Os autores gostariam de agradecer Olivier Manches, Ph.D., Davor Frleta, Ph.D., e Meagan O&#39;Brien, MD, pelo apoio e feedback. Esta pesquisa foi apoiada pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas e concluído com financiamento do NIH concede Ruth L. Kirschstein Prêmio Nacional de Serviço de Pesquisa para individuais predoctoral Fellowships (F31) para promover a diversidade na Pesquisa em Saúde Relacionados (AI089030) e SR1 (AI081848 ).

Declaração de Ética: Amostras de pesquisa são obtidos e armazenados para pesquisa com o consentimento dos doadores. Todas as amostras devem ser codificadas ou anónimos, antes da utilização. Este protocolo segue as diretrizes do nosso Conselho de Revisão Institucional. 1. Diferenciação de monócitos do sangue periférico em células dendríticas derivadas de monócitos. Nota: cremes leucocitários humanos servir como fonte de células do sangue periférico humano (PBMC) e foram obtidos a partir do Centro de Sangue de Nova Iorque (New York, NY). Doadores de sangue são voluntários saudáveis. O procedimento de cinco dias começa com o revestimento de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) em cultura de tecidos frascos 35,36. Diferenças notáveis ​​dos protocolos publicados são os seguintes: <ol><li> Utilizar 225 centímetros 2 não pirogénicas frascos de cultura de tecido poliestireno com uma tampa de filtro de aderir um total de 2x10 8 PBMC por frasco de 10 cm em vez de poliestireno placa de cultura de tecidoss (58 cm 2) (passo 1). </li><li> Prepare meios com 5% de soro humano reunido (PHS; 30 ml) em 500 ml de RPMI-1640 + L-glutamina, tampão de 5 ml de HEPES 1 M, e 1,4 mL de 50 mg / ml de gentamicina (5% mídia PHS), seguido por filtração através um filtro de 20 | iM. Adicionar um total de garrafa de cultura de 50 ml de 5% mídia PHS por 225 centímetros 2 tecidos. </li><li> Lave células aderidas três vezes com 25 ml fresco RPMI-1640. Agite vigorosamente durante 5 segundos durante cada lavagem e aspirar as células aderentes não (passo 4). </li><li> Adicionar 190 ul de 400 UI / ul IL-4 e 380 ul de 100 UI / mL de GM-CSF por balão (passo 3) no dia 0, 2, e 4. Dia 0 é definido como o dia PBMC são semeadas no Passo 1 (Passo 8). </li><li> Dia de colheita 5 moDCs a uma concentração de 1x10 6 células / mL (etapa 15). </li><li> Use moDCs imediatamente em seu estado de repouso. Passos 17-22 nunca são executadas. Nota: As amostras devem ser processados ​​o mais rápido possível após a coleta para obter melhores resultados. </li><li> MoDCs alíquotas de cada concentraçãoção de 2x10 5 células / poço (200 ul / poço de 6 a 1x10 células / ml) em uma placa de 96 poços de fundo redondo (western blot, ELISA, FACS), ou para um chamberslide poli-L-lisina tratada (microscopia) para experimentação . Nota: Há pelo menos quatro condições: Completamente não estimulado (controle negativo), priming, Só ativação e condicionamento seguido de ativação. As condições podem ser expandidas para incluir controlos de diluente para R848 e nigericina se desejado. Se o ensaio a jusante é ICS, duplicatas são necessárias para controles isotipo. </li></ol> . 2 Priming o inflammasome - Sinal 1 <ol><li> Reconstituir R848 liofilizado em DMSO de acordo com as instruções do fabricante. Diluir estoque trabalhando em RT com RPMI-1640. </li><li> Adicionar R848 a uma concentração final de 10 uM para poços de 18 horas apropriadas. Colocar as células em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol> 3 Ativando o NLRP3 inflammasome -. Signal2 <ol><li> Reconstituir nigericina liofilizado em etanol de acordo com as instruções do fabricante. Diluir estoque de trabalho, à TA, com meio RPMI-1640 antes da adição às condições adequadas. </li><li> Adicionar nigericina a uma concentração final de 20 uM e retornar para o incubador a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 6 horas. Não há etapas de lavagem ocorrer entre priming e durante a ativação. Nota: A secreção de IL-1β é aumentada pela presença de ionóforo de cálcio, brefeldina A, monensina, dinitrofenol, ou cianeto de carbonilo clorofenilhidrazona 37, 38. Portanto, a adição destes inibidores de secreção não são recomendadas na análise de iniciação ou actividade inflammasome uma vez que irá alterar a secreção de IL-1β. </li></ol> 4. Coleta de Amostras IL-1ß <ol><li> Centrifugar a placa com as células e os sobrenadantes a 974 xg durante 3 min. </li><li> Sem perturbar o sedimento celular, aspirar o sobrenadante e transferir para aeparate de fundo redondo de chapa, a fim de medir a secreção de citocinas a partir dos sobrenadantes. Nota: Os sobrenadantes podem ser temporariamente armazenados a -20 ° C ou -80 ° C para armazenamento a longo prazo. </li><li> Lavar os sedimentos celulares por três vezes com 200 ul de 1x PBS a 974 x g durante 3 minutos para remover qualquer extracelular de IL-1β das amostras celulares. Nota: Ao lavar pellets de células de uma placa