol>

<ol>
	<li>Ludlow, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+tetrad+analysis.">High-throughput tetrad analysis.</a> Nat Methods. 10, 671-675 (2013).</li><li>Rose, M., Winston, F., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics A Laboratory Course Manual. , (1990).</li><li>Morin, A., Moores, A. W., Sacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Saccharomyces+cerevisiae+asci.">Dissection of Saccharomyces cerevisiae asci.</a> J Vis Exp. 27, (2009).</li><li>Winge, O., Laustsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+two+types+of+spore+germination,+and+on+genetic+segregations+in+Saccharomyces+demonstrated+through+single+spore+cultures.">On two types of spore germination, and on genetic segregations in Saccharomyces demonstrated through single spore cultures.</a> C.R. Trav. Lab. Carlsberg Ser. Physiol. 24, 263-315 (1937).</li><li>Coluccio, A., Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspore+bridges:+a+new+feature+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+spore+wall.">Interspore bridges: a new feature of the Saccharomyces cerevisiae spore wall.</a> Microbiology. 150, 3189-3196 (2004).</li><li>Baird, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+SNP+discovery+and+genetic+mapping+using+sequenced+RAD+markers.">Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers.</a> PLoS One. 3, (2008).</li><li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li><li>Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation.">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Nucleic Acids Res. 19, 5791-57 (1991).</li><li>Gerke, J. P., Chen, C. T., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+isolates+of+Saccharomyces+cerevisiae+display+complex+genetic+variation+in+sporulation+efficiency.">Natural isolates of Saccharomyces cerevisiae display complex genetic variation in sporulation efficiency.</a> Genetics. 174, 985-997 (2006).</li><li>Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. L., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+sources+of+missing+heritability+in+a+yeast+cross.">Finding the sources of missing heritability in a yeast cross.</a> Nature. 494, 234-237 (2013).</li><li>Fogel, S., Mortimer, R., Lusnak, K., Tavares, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+gene+conversion:+a+signal+of+the+basic+recombination+event+in+yeast.">Meiotic gene conversion: a signal of the basic recombination event in yeast.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 2, 1325-1341 (1979).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Muitas áreas de investigação genética, que variam a partir de complexo de mapeamento traço 11 para o estudo dos mecanismos subjacentes da recombinação de ADN 12, exigem um número extremamente grande de descendência e grandes volumes de sequenciação de ADN. As técnicas que se casam com o poder de abordagens convencionais com a capacidade de alto rendimento de sequenciação do ADN têm o potencial para permitir estudos que foram anteriormente intratável. Apesar de vários de alto rendimento de genética de leveduras métodos têm sido aplicados de forma eficaz para problemas específicos, cada um tem limitações que ficam aquém da ampla aplicabilidade da análise tétrade convencional. MELHORES endereços estes desafios, empregando uma abordagem de alto rendimento, combinando tétrade dissecção e genotipagem da descendência de cruzamentos de leveduras. Em conjunto com multiplexado seqüenciamento RAD-tag, o BEST oferece uma maneira barata de recolher informações genótipo para cada estirpe descendência, preservando as relações tétrade por meio de códigos de barras tétrade únicas.0; De todos os métodos actualmente utilizados rendimento elevado, melhor recapitula mais