Os autores agradecem a Fundação Armenise-Harvard, a Marie-Curie COFUND Trentino (ACS), a Província Autônoma de Trento (Ecomm) e CIBIO para financiamento.

1. Preparando o Modelo de DNA <ol><li> Purifica-se o plasmídeo a partir de uma estirpe de laboratório padrão de E. coli, tais como E. coli DH5a ou Nova azul com um kit comercial. Em alternativa, um produto de PCR linear pode ser purificado de forma semelhante com um kit comercial. Eluir o DNA apenas com H 2 O. </li><li> Fenol-clorofórmio extrair a solução de ADN 26. </li><li> Determinar a concentração de DNA e da pureza, por exemplo, por absorção de UV ou outros métodos adequados. É importante a utilização de ADN altamente puro para a eficiente transcrição-tradução. </li></ol> 2. Preparando o Fina Lipid Film <ol><li> Pesa-se o pó de lípido seco e dissolver em solventes. Para 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), as soluções de reserva são preparadas em clorofórmio a uma concentração de 40 mg / ml. Nota: Os solventes orgânicos devem sempre ser manuseados com pipetas de vidro e garrafas. Em outras palavras, o plástico não tem de ser usado. Loja ssoluções tock no ar apertados, garrafas de vidro âmbar resistentes a solventes a -20 ° C, de preferência sob argônio. </li><li> Alíquotas de 12 umol a POPC (220 ul de 40 mg / ml de solução) para um balão de fundo redondo de 5 ml. </li><li> Evapora-se o solvente com um evaporador rotativo (Figura 1) para gerar a película lipídica fina. <ol><li> Fixar firmemente a balão de fundo redondo ao tubo de alimentação com um grampo circular e iniciar a rotação do frasco. </li><li> Iniciar a circulação de água através da serpentina de condensador. Usando um banho de calor não é necessária, porque clorofórmio tem um baixo ponto de ebulição de 61,2 ° C à pressão atmosférica normal. </li><li> Assegure-se que o sistema é aberto para a atmosfera através da verificação de que a torneira é aberta. Ligar a bomba de vácuo e, lentamente, fechar a torneira de passagem para aplicação do vácuo ao sistema. </li><li> Uma fina película de lípido é depositado nas paredes do balão de fundo redondo, durante a evaporação rotativa, formando uma película opacaque é visível a olho nu. Deixe o evaporador rotativo continuar por 0,5-2 horas. Para parar o processo, liberam lentamente a pressão de vácuo, parar a rotação, e retirar o balão de fundo redondo. </li></ol></li></ol> 3. Ressuspensão de lipídios e homogeneização Vesicle <ol><li> Adicionar 1 ml de 18,2 mohms H2O à película lipídica fina directamente no balão de fundo redondo. Vortex vigorosamente a solução a uma velocidade máxima, cerca de 3.200 rpm, até que o filme de lípidos destaca a partir do vidro, que é observável a olho nu. </li><li> Transferir a solução de lípidos num tubo de microcentrifugação de 2 ml. </li><li> Definir-se um anel de estar a realizar um homogeneizador com uma ponta de 5 mm. Coloque um suporte microcentrífuga abaixo do homogeneizador para prender firmemente a dispersão de lípidos. Lavar o elemento de dispersão do homogeneizador por imersão da ponta em 18,2 mohms H2O e correr durante alguns segundos. </li><li> Colocar o elemento de dispersão directamente na dispersão de lípidos assegurando thna ponta não toca o fundo do tubo de microcentrífuga. Homogeneizar durante 1 