de 96 poços, retire a lavagem por inversão placa rápida em uma caixa de coleta, de modo a não perturbar a amostra. </li></ol> 5. Medição de IL-1b a partir de amostras celulares e sobrenadantes <ol><li> Coloração de citocinas intracelulares (ICS): O protocolo ICS está descrito abaixo 39, 40. Nota: não suspender as células se o ensaio a jusante é a microscopia. Todas as lavagens e aspirações deve ser feito sem perturbar a camada de células / pelete (dependendo do ensaio a jusante). <ol><li> Adicionar 100 ul de 5% de meio PHS em poços apropriados. Adicionarvolume apropriado (cerca de 1 5 μl/2x10 células, ou 1 mL / poço) de marcado por fluorescência α-CD11c e α-CD14 (marcadores fenotípicos, clone B-ly6 e MφP9, respectivamente), ou controlo de isotipo para as células durante 10 min a RT no escuro. </li><li> Lavar três vezes com 1x PBS a 974 x g durante 3 min. </li><li> Fixar as células por adição de 100 mL de 4% de PFA durante 20 min à RT, no escuro. </li><li> Pausa Point: Lavar com 100 l 1x PBS a 974 xg por 3 min e armazenar a 4 ° CO / N em 1x PBS. </li><li> Adicionar 100 ul de tampão de permeabilização de células durante 30 min. Nota: tampão de permeabilização é composto de 1x PBS com 0,3% de Triton X-100, e 1% de albumina de soro bovino (BSA) para a permeabilização. Não perturbe células aderentes ao ensaio a jusante é a microscopia. </li><li> Adicionar o volume apropriado (cerca de 62 ng antibody/2x10 5 células, ou cerca de 2,5 uL / poço) de α-IL-1β-FITC (clone 8516) ou controlo de isotipo para2 horas numa incubadora a 37 ° C. </li><li> Lave as células três vezes com 200 ul de tampão de permeabilização em 974 xg durante 3 minutos no escuro. </li><li> Opcional: Coloração com DAPI, adicionar montagem, e colocar lamelas delicadamente no topo de uma lâmina de vidro. Permitir montagem para curar O / N antes de capturar imagens de microscopia. </li><li> Adquirir os dados por FACS ou microscopia. Nota: Compare o isotipo para cada condição para a coloração adequada na análise por FACS ou microscopia. <ol><li> CAA: Adquirir uma amostra de cada vez. Defina o FSC / SSC portão nas células vivas, seguido de gating em CD11c + CD14 - células antes de analisar a população MODC pró-IL-1β coloração. </li><li> Microscopia: Defina o tempo de exposição, usando a amostra coloração positiva - R848 tratada. Use DAPI + pró-IL-1β + e DAPI + pró-IL-1β - para determinar a percentagem de pró-IL-1β + expressam moDCs. </li></ol></li></ol></li><li> SDS-Página: Immunoblotting é realizado para detectar pró-IL-1β. Nota: A técnica descrita a seguir combina técnica padrão imunotransferência, gradiente de 4-20% de gel de poliacrilamida, e a detecção fluorescente ou quimioluminescente, 41, 42. <ol><li> Lisar as células directamente em 10 uL de tampão de lise desnaturante (5 ul β-mercaptoethanol/950 tampão de amostra Laemmli ul seguido por diluição a 1:1 com tampão de lise celular). Transferir o lisado para tubos de 1,5 ml de Eppendorf. </li><li> Lisado de calor em uma placa seca durante 10 minutos a 100 ° C. </li><li> Girar a 20.800 xg lisado num minicentrifuge durante 1 min para concentrar o volume de líquido. Pause ponto: as amostras podem ser congeladas a -20 ° C para armazenagem de curta duração. </li><li> Carregar o volume total sobre o gel de poliacrilamida. Executar 140 V através da caixa de gel para cerca de 1 hora, ou até a frente do corante sai da parte inferior do gel. </li><li> Transferir a proteína a partir do gel de poliacrilamida para uma membrana Immobilon-PVDF Membr FLane durante 90 min a 100 V. Bloquear a membrana com 5% de BSA em tampão salino Tris / 0,1% de Tween-20 (TBS-T) durante 1 hora. Nota: PVDF Immobilon-FL é melhor para uso com detecção fluorescente. Uma membrana com uma composição diferente é recomendado para outras técnicas de detecção para aumentar o sinal para relação de fundo. </li><li> Dilui-se anticorpos primários e secundários, em 10 ml de 5% de BSA / TBS-T. Realizar as incubações de anticorpos primários a 4 ° CO / N, agitando e anticorpo secundário à temperatura ambiente durante 1 hora, agitando. </li><li> Lava-se a membrana três vezes com TBS-T, durante 5 minutos, agitando entre as incubações do anticorpo primário e secundário e de novo entre as incubações secundárias e de imagiologia. Nota: As bandas podem ser detectados utilizando fluorescente ou de detecção quimioluminescente. Siga as instruções do fabricante para a detecção. </li></ol></li><li> ELISA: As amostras que são congelados para armazenamento necessita equilibrar à temperatura ambiente antes da análise. Gire para baixo as amostras em uma centrífuga para consolidar CONDENS sobrenadanteção. Siga as instruções do fabricante para a medição de IL-1β. Nota: Neste protocolo IL-1β é especificamente medido; No entanto, a medição simultânea de TNFa, IL-6, e o imunomodulador citocina IL-10 assegurar as condições apropriadas foram sensibilizados. </li></ol>