de perto as informações fornecidas por uma cruz levedura dissecados manualmente. MELHOR tem duas características principais. A primeira é o uso de FACS para isolar rapidamente tétradas distância a partir de células em cultura esporulados (Protocolo Passos 5-6). A capacidade de isolar milhares de eventos fluorescentes (tetrads) dá melhor o seu maior ganho no rendimento. Esta automação proporciona uma vantagem ainda maior sobre dissecção manual para cruzamentos com baixa eficiência esporulação, devido ao aumento do tempo necessário para identificar visualmente eventos raros. A segunda característica fundamental é o uso de um código de barras molecular altamente complexa (Protocolo Etapa 2) que é transmitida para cada esporo irmã de uma tétrade. Porque estes códigos de barras pode ser usado para reconstruir as relações computacionalmente tétrade entre os esporos que foram distribuídos aleatoriamente através de uma placa de ágar, a necessidade de se manualmente as células da matriz em uma grade ordenada é aliviada. Finalmente,porque o código de barras molecular e o gene repórter da GFP específica do esporulação são fisicamente ligados (no mesmo plasmídeo), apenas tétradas que retiveram o código de barras molecular são seleccionados por separação FACS. Há duas considerações que determinam a quantidade de tempo que as culturas devem ser incubados no meio de esporulação. Primeiro, porque o repórter específico esporulação (SPS2-GFP) é expressa no início da meiose, sozinho GFP não distingue completos tétrades 4 de esporos a partir de células que não tenham concluído a meiose (ou seja, díades). Enquanto gating FACS adicional pode diminuir o número de fluorescentes, tétrades incompletos, a maneira mais fácil de diminuir esses eventos indesejados é simplesmente monitorar a cultura esporulação (Passo 3.3) e prosseguir uma vez novos tétrades pararam formando. Em nossos experimentos, a freqüência de duplas classificadas é inferior a 1%. Em segundo lugar, para alguns cruzamentos tempo adicional gasto em meio de esporulação na RT sem agitação (Passo 3.4) sigcativamente melhora a separação de tétradas por as pérolas de vidro durante o plaqueamento ((Protocolo Passo 6). Na verdade, este passo é absolutamente necessário para a ruptura de alguns cruzamentos. Como todos os métodos de rendimento elevado, melhor é &quot;mais ruidoso&quot; do que a abordagem convencional correspondente. A modesta redução na eficiência de melhor em relação a dissecção tétrade convencional pode resultar da combinação de vários fatores. Um fator é o aumento da perda de esporos viáveis ​​de outra forma, o que poderia resultar da adesão às contas de vidro durante a propagação ou aumento da morte de esporos, devido às tensões mecânicas do processo. Um segundo fator pode ser a perda de plasmídeo simples durante a meiose. Um terceiro fator pode ser uma efetiva diminuição nas colônias utilizáveis ​​resultantes de colônias com genótipos mistos, uma estimativa de ~ 5% de colônias em nosso piloto atravessa 1. É provável que essas colônias representam falhas de separação de esporos irmã. Devido à rápida fluorescence triagem e separação de esporos permitir a recolha de um número enorme de tétrades, o BEST está bem equipado para superar diminuição na eficiência nessa escala. Enquanto futuras iterações de melhor poderia aumentar a eficiência que se aproxima de dissecção manual, talvez seja mais provável que a trajetória atual exponencial da capacidade de sequenciamento de DNA irá compensar rapidamente para este nível de perda de tensão utilizável. Independentemente disso, a capacidade de realizar análises tétrade na escala para que melhor pode ser aplicado permitirá estudos que estão atualmente inviável por métodos manuais.