min no nível de potência 4 ou 14.000 rpm. </li></ol> 4. Extrusão vesícula e liofilização <ol><li> Montar as partes do mini-extrusor (Figura 2), que consiste num invólucro exterior e uma porca de fixação que abriga dois membrana de Teflon interno suporta, dois O-rings, e um rolamento de Teflon. <ol><li> Colocar os dois O-rings nos sulcos dos suportes de membranas internas. Prewet dois filtros e uma membrana de 400 nm. Os filtros vai ser colocado contra a Teflon dentro de os anéis de vedação com a membrana entre elas. </li><li> Colocar a membrana de suporte dentro do invólucro exterior da extrusora com a membrana rodeado por dois filtros em entre os anéis de vedação. Coloque o mancal de teflon dentro da caixa e coloque a porca de fixação e aperte com a mão. </li></ol></li><li> Lavar duas seringas e preencha um com 18,2 mohms água. Insira as agulhas de seringa na pequena holes do teflon em cada extremidade da montagem de extrusão. As agulhas devem deslizar facilmente, não force as agulhas. Prenda a extrusora com as seringas na extrusora habitação e prender. </li><li> Passar a água através do extrusor, empurrando lentamente a água para fora da seringa e para o outro. Isso representa uma passagem. Repita o procedimento para um total de três passagens, garantindo que não haja vazamentos presentes. Retire a seringa de água e descarte a água. </li><li> Encher uma seringa com a amostra, atribuem à extrusora, e lentamente passar a solução através da membrana das vesículas, como descrito acima no passo 4.3. Repita a 10x para um total de 11 passagens. Conforme o processo de extrusão prossegue, a amostra irá tornar-se menos turva e mais fácil empurrar através da membrana. Uma queda súbita na resistência, no entanto, geralmente indica uma ruptura da membrana. </li><li> Transferir a solução de vesículas extrudidas e fazer 40 mL alíquotas das vesículas em tubos de microcentrífuga.Flash congelar cada alíquota em gelo seco ou em nitrogênio líquido. </li><li> Liofiliza-se cada alíquota com um evaporador centrífugo durante a noite a 30 ° C. Armazenar as vesículas vazias liofilizadas a -20 ° C. </li></ol> 5. Encapsular maquinaria de transcrição-tradução <ol><li> Misture os componentes da reacção de transcrição-tradução e adicionar 20 unidades de inibidor de RNase. Incubar em gelo. </li><li> Adicionar o molde de ADN. Para obter uma reacção de controlo, 250 ng de um plasmídeo mVenus codificando uma proteína fluorescente ou semelhante por trás de um promotor de transcrição de T7 e um forte E. coli local de ligação ao ribossoma é recomendada. </li><li> Levar o volume final de 25 ul com água sem RNase. </li><li> Hidrato de uma alíquota de vesículas liofilizados (a partir do passo 4.6) com 10 ul da reacção montados no passo 5.3. Vortex brevemente a mistura até que as vesículas são ressuspensas. Isso deve levar menos de 30 segundos. </li><li> Incubar a reação em gelo por 30 min para permitir que as vesículas a inchar. </li><li> Dilui-se a mistura de vesículas de 20 vezes para um volume final de 30 ul pela adição de 1,5 ul de vesículas em 27,0 ul de 50 mM Tris-HCl, 50 mM de NaCl, pH 7,4 e 1,5 mL de 20,2 mg / ml de Proteinase K. A DNase e RNase Também podem ser adicionados neste ponto como uma alternativa para a proteinase K para degradar o material