Os autores não têm conflitos de interesse de divulgar.

As citocinas inflamatórias são essenciais na condução da resposta imune inata e adaptativa para combater a infecção viral. Secretado IL-1β tem sido demonstrado que o aumento durante a infecção da gripe 3, 43, 44. Os mecanismos exactos pelos quais essas citocinas são processados, em resposta ao reconhecimento viral em células dendríticas humanas não são completamente compreendidos. Mielóides kits de isolamento DC são caros e demorados. Kits de isolamento e FAC classificação pode involuntariam...

A ativação do sistema imune inato é necessário para orientar as respostas imunes adaptativas durante a infecção, doença e vacinação 7. As células dendríticas são o antigénio mais potente que apresenta as células do sistema imune inato; eles são especializados para a absorção de antígenos, a migração para os gânglios linfáticos, e ativação de ingênuo CD4 + e as células T CD8 + citolítica 8-10. Para permitir a detecção de patógenos rápida do sistema imune inato utiliza inúmeros receptores de reconhecimento padrão germinativas codificado (PRR) que reconhecem patógenos conservada motivos derivados ou host derivado marcadores de estresse celular e danos. Toll like receptors (TLRs) são receptores de reconhecimento padrão membrana ligada que reconhecem determinado patógeno fagocitada extracelular padrões associados moleculares (PAMPs) e padrões moleculares de perigo associado (amortece). Ao aceno contraste como receptores (NLRs) são citosólica e responder a uma gama diversificada de PAMPs e DAMPs. Nod like receptors reapresentar uma segunda linha de defesa contra patógenos que escapam da superfície celular e PRRs endocíticas. A interação do patógeno derivada, ou &quot;perigo&quot; associado, fatores com TLR e NLR ligantes leva a um estado de maturação DC resultando em aumento da interação DC com outras células do sistema imunológico e na promoção de células T e ativação das células natural killer 11. Interleucina-1β é um componente crucial da defesa do hospedeiro contra a infecção. Mediante o reconhecimento de um microrganismo, a citoquina altamente pró-inflamatória IL-1β, é segregada e funciona como um atractivo químico e activador de células imune inata e adaptativa. In vivo de IL-1β é em grande parte responsável pela resposta de fase aguda, incluindo febre e citocinas inflamatórias síntese 12. A maioria dos NLRs conter uma leucina do terminal C rico domínio de repetição que é pensado para funcionar na detecção do ligando, um domínio de ligação de nucleótido central (NACHT) que é important para NLRP3 oligomerização e um domínio efetor terminal de N (PYD em NLRP3) que medeia a transdução de sinal para alvos a jusante através de interações proteína proteína. A proteína NLRP3 define o complexo inflammasome mais intensamente estudado. Esta proteína é um membro da família NLR e tem a capacidade de formar um complexo de proteína molecular de vários compostos de NLRP3, o PYCARD proteína adaptadora (também conhecido como ASC), e ICE. Após a ativação inflammasome PYCARD liga a domínios terminais NLRP3 N e recruta ICE via ativação da caspase e domínio de recrutamento (cartão) domínios. A interleucina-1 da enzima de conversão é inicialmente gerado como um zimogénio que contém um motivo CARTÃO na sua extremidade N-terminal. Resultados de formação inflammasome em trazer duas moléculas ICE suficientemente perto para induzir sua ativação autocatalítica. O complexo inflammasome é necessário para activação de ICE, assim permitindo que a converter citoplasmática pró-IL-1β para amadurecer citocina. Secreção de IL sucedida-1β em DCs requer detecção de dois sinais diferentes e independentes de perigo. Primeiro, TLR detecção de PAMPs, DAMPs, ou sinalização de citocinas (TNF ou IL-1β) provoca uma regulação positiva da expressão citoplasmática de proteínas pró-IL-1β. Uma segunda, muitas vezes diferentes, o sinal é necessário para a formação do complexo inflammasome a montante de maturação ICE. Alguns inflammasome estimulando sinais incluem poros da membrana bacteriana formando toxinas (como nigericina), lisossomais interromper cristais (tais como cristais de urato monossódico, MSU) e ATP extracelular. O mecanismo montante levando a ativação NLRP3 inflammasome por esses diversos ativadores não é clara. Estudos investigando sinalizando a montante da formação inflammasome propõe que os eventos intracelulares, tais como a indução da hipocalemia ou espécies reativas de oxigênio (ROS) indiretamente ativar o inflammasome 13-28. Entre os diferentes activadores virais do inflammasome NLRP3 é gripe, que fornece both o sinal primário e secundário necessário para a secreção de IL-1β 3, 29-33. Usando modelos de mouse NLRP3 knockout verificou-se que a secreção de IL-1β em DCs é NLRP3 dependente 32. Além disso, ratinhos knockout Nlrp3 atraído menor número de leucócitos para o local da infecção e experimentaram maior mortalidade 2, 5. Dois artigos recentes sugerem um mecanismo para a ativação inflammasome NLRP3 durante a infecção pelo vírus Influenza; em primeiro lugar, por meio de priming reconhecimento de ARN viral por TLR7 TLR8 ou (dependendo expressão TLR da célula responder) ou através de detecção de bactérias comensais por outro TLR para induzir a expressão citoplasmática pró-IL-1β, seguido por um segundo sinal, a activação de NLRP3 formação inflammasome pela proteína de canal iônico viral M2 na rede de Golgi trans 33, 34. No último passo, o