Mapeamento genético meiótica, vulgarmente conhecida como análise tetra, é central para a genética do fermento. Resumidamente, duas cepas haplóides, cada um contendo uma única cópia de cada cromossomo, são acoplados para formar uma linhagem diplóide heterozigoto com duas cópias de cada cromossomo, um de cada pai. Starving células diplóides de nitrogênio induz a meiose (esporulação), em que os cromossomos duplicados, sofrer rearranjo, e dividem-se em quatro células haplóides (esporos ou segregantes) com novas combinações de alelos de cada um dos pais. Os quatro esporos resultantes de uma única meiose pode ser isolado por um processo manual chamado dissecção quaternário. Convencional tétrade 2,3 dissecção que mudou relativamente pouco desde a publicação original em 1937 4, tem três objetivos. Em primeiro lugar, as células que tenham sido submetidos a meiose (tétradas) deve ser isolada a partir de uma distância de fundo das células vegetativas. Na análise convencional, isto é conseguido por um investigador que, usandoum microscópio, identifica visualmente tétradas sobre uma placa de ágar e emprega um aparelho micromanipulador identificar visualmente tétradas sobre uma placa de ágar e usando um micromanipulador para mover o tetra para uma área livre de células da placa. Em seguida, os quatro esporos no quaternário deve ser fisicamente separados para evitar interspore acasalamento. Os esporos dentro de uma tétrade são mantidos juntos por tanto um asco, o remanescente da parede celular da célula diplóide original e um conjunto de pontes interspore 5. Na análise tétrade convencional o asco é removida por digestão enzimática, e pesquisador usa o micromanipulador para quebrar as pontes interspore e separar os esporos. Finalmente, os esporos individuais são dispostos num padrão de grelha que mantém a relação entre os esporos, isto é, toda a progénie de uma linha de quatro esporos são gémeos do mesmo tétrade originais. Uma levedura pesquisador experiente pode concluir o processo de dissecar 10 tétrades (um número mínimo geralmente aceitopor transversal) em cerca de 15 min. Nós desenvolvemos um novo método tétrade genotipagem de alto rendimento, que chamamos de B ARCODE E nabled equencing S de etrads T (BEST) 1. MELHOR expande os métodos atuais em genética de alto rendimento, permitindo a geração e genotipagem de um grande número de descendentes que são isolados, genotipados, e mantidos como indivíduos de uma forma que permite que as relações de esporos irmã de todos os quatro produtos meióticos de ser recuperado. Isto é realizado utilizando-se três estratégias principais (Figura 1). Primeiro, é a introdução de uma construção repórter que rotula as células que sofreram meiose com GFP e permite que sejam isolados por células activadas por fluorescência (FACS). O segundo é a incorporação de um código de barras de DNA altamente complexa (uma seqüência de 15 nucleotídeos aleatórios) de uma forma que é transmitida para todos os quatro esporos de uma tétrade e pode ser lido por sequenciamento de DNA da Progen recombinantey e, portanto, identifica esporos irmãs da mesma quaternário. Em terceiro lugar está o passo a genotipagem, e MELHOR é compatível com várias plataformas de genotipagem que capturam tanto um conjunto de marcadores genômicos, bem como o código de barras específico do tetra. Empregamos uma restrição associada do local de ADN etiqueta de sequenciação (RAD-SEQ) 6 método que dirige a sequenciação do genoma de sítios de restrição específicos 1, capturando assim uma consistente 2-3% do genoma das estirpes da progenitura, bem como o código de barras à base de plasmídeo . A recuperação das relações tétrade, juntamente com os dados de genotipagem empiricamente derivada do cruzamento permite a inferência de informações precisas em falta, incluindo o status de marcadores com baixa cobertura sequência e o genótipo completo de indivíduos inviáveis ​​(e, portanto, não recuperáveis). Aqui, descrevemos a aplicação do método de o microrganismo mais vulgarmente utilizado para o mapeamento da meiose, a levedura S. cerevisiae. No entanto, com as substituições menores de rea-organismo específicogents, por exemplo, proteínas específicas de esporulação diferentes fundidos a GFP, o método deve ser facilmente transferíveis para outros microrganismos, incluindo os organismos em que o mapeamento meiótica é significativamente mais trabalho intensivo ou actualmente intratável. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" width="400" /> Figura 1. Melhor método. (A) O plasmídeo pCL2_BC é um plasmídeo de 2 micra, com uma fusão específica esporulação-GFP, a resistência a G418, e um código de barras 15-mer aleatório. Construção da biblioteca de plasmídeo é descrito em Ludlow et ai 1. (B) Um conjunto de plasmídeos de código de barras é transformado na estirpe diplóide de uma cruz. (C) Os transformantes são então crescidas na selecção e ~ 10.000 colónias transformadas são reunidas e esporuladas. Durante a meiose cada esporo de uma tétrade herda uma copy do plasmídeo com código de barras. (D) Tetrads são separados das células por FACS esporulados e recolhidas em placas de ágar, onde eles são digeridos e rompidas para permitir que cada esporo para formar uma colónia. (E) As colónias são então repicadas para placas de 96 poços, fenotipados, e genotipados. Durante a genotipagem do código de barras é lido plasmídeo e utilizados para identificar os quatro membros de cada tétrada. Este valor foi modificado de Ludlow et al 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="726">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">FACSAria II (Special order unit)</td>
			<td style="width:149px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">-</td>
			<td style="width:155px;">Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td colspan="2">643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zymolyase 100T</td>
			<td>Seikagaku Biobusiness</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G418</td>
			<td>A.G. Scientific</td>
			<td></td>
			<td>http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