extravesicular. </li><li> Incubar durante pelo menos 2,5 horas a 37 ° C. </li></ol> 6. Microscopia <ol><li> Examine as vesículas eo progresso da produção de proteína fluorescente em diferentes pontos do tempo. As vesículas que têm um diâmetro maior do que os 400 nm de tamanho de poro da membrana utilizada para a extrusão das vesículas. <ol><li> Prepara-se uma câmara de medição, colocando um 20 x 5 mm espaçador de silício sobre uma lâmina de microscópio padrão. Pipetar 10 ul de vesículas para a câmara de amostragem. Coloque uma tampa de vidro siliconizada deslizamento sobre a câmara. </li><li> Observe as vesículas com um 63X dispersão de óleo or objectivo semelhante por microscopia de campo brilhante e fluorescência, usando o conjunto de filtro apropriado para a proteína fluorescente explorada. </li></ol></li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Embora a biologia sintética livre de células ainda está em sua infância, os avanços criaram uma base a partir da qual podem ser feitos sistemas de células, como cada vez mais complexas. A reconstituição da maquinaria de transcrição-tradução de totalmente definido componentes 9 dentro de vesículas 28 foi particularmente significativo no sentido de facilitar os esforços posteriores na construção artificial ambientalmente sensível cells17 de 18. Da mesma forma, estudos de células artificiais têm sido usados ​​para investigar os processos evolutivos 4,29,30, os detalhes mecanicistas de RNA e síntese protéica 22,31, as influências de metabólica load32, 33, ea montagem de partículas virais 34. É importante ressaltar que o conhecimento suficiente, agora que existe a função celular básico pode ser reconstituído no interior de vesículas no laboratório seguindo estes relatórios anteriores e os protocolos aqui descritos. Para além de ser fácil, o encapsulamento de pr descritoocedure tem vários benefícios. Por exemplo, muitos vazios, aliquotas liofilizadas de vesículas pode ser feita antecipadamente e guardado a -20 ° C para uso posterior. O protocolo faz moléculas biológicas que não estão sujeitos a solventes orgânicos, as mudanças drásticas de temperatura, ou longos períodos de diálise. Espera-se que a suavidade do processo vai facilitar a incorporação de componentes adicionais, conforme necessário. Também não foram observados efeitos adversos para a alteração da composição lipídica da membrana sobre a eficiência de encapsulamento ou de transcrição-tradução. Assim, os lípidos mais propícia para a incorporação de proteínas de membrana, as morfologias específicos, ou de visualização poderão concebivelmente ser explorada. A principal limitação do método descrito é que as vesículas resultantes não são homogéneas em tamanho ou lamelaridade. Para muitas aplicações, estas dificuldades não interferir com a interpretação dos dados. No entanto, caso seja necessário, os passos adicionais podem ser incorporados ao dia estreitoe distribuição de tamanhos e diminuir as camadas de membranas, tais como a novas rondas de extrusão, após o encapsulamento, congelação-descongelação, ou diálise 35. Sem dúvida, melhores métodos que burlam estes e outros problemas serão desenvolvidas. Até então, encontramos o protocolo aqui descrito para ser bem adequado para a construção de imitadores celulares.