desencadeamento de inflammasome NLRP3 é realizado por perturbação do intracelular iónico &lt;in&gt; meio que conduz a produção de ROS, que é, simplesmente, detectada por NLPR3 como um sinal de modo a formar o inflammasome. No entanto, o mecanismo preciso de inflammasome montante activação de actividade da ICE durante a infecção da gripe ainda permanece incerto. Este trabalho descreve uma técnica valiosa para o estudo da inflammasome NLRP3 em moDCs humanos que pode ser usado como uma base para uma investigação mais aprofundada da via subjacente DC baseado secreção de IL-1β em resposta a TLR8 ligadura com R848 seguido pela ativação do inflammasome por um bem activador conhecido de NLRP3, nigericina. Variações deste método pode ser usado com outros tipos de células, incluindo, mas não limitados a: monócitos, macrófagos, outros subconjuntos DC, e células epiteliais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1081px;" width="1081">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:391px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">IL-4</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">GM-CSF</td>
			<td style="width:179px;">Genzyme</td>
			<td style="width:121px;">NDC 58468-0180-2</td>
			<td>We acquire this item through our local pharmacy with a prescription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">RPMI 1640 with L-glutamine</td>
			<td style="width:179px;">Cellgro</td>
			<td style="width:121px;">10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Peripheral blood mononuclear cells</td>
			<td style="width:179px;">New York Blood Center</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>PBMCs were isolated from the blood of healthy donors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">12-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">96-well round bottom tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;-FITC</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">IC201F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">FITC isotype control</td>
			<td style="width:179px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:121px;">130-092-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-&#946;-Tubulin</td>
			<td style="width:179px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:121px;">SC-9014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">mab201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">PVDF Immobilon-FL membrane</td>
			<td style="width:179px;">Millipore</td>
			<td style="width:121px;">IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">gradient 4-12 % polycrylamide gel</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-1159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">laemmli sample buffer</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">BSA</td>
			<td style="width:179px;">Equitech Bio Inc</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>30% solution sterile/filtered</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">PFA</td>
			<td style="width:179px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:121px;">15710</td>
			<td>16% solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">human inflammatory cytokine bead array kit</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">551811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">nigericin</td>
			<td style="width:179px;">Invivogen</td>
			<td>tlrl-nig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">R848</td>
			<td>3M Corp.</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD14</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">340436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD11c</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">555392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">TBS</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>On site stock room</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tween-20</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">P2287-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"><a>Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs</a></td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">159933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">20 &#956;M Sterile Disposable Filter Units</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">569-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Hepes</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">goat &#945;-mouse IRDye 800CW</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">donkey &#945;-rabbit IRDye 680RD</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-68073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Spectra multicolor broad range protein ladder</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">26634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine SDS 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Methanol - 4L</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">A433P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Prolong Gold antifade Reagent with DAPI</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td>P-36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide</td>
			<td style="width:179px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:121px;">354108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and measurement of nlrp3 inflammasome activity using il-1&#946; in human monocyte-derived dendritic cells