best: barcode enabled sequencing of tetrads

Análise Tetrad é uma ferramenta valiosa para a genética de leveduras, mas a natureza manual do laborioso do processo tem dificultado a sua aplicação em grandes escalas. Barcode ativado Seqüenciamento de Tetrads (BEST) 1 substitui os processos manuais de isolamento, interrompendo e espaçamento tétrades. MELHOR isola tétradas em virtude de uma proteína de fusão GFP-specific esporulação que permite activado por fluorescência das células de tétradas directamente em placas de agar, em que o asco é enzimaticamente digeridas e os esporos são interrompidos aleatoriamente e dispostas por conta de vidro chapeamento. As colônias haplóides são atribuídos relações esporos irmã, ou seja, informações sobre quais os esporos originados da mesma tétrade, usando códigos de barras moleculares lidos durante genotipagem. Ao remover o gargalo de dissecção manual, centenas ou mesmo milhares de tétradas pode ser isolado em minutos. Aqui apresenta-se uma descrição detalhada dos procedimentos experimentais necessários para realizar melhor na leveduraSaccharomyces cerevisiae, a começar com uma estirpe diplóide heterozigótico através do isolamento de colónias derivadas da progenitura meiótica haplóide.

MELHOR pode melhorar significativamente a velocidade com que os esporos de tétrades pode ser isolado. Como um exemplo do caudal este método pode proporcionar, um investigador realizou os FACS triagem e separação de esporos (Passos 5.1 a 6.3) com 149 placas de agar em 3 horas 1. Um rendimento equivalente (aproximadamente 3.725 tétrades) exigiria mais de 90 horas de dissecção manual. No entanto, tal como com muitos métodos de alto rendimento, a iteração corrente do método tem alguma perda de eficiência em comparação com a dissecção manual. Este manifesta-se como a perda de um número reduzido de colónias recuperadas comparado com a expectativa calculada com base na viabilidade dos esporos da cruz, determinada por meio de dissecção manual (Passo 1.4). Assumindo que as causas de perda de esporos (Discussão) afectar esporos ao acaso, as estimativas podem ser feitas de quantos colónias recuperadas ser membros de tétradas em que um, dois, três, ou quatro esporos foram recuperados (Figura 4). Figura 4. Simulação da eficácia do método no nível quaternário. Falha de recuperar com sucesso os esporos (como colónias) pode ser devido à inviabilidade de esporos, de esporos de aderência para as pérolas de vidro, a falta de esporos de separar um do outro, etc A distribuição binomial foi usado para calcular a fracção de tétradas esperado (com, pelo menos, um de esporos recuperados com sucesso) produzindo 4, 3, 2 ou 1 colónias com base na proporção de todos os esporos recuperados com sucesso. Este gráfico pode servir como um guia para o número de estirpes que serão finalmente reunidos em 3 - ou 4 - tetrads esporos. Como o número de colônias por placa aumenta, o mesmo acontece com o número de tétrades completos recuperados. Na experiência descrita acima, 25 tétradas de uma cruz com esporos viabilidade perto de 100% (como determined por dissecção manual) 1 foram semeados em 149 placas de agar. Nesta experiência, o número máximo de colónias observadas por placa foi de 80, o que indica que 20 esporos, não formaram colónias discretas. O número médio de colónias por placa foi de 62. Colônias das 61 placas contendo 65 colônias ou mais foram colhidas e seqüenciados. Das 3.700 amostras que passaram seqüenciamento de controle de qualidade, 72% poderiam ser computacionalmente atribuído em 3 - ou 4 - tétrades esporos.