Livre de células, in vitro reações de transcrição, tradução e geração de vesículas de lipídios sintéticos não são novidade. No entanto, a combinação dos dois para um mímico celular é significativamente mais challenging1-6. E. coli extractos celulares com ou sem T7 ARN polimerase pode ser usada como uma fonte de maquinaria de transcrição-tradução 7,8. Os extractos celulares beneficiem da presença de componentes celulares adicionais que podem facilitar a expressão de proteínas e de dobragem. Alternativamente, uma mistura de ARN individualmente purificados e moléculas de proteína, ou seja, o sistema 9 puro, pode ser usado para mediar a síntese de proteínas intravesicular 4,10-14. O sistema PURE permite a construção de imitadores celulares totalmente definidos e não sofrem da actividade de nuclease encontrada em extractos celulares. Praticamente, isto significa que muito menos do molde de ADN é necessária, facilitando assim os processos com baixa eficácia de encapsulação 11 </sup&gt;. Embora menos freqüentemente usados, imita celulares pode ser construído com extratos de células derivadas de eucariótica cells15. Até o momento, cascatas encapsulados geneticamente codificados e imita celulares que detectam o meio ambiente têm sido relatados 16-18. A maneira mais simples para monitorar reações de transcrição-tradução é medir a fluorescência ou luminescência de elementos geneticamente codificados. Tipicamente, a luciferase do pirilampo ou GFP 19 são usados, embora in vitro reacções são frequentemente medida por marcação radioactiva. Detecção de fluorescência, além disso permite a monitorização das populações de vesículas 20,21 através de métodos baseados em citometria, oferecendo alguns insights sobre a natureza estocástica dos processos biológicos semelhantes. Estes métodos de monitorização têm sido utilizadas para definir um pequeno conjunto de regras de design e de uma biblioteca de peças de partida para construir, incluindo um conjunto de proteínas fluorescentes que são compatíveis com in vitro de transcrição-tradução 22, a influência da organização genética sobre a expressão 22, a actividade de factores sigma 16, e a eficiência de terminadores da transcrição 23. No entanto, ainda há muito que precisa ser feito para aumentar a capacidade de construir previsível, in vitro, os dispositivos geneticamente codificados. Existem vários métodos disponíveis para fazer vesículas. Os métodos mais comuns dependem da geração de uma película lipídica fina sobre uma superfície de vidro, seguido por ressuspensão em meio aquoso solution24. Se a solução aquosa contém maquinaria de transcrição-tradução, por exemplo, então uma fracção das vesículas formadas iria conter os componentes necessários para a produção de proteína. No entanto, a eficiência de encapsulação de tais métodos é baixo, o que significa que somente uma pequena percentagem de vesículas são activas. Muitos dos métodos alternativos caracteriza-se por muito mais ef encapsulamentoiciency explorar a conversão de gotículas de emulsão de óleo-em-água para vesículas. Embora seja provável que tais métodos serão comuns no futuro, actualmente estes métodos sofrem da necessidade de equipamento especializado para dar vesículas com as composições de membrana alteradas 25. Uma vantagem distinta de óleo-em-água para métodos de vesículas é o potencial para controlar lamelaridade membrana. O método aqui descrito baseia-se no protocolo de película fina de lípidos descrito pelo laboratório Yomo 11 com ligeiras modificações, incluindo um passo de homogeneização adicional. Este método é simples, barato, e dá vesículas sólidas bem adequado para o encapsulamento da maquinaria de transcrição-tradução.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Quick Spin Mini-prep kit</td>
			<td style="width:243px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:243px;">NanoDrop 1000</td>
			<td style="width:119px;">NDB767ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">770557</td>
			<td style="width:167px;">MW 760 g/mol 
			Transition Temp -2 &#176;C 
			CAS# 26853-31-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">459836</td>
			<td>Anhydrous, &#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Phenol-choloroform-isoamyl alcohol 25:24:1, for molecular biology use</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P3803-100mL</td>
			<td>Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td>Biotech Grade Fluka</td>
			<td style="width:119px;">496189-1L</td>
			<td>Contain ethanol at 0.5-1.0% v/v as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brown amber glass bottles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89043-518</td>
			<td>55X 48 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi Rotovapor R-210/Sigma</td>
			<td>Z563846EU-1EA</td>
			<td>With jack and water bath, 29/32 joint 240 V</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Analog vortex mixer</td>
			<td style="width:243px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">945300</td>
			<td>Speed 1,000-3,200 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Homogenizer</td>
			<td>IKA T10 Basic Ultra-Turbax</td>
			<td style="width:119px;">3420000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Extruder filters</td>
			<td>Whatman</td>
			<td style="width:119px;">610014</td>
			<td>drain disc 10 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Extruder polycarbonate membrane 400 nm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td style="width:119px;">61007</td>
			<td>nuclepore polycarbonate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Speed vacuum</td>
			<td>Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7970011</td>
			<td>Centritrap DNA concentrator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PURExpress kit</td>
			<td style="width:243px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">NRM #E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAse inhibitor (40,000 U/ml)</td>
			<td style="width:243px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">#M0307S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K (20.2 mg/ml)</td>
			<td style="width:243px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">#EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microscope</td>
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Zeiss Observer Z1with a AxioCam MRm camera</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RealTime</td>
			<td style="width:243px;">CFX96 Real time PCR Detection System (Biorad)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silicon press to seal&#160;&#160;-Molecular Probe</td>
			<td style="width:243px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P18174</td>
			<td>Resistant from&#160; -25-30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Siliconized glass circle cover slides</td>
			<td style="width:243px;">Hampton Research</td>
			<td style="width:119px;">HR3-231</td>
			<td>&#160;&#160; Diameter= 22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:243px;">NIH&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics

Como mudanças de juros a partir de moléculas individuais para sistemas de moléculas, um número crescente de laboratórios têm procurado construir de baixo para cima imita celulares que melhor representam a complexidade da vida celular. Até à data, há uma série de caminhos que podem ser tomados para construir imita celulares compartimentadas, incluindo a exploração de emulsões de água em óleo, os dispositivos microfluidicos e vesículas. Cada uma das opções disponíveis tem vantagens e desvantagens específicas. Por exemplo, as emulsões de água em óleo, dar alta eficiência da encapsulação, mas não se imitam assim a barreira da permeabilidade das células vivas. A principal vantagem dos métodos aqui descritos é que todos eles são fácil e barata de implementar. Maquinaria de transcrição-tradução é encapsulado no interior de vesículas fosfolipídicas através de um processo que explora instrumentação comum, tal como um evaporador centrífugo e uma extrusora. As reacções são monitorizadas por espectroscopia de fluorescência. O protocolos pode ser adaptado para a expressão de proteínas recombinantes, a construção de imita celulares, a exploração dos requisitos mínimos para a vida celular, ou a montagem de um circuito genético.

A microscopia de fluorescência revelou que a fluorescência é observado apenas no interior das vesículas, porque o material extravesicular é enzimaticamente degradada (Figura 3). Para a expressão de mVenus, intravesicular fluorescência começa a ser observada após 1,5 horas, a 37 ° C e atinge máxima intensidade de fluorescência dentro de 6 horas. A temperatura óptima e o tempo de incubação pode variar de acordo com as construções específicas utilizadas. Por exemplo, proteínas fluorescentes diferentes amadurecer bastante diferente de uma forma dependente da temperatura. Em outras palavras, a observação da produção de proteínas não é unicamente dependente da síntese de proteínas e de dobragem, mas também sobre a formação de cromóforos. Síntese geral de proteína pode ser aumentado por incorporação de poros de proteína de membrana para permitir um fluxo de componentes empobrecido necessários para a transcrição e tradução 27. Recomenda-se a realização de um análogo de transcrição-traduçãoção de reacção, na ausência de vesículas para assegurar que a construção genética é explorado funcional. Esta reacção de controlo, é mais facilmente monitorizados por espectroscopia de fluorescência, em vez de microscopia. Figura 4 mostra uma reacção de transcrição in vitro de translação de um construto mVenus codificação. Reações unencapsulated dar muito maior total de intensidades de fluorescência do que reações intravesicular semelhantes. Isto é devido à eficiência de encapsulação e porque o volume total intravesicular é muito menos do que o volume extravesicular (isto é, um efeito de diluição). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. O evaporador rotativo e bomba de vácuo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . Figura 2. A carcaça e as partes da máquina de extrusão são mostradas separadamente. Da esquerda para a direita, seringa, porca de fixação, rolamentos de teflon, a membrana interna suporta com negros anéis que enfrentam um ao outro, extrusora de revestimento externo, e segundo seringas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig3.jpg" width="600px" /> Figura 3. Imagens de fluorescência de produção de proteína mVenus em lipossomas A e C:.. Imagens de campo claro de vesículas multilamelares depois de 1,5 horas e 2,5 horas e B &amp;# 160; D: A produção de mVenus é visualizado por fluorescência (cor verde), após 1,5 e 2,5 horas, respectivamente. Barra de escala é de 20 mM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig4.jpg" width="600px" /> Figura 4. Na reacção de controlo não encapsulado in vitro de transcrição in vitro e tradução de mVenus. A intensidade de fluorescência foi medida a cada 5 minutos ao longo de 4 hr. Os dados foram obtidos com um instrumento de PCR em Tempo Real. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> .