Processos inflamatórios resultantes da secreção de interleucina (IL) -1 citocinas família de células do sistema imunológico levar à inflamação local ou sistêmica, remodelação e reparação tecidual e controle virológico 1, 2. Interleucina-1β é um elemento essencial da resposta imune inata e contribui para eliminar agentes patogénicos invasores, evitando a criação de uma infecção persistente 1-5. Inflammasomes são a plataforma de sinalização fundamental para a ativação da enzima conversora de interleucina 1 (ICE ou Caspase-1). O inflammasome NLRP3 requer, pelo menos, dois sinais em DCs para provocar a secreção de IL-6 1β. A expressão da proteína pro-IL-1β é limitado em células em repouso; Por conseguinte, um sinal de iniciação é necessária para a transcrição IL-1β e a expressão da proteína. Um segundo sinal detectado pelo Nlrp3 resultados na formação do NLRP3 inflammasome multi-proteína. A capacidade das células dendríticas que respond para os sinais requeridos para a secreção de IL-1β pode ser testado utilizando uma purina sintético, R848, que é detectada por TLR8 em monócitos humanos derivados de células dendríticas (moDCs) de células principais, seguido de activação da inflammasome NLRP3 com a toxina bacteriana e ionóforo de potássio, nigericina. DCs derivadas de monócitos, são facilmente produzidas em cultura e fornecer um número significativamente maior do que as células purificadas DCs mielóides humanos. O método aqui apresentado difere de outros ensaios inflammasome em que ele usa em humanos in vitro, em vez de ratinho derivada, permitindo assim DCs para o estudo da inflammasome na doença humana e infecção.

Estas técnicas medir TLR8 priming com R848. Coloração citocina intracelular para pró-IL-1β permite a microscopia e FACS leituras de CD14 - CD11c + moDCs. Ambas as técnicas podem ser quantificados em relação a um não carregadas, ou de descanso, controlo de células, bem como um controlo do isotipo (Figuras 1 e 2). Percentagem de células pró-IL-1β + coloração é multiplicado pela média geométrica da população para fornecer a intensidade de fluorescência ...

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Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&amp;#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

As células dendríticas (CDs) segregam IL-1β em resposta ao reconhecimento de purina TLR8 sintético, R848, seguido por activação inflammasome NLRP3 com nigericina, por conseguinte, a IL-1β pode ser utilizado para medir a actividade inflammasome NLRP3. Coloração intracelular de citocinas, immunoblotting e ELISA são usados ​​para medir com precisão NLRP3 inflammasome priming e ativação via expressão de IL-1β.