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BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

Barcode ativado Seqüenciamento de Tetrads (BEST) substitui os processos manuais de isolamento, interrompendo e espaçamento tétrades. MELHOR isola tétradas por células activadas por fluorescência em placas de agar, separa os esporos por agitação com esferas de vidro, e determina que as colónias foram dispostas aleatoriamente derivada da mesma tétrade original utilizando códigos de barras moleculares.

MELHOR: Barcode ativado Seqüenciamento de Tetrads

Tetrad analysis is a valuable tool for yeast genetics, but the laborious manual nature of the process has hindered its application on large scales. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.0K visualizações.  Pacific Northwest Diabetes Research Institute.  Barcode ativado Seqüenciamento de Tetrads (BEST) substitui os processos manuais de isolamento, interrompendo e espaçamento tétrades. MELHOR isola tétradas por células activadas por fluorescência em placas de agar, separa os esporos por agitação com esferas de vidro, e determina que as colónias foram dispostas aleatoriamente derivada da mesma tétrade original utilizando códigos de barras moleculares. 

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Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Competitiva Screens Genomic de Bibliotecas Yeast Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Biologia

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any two individuals is greater than previously thought3. In contrast, array-based genotyping has failed to identify a significant contribution of common sequence variants to the phenotypic variability of common disease4,5. Taken together, these observations have led to the evolution of the Common Disease / Rare Variant hypothesis suggesting that the majority of the "missing heritability" in common and complex phenotypes is instead due to an individual's personal profile of rare or private DNA variants6-8. However, characterizing how rare variation impacts complex phenotypes requires the analysis of many affected individuals at many genomic loci, and is ideally compared to a similar survey in an unaffected cohort. Despite the sequencing power offered by today's platforms, a population-based survey of many genomic loci and the subsequent computational analysis required remains prohibitive for many investigators.
To address this need, we have developed a pooled sequencing approach1,9 and a novel software package1 for highly accurate rare variant detection from the resulting data. The ability to pool genomes from entire populations of affected individuals and survey the degree of genetic variation at multiple targeted regions in a single sequencing library provides excellent cost and time savings to traditional single-sample sequencing methodology. With a mean sequencing coverage per allele of 25-fold, our custom algorithm, SPLINTER, uses an internal variant calling control strategy to call insertions, deletions and substitutions up to four base pairs in length with high sensitivity and specificity from pools of up to 1 mutant allele in 500 individuals. Here we describe the method for preparing the pooled sequencing library followed by step-by-step instructions on how to use the SPLINTER package for pooled sequencing analysis (<a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a>). We show a comparison between pooled sequencing of 947 individuals, all of whom also underwent genome-wide array, at over 20kb of sequencing per person. Concordance between genotyping of tagged and novel variants called in the pooled sample were excellent. This method can be easily scaled up to any number of genomic loci and any number of individuals. By incorporating the internal positive and negative amplicon controls at ratios that mimic the population under study, the algorithm can be calibrated for optimal performance. This strategy can also be modified for use with hybridization capture or individual-specific barcodes and can be applied to the sequencing of naturally heterogeneous samples, such as tumor DNA.

Pooled DNA sequencing is a fast and cost-effective strategy to detect rare variants associated with complex phenotypes in large cohorts. Here we describe the computational analysis of pooled, next-generation sequencing of 32 cancer-related genes using the SPLINTER software package. This method is scalable, and applicable to any phenotype of interest.

Detecção de variantes raras genômico de Seqüenciamento combinados usando SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mapeamento bacterianas redes funcionais e vias<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Usando sintéticos matrizes genéticas

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

O sequenciamento de próxima geração de 16S RNA ribossomal Gene amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

Alvejado DNA análise de metilação por Sequenciação de próxima geração

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; untranslated regions (UTRs) are generated in differentiated cells whereas proliferating cells preferentially express transcripts with short 3&#39;UTRs. We describe the A-seq protocol, now at its second version, which was developed to map polyadenylation sites genome-wide and study the regulation of pre-mRNA 3&#39; end processing. Also this current protocol takes advantage of the polyadenylate (poly(A)) tails that are added during the biogenesis of most mammalian mRNAs to enrich for fully processed mRNAs. A DNA adaptor with deoxyuracil at its fourth position allows the precise processing of mRNA 3&#39; end fragments for sequencing. Not including the cell culture and the overnight ligations, the protocol requires about 8 h hands-on time. Along with it, an easy-to-use software package for the analysis of the derived sequencing data is provided. A-seq2 and the associated analysis software provide an efficient and reliable solution to the mapping of pre-mRNA 3&#39; ends in a wide range of conditions, from 106 or fewer cells.