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The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Descrevemos aqui métodos simples para a preparação de vesículas, o encapsulamento de transcrição e maquinaria de tradução, e o controlo da produção da proteína. Os sistemas isentos de células resultante pode ser utilizado como um ponto de partida para a construção de imitadores celulares cada vez mais complexas.

O encapsulamento de transcrição livre de células e Tradução Máquinas em vesículas para a Construção de Mimics celulares

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

the-encapsulation-cell-free-transcription-translation-machinery

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.9K visualizações.  University of Trento.  Descrevemos aqui métodos simples para a preparação de vesículas, o encapsulamento de transcrição e maquinaria de tradução, e o controlo da produção da proteína. Os sistemas isentos de células resultante pode ser utilizado como um ponto de partida para a construção de imitadores celulares cada vez mais complexas. 

Vídeo: The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

Um método para Encapsulation ovário folículo e Cultura em um proteoliticamente Degradáveis ​​3 Sistema Dimensional

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Bioengenharia

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue geometry. The resulting 3D hydrogel-based cellular constructs have been introduced as an alternative to animal experiments for advanced biological studies, pharmacological assays and organ transplant applications. Although hydrogel-based particles and fibers can be easily fabricated, it is difficult to manipulate them for tissue reconstruction. In this video, we describe a fabrication method for micropatterned alginate hydrogel sheets, together with their assembly to form a macro-scale 3D cell culture system with a controlled cellular microenvironment. Using a mist form of the calcium gelling agent, thin hydrogel sheets are easily generated with a thickness in the range of 100 - 200 &#181;m, and with precise micropatterns. Cells can then be cultured with the geometric guidance of the hydrogel sheets in freestanding conditions. Furthermore, the hydrogel sheets can be readily manipulated using a micropipette with an end-cut tip, and can be assembled into multi-layered structures by stacking them using a patterned polydimethylsiloxane (PDMS) frame. These modular hydrogel sheets, which can be fabricated using a facile process, have potential applications of in vitro drug assays and biological studies, including functional studies of micro- and macrostructure and tissue reconstruction.

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

Construção de Fichas de hidrogel modular para micropadronadas Macro-escalado 3D Cellular Arquitetura

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Reprimir a transcrição do Gene redirecionando maquinaria celular com modificadores epigenéticas químicas

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Flash NanoPrecipitation para o encapsulamento de compostos hidrofóbicos e hidrofílicos em nanopartículas poliméricas

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

Preparando proteínas que produzem células sintéticas usando extratos bacterianos livres de células, liposomos e transferência de emulsão

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Finite Element Modelling of a Cellular Electric Microenvironment

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the mechanisms of cell response when exposed to electrical fields can therefore guide the optimization of clinical applications. In vitro experiments aim to help uncover those, offering the advantage of wider input and output ranges that can be ethically and effectively assessed. However, the advancements in in vitro experiments are difficult to reproduce directly in clinical settings. Mainly, that is because the ES devices used in vitro differ significantly from the ones suitable for patient use, and the path from the electrodes to the targeted cells is different. Translating the in vitro results into in vivo procedures is therefore not straightforward. We emphasize that the cellular microenvironment's structure and physical properties play a determining role in the actual experimental testing conditions and suggest that measures of charge distribution can be used to bridge the gap between in vitro and in vivo. Considering this, we show how in silico finite element modelling (FEM) can be used to describe the cellular microenvironment and the changes generated by electric field (EF) exposure. We highlight how the EF couples with geometric structure to determine charge distribution. We then show the impact of time dependent inputs on charge movement. Finally, we demonstrate the relevance of our new in silico model methodology using two case studies: (i) in vitro fibrous Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) poly(styrenesulfonate) (PEDOT-PSS) scaffolds and (ii) in vivo collagen in extracellular matrix (ECM).

This paper presents a strategy for building finite element models of fibrous conductive materials exposed to an electric field (EF). The models can be used to estimate the electrical input that cells seeded in such materials receive and assess the impact of changing the scaffold's constituent material properties, structure or orientation.

Modelagem de elementos finitos de um microambiente elétrico celular

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their cellular source, such as platelet lysate (PL). When used as treatment, EVs are expected to enter the target cells and effect a response from these. In this research, PL-derived EVs have been studied as a cell-free treatment for osteoarthritis (OA). Thus, a method was set up to label EVs and test their uptake on cartilage explants. PL-derived EVs are labeled with the lipophilic dye PKH26, washed twice through a column, and then tested in an in vitro inflammation-driven&#160;OA model for 5 h after particle quantification by nanoparticle tracking analysis (NTA). Hourly, cartilage explants are fixed, paraffined, cut into 6 &#181;m sections to mount on slides, and observed under a confocal microscope. This allows verification of whether EVs enter the target cells (chondrocytes) during this period and analyze their direct effect.

Here, we present a protocol to label platelet lysate-derived extracellular vesicles to monitor their migration and uptake in cartilage explants used as a model for osteoarthritis.

Rotulagem de vesículas extracelulares para monitoramento de migração e absorção em Explants de cartilagem

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous developments have made the CFPS platform more accessible to new users and have expanded the range of applications. For lysate based CFPS systems, cell extracts can be generated from a variety of organisms, harnessing the unique biochemistry of that host to augment protein synthesis. Within the last 20 years, Escherichia coli (E. coli) has become one of the most widely used organisms for supporting CFPS due to its affordability and versatility. Despite numerous key advances, the workflow for E. coli cell extract preparation has remained a key bottleneck for new users to implement CFPS for their applications. The extract preparation workflow is time-intensive and requires technical expertise to achieve reproducible results. To overcome these barriers, we previously reported the development of a 24 hour cell-free autoinduction (CFAI) workflow that reduces user input and technical expertise required. The CFAI workflow minimizes the labor and technical skill required to generate cell extracts while also increasing the total quantities of cell extracts obtained. Here we describe that workflow in a step-by-step manner to improve access and support the broad implementation of E. coli based CFPS.

This work describes the preparation of cell extract from Escherichia coli (E. coli) followed by cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in under 24 hours. Explanation of the cell-free autoinduction (CFAI) protocol details improvements made to reduce researcher oversight and increase quantities of cell extract obtained.

De células à síntese de proteínas livres de células dentro de 24 horas usando fluxo de trabalho de autoindução sem células

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous ...

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a natural producer of chloramphenicol, jadomycin, and pikromycin, which makes it an attractive candidate&#160;as a next-generation synthetic biology chassis. Therefore, genetic tools that accelerate the development of S. venezuelae ATCC 10712, as well as other Streptomyces spp. models, are highly desirable for natural product engineering and discovery. To this end, a dedicated S. venezuelae ATCC 10712 cell-free system is provided in this protocol to enable high-yield heterologous expression of high G+C (%) genes. This protocol is suitable for small-scale (10-100 &#956;L) batch reactions in either 96-well or 384-well plate format, while reactions are potentially scalable. The cell-free system is robust and can achieve high yields (~5-10 &#956;M) for a range of recombinant proteins in a minimal setup. This work also incorporates a broad plasmid toolset for real-time measurement of mRNA and protein synthesis, as well as in-gel fluorescence staining of tagged proteins. This protocol can also be integrated with high-throughput&#160;gene expression characterization workflows or the study of enzyme pathways from high G+C (%) genes present in Actinomycetes genomes.

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

This protocol details an enhanced method for synthesizing high yields of recombinant proteins from a Streptomyces venezuelae cell-free transcription-translation (TX-TL) system.

Um kit de ferramentas de transcrição de transcrição de estreptomíceos de alto rendimento para biologia sintética e aplicações de produtos naturais

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a ...

Rapid Encapsulation of Reconstituted Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

Giant unilamellar vesicles (GUVs) are frequently used as models of biological membranes and thus are a great tool to study membrane-related cellular processes in vitro. In recent years, encapsulation within GUVs has proven to be a helpful approach for reconstitution experiments in cell biology and related fields. It better mimics