Ativação e Mensuração de NLRP3 inflammasome Atividade Usando IL-1β em células dendríticas humanas Monocyte derivados

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

activation-measurement-nlrp3-inflammasome-activity-using-il-1-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

20.7K visualizações.  New York University School of Medicine.  As células dendríticas (CDs) segregam IL-1β em resposta ao reconhecimento de purina TLR8 sintético, R848, seguido por activação inflammasome NLRP3 com nigericina, por conseguinte, a IL-1β pode ser utilizado para medir a actividade inflammasome NLRP3. Coloração intracelular de citocinas, immunoblotting e ELISA são usados ​​para medir com precisão NLRP3 inflammasome priming e ativação via expressão de IL-1β. 

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Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin which forms an insoluble clot that stops hemorrhage. Factor V (FV) in its activated form, FVa, is a critical cofactor for the protease FXa and accelerator of thrombin generation during fibrin clot formation as part of prothrombinase 1, 2. Manual FV assays have been described 3, 4, but they are time consuming and subjective. Automated FV assays have been reported 5-7, but the analyzer and reagents are expensive and generally provide only the clot time, not the rate and extent of fibrin formation. The microplate platform is preferred for measuring enzyme-catalyzed events because of convenience, time, cost, small volume, continuous monitoring, and high-throughput 8, 9. Microplate assays have been reported for clot lysis 10, platelet aggregation 11, and coagulation Factors 12, but not for FV activity in human plasma. The goal of the method was to develop a microplate assay that measures FV activity during fibrin formation in human plasma.
This novel microplate method outlines a simple, inexpensive, and rapid assay of FV activity in human plasma. The assay utilizes a kinetic microplate reader to monitor the absorbance change at 405nm during fibrin formation in human plasma (Figure 1) 13. The assay accurately measures the time, initial rate, and extent of fibrin clot formation. It requires only &mu;l quantities of plasma, is complete in 6 min, has high-throughput, is sensitive to 24-80pM FV, and measures the amount of unintentionally activated (1-stage activity) and thrombin-activated FV (2-stage activity) to obtain a complete assessment of its total functional activity (2-stage activity - 1-stage activity).
Disseminated intravascular coagulation (DIC) is an acquired coagulopathy that most often develops from pre-existing infections 14. DIC is associated with a poor prognosis and increases mortality above the pre-existing pathology 15. The assay was used to show that in 9 patients with DIC, the FV 1-stage, 2-stage, and total activities were decreased, on average, by 54%, 44%, and 42%, respectively, compared with normal pooled human reference plasma (NHP).
The FV microplate assay is easily adaptable to measure the activity of any coagulation factor. This assay will increase our understanding of FV biochemistry through a more accurate and complete measurement of its activity in research and clinical settings. This information will positively impact healthcare environments through earlier diagnosis and development of more effective treatments for coagulation disorders, such as DIC.

This study describes a novel microplate assay that measures FV coagulation activity during fibrin clot formation in human plasma which has not been reported previously. The method uses a kinetic microplate reader to continuously measure the change in absorbance at 405nm during fibrin clot formation in human plasma.

Medição da actividade de factor V no plasma humano, utilizando um ensaio de coagulação de Microplacas

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

Imunologia e Infecção

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 - 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded &gt; 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.

This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.

Caracterização de derivados de monócitos células dendríticas humanas por imagem Citometria de Fluxo: Uma Comparação entre dois protocolos de isolamento de monócitos

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Geração de células dendríticas derivadas de monócitos humanos a partir de sangue inteiro

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Desenvolvimento e validação de uma única molécula ultra-sensível de matriz Digital ensaio imunossorvente ligado à enzima para humana Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Deteção de ativação de Inflammasome e morte celular de Pyroptotic nos macrófagos da medula óssea-derivado murino

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.

Quantificação da atividade quimiotática de monócitos in vivo e caracterização de macrófagos derivados de monócitos sanguíneos

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas autophagic flux is only observed in iDCs. To gain mechanistic insights, we developed efficient strategies to interfere with HSV-1-induced autophagic turnover. An inhibitor-based strategy, to modulate HSV-1-induced autophagy, constitutes the first choice, since it is an easy and fast method. To circumvent potential unspecific off-target effects of such compounds, we developed an alternative siRNA-based strategy, to modulate autophagic turnover in iDCs upon HSV-1 infection. Indeed, electroporation of iDCs with FIP200-specific siRNA prior to HSV-1 infection is a very specific and successful method to ablate FIP200 protein expression and thereby to inhibit autophagic flux. Both presented methods result in the efficient inhibition of HSV-1-induced autophagic turnover in iDCs, whereby the siRNA-based technique is more target specific. An additional siRNA-based approach was developed to selectively silence the protein expression of KIF1B and KIF2A, facilitating autophagic turnover upon HSV-1 infection in mDCs. In conclusion, the technique of siRNA electroporation represents a promising strategy, to selectively ablate the expression of distinct proteins and to analyze their influence upon an HSV-1 infection.

In this study, we present inhibitor- and siRNA-based strategies to interfere with autophagic flux in Herpes simplex virus type-1 (HSV-1)-infected monocyte-derived dendritic cells.

eletroporação siRNA para modular a autofagia em herpes simplex vírus tipo 1 infectado monocyte derivados células dendríticas

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic inflammation. Neutrophil ETs (NETs) consist of a mesh of DNA, histone proteins, and various granule proteins (i.e., myeloperoxidase, elastase, and cathepsin G). Other immune cells, including macrophages, can also produce ETs; however, to what extent this occurs in vivo and whether macrophage extracellular traps (METs) play a role in pathological mechanisms has not been examined in detail. To better understand the role of METs in inflammatory pathologies, a protocol was developed for visualizing MET release from primary human macrophages in vitro, which can also be exploited in immunofluorescence experiments. This allows further characterization of these structures and their comparison to ETs released from neutrophils. Human monocyte-derived macrophages (HMDM) produce METs upon exposure to different inflammatory stimuli following differentiation to the M1 pro-inflammatory phenotype. The release of METs can be visualized by microscopy using a green fluorescent nucleic acid stain that is impermeant to live cells (e.g., SYTOX green). Use of freshly isolated primary macrophages, such as HMDM, is advantageous in modeling in vivo inflammatory events that are relevant to potential clinical applications. This protocol can also be used to study MET release from human monocyte cell lines (e.g., THP-1) following differentiation into macrophages with phorbol myristate acetate or other macrophage cell lines (e.g., the murine macrophage-like J774A.1 cells).

Presented here is a protocol to detect macrophage extracellular trap (MET) production in live cell culture using microscopy and fluorescence staining. This protocol can be further extended to examine specific MET protein markers by immunofluorescence staining.

Estimulação e visualização in vitro da liberação extracelular da armadilha em macrófagos humanos monocyte-derivados diferenciados

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

Visualização de Caspases Inflamatórias Induzidas proximidade em macrófagos derivados de monócitos humanos

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and play a unique role within the immune system by linking the innate and adaptive immune responses. These cells can phagocytize and then present captured antigens to effector immune cells, triggering a diverse range of immune responses. This paper demonstrates a standardized method for the in vitro generation of bovine monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) isolated from cattle peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and their application in evaluating vaccine immunogenicity.
Magnetic-based cell sorting was used to isolate CD14+ monocytes from PBMCs, and the supplementation of complete culture medium with interleukin (IL)-4 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) was used to induce the differentiation of CD14+ monocytes into naive MoDCs. The generation of immature MoDCs was confirmed by detecting the expression of major histocompatibility complex II (MHC II), CD86, and CD40 cell surface markers. A commercially available rabies vaccine was used to pulse the immature MoDCs, which were subsequently co-cultured with naive lymphocytes.
The flow cytometry analysis of the antigen-pulsed MoDCs and lymphocyte co-culture revealed the stimulation of T lymphocyte proliferation through the expression of Ki-67, CD25, CD4, and CD8 markers. The analysis of the mRNA expression of IFN-&#947; and Ki-67, using quantitative PCR, showed that the MoDCs could induce the antigen-specific priming of lymphocytes in this in vitro co-culture system. Furthermore, IFN-&#947; secretion assessed using ELISA showed a significantly higher titer (**p &#60; 0.01) in the rabies vaccine-pulsed MoDC-lymphocyte co-culture than in the non-antigen-pulsed MoDC-lymphocyte co-culture. These results show the validity of this in vitro MoDC assay to measure vaccine immunogenicity, meaning this assay can be used to identify potential vaccine candidates for cattle before proceeding with in vivo trials, as well as in vaccine immunogenicity assessments of commercial vaccines.

The methodology describes the generation of bovine monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) and their application for the in vitro evaluation of antigenic candidates during the development of potential veterinary vaccines in cattle.

Determinação da imunogenicidade vacinal utilizando células dendríticas derivadas de monócitos bovinos

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...