3&#039; End Sequencing Library Preparation with A-seq2

This protocol describes a method for mapping pre-mRNA 3&#39; end processing sites.

3' final de preparação da biblioteca com A-seq2 de sequenciamento

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

Visualização da estrutura 3D tecido adiposo branco usando a coloração de toda a montagem

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Assessment of the Metabolic Effects of Isocaloric 2:1 Intermittent Fasting in Mice

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract metabolic abnormalities. So far, different types of IF models with varying durations of fasting and feeding periods have been documented. However, interpreting the outcomes is challenging, as many of these models involve multifactorial contributions from both time- and calorie-restriction strategies. For example, the alternate day fasting model, often used as a rodent IF regimen, can result in underfeeding, suggesting that health benefits from this intervention are likely mediated via both caloric restriction and fasting-refeeding cycles. Recently, it has been successfully demonstrated that 2:1 IF, comprising 1 day of fasting followed by 2 days of feeding, can provide protection against diet-induced obesity and metabolic improvements without a reduction in overall caloric intake. Presented here is a protocol of this isocaloric 2:1 IF intervention in mice. Also described is a pair-feeding (PF) protocol required to examine a mouse model with altered eating behaviors, such as hyperphagia. Using the 2:1 IF regimen, it is demonstrated that isocaloric IF leads to reduced body weight gain, improved glucose homeostasis, and elevated energy expenditure. Thus, this regimen may be useful to investigate the health impacts of IF on various disease conditions.

The current article describes a detailed protocol for isocaloric 2:1 intermittent fasting to protect and treat against obesity and impaired glucose metabolism in wild-type and ob/ob mice.

Avaliação dos efeitos metabólicos do jejum intermitente isocalórico 2:1 em camundongos

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract ...

Criando bibliotecas robustas de bissulfito-mRNA para mapeamento em toda a transcritoma

Enrichment of mRNA and Bisulfite-mRNA Library Preparation for Next-Generation Sequencing

RNA post-transcriptional modifications in various types of RNA transcripts are associated with diverse RNA regulation in eukaryotic cells. Aberrant RNA 5-methylcytosine modifications and the dysregulated expression of RNA methyltransferases have been shown to be associated with various diseases, including cancers. Transcriptome-wide bisulfite-sequencing was developed to characterize the positions and the quantitative cytosine methylation levels in the bisulfite-converted RNA at the base-pair resolution. Herein, this protocol presents the procedures of two rounds of poly(A) RNA purification, three cycles of bisulfite reaction, and library preparation in detail to allow the transcriptome-wide mapping of mRNA 5-methylcytosine modification sites. The assessment of RNA quantity and quality after the main reaction is essential to monitor RNA integrity and is a critical step for ensuring high-quality sequencing libraries. Ideally, the procedures can be completed within three days. With this protocol, using high-quality total RNA as the input can practically build up robust bisulfite-mRNA libraries for next-generation sequencing from the sample of interest.

Autor em destaque: Decodificando o papel da metilação do RNA no câncer de pâncreas - um estudo de resolução de base única 

This protocol provides an easy-to-follow workflow to conduct poly(A) RNA purification, bisulfite conversion, and library preparation using standardized equipment for a biological sample of interest.

Enriquecimento de mRNA e preparação de bibliotecas de bissulfito-mRNA para sequenciamento de próxima geração

RNA post-transcriptional modifications in various types of RNA transcripts are associated with diverse RNA regulation in eukaryotic cells. Aberrant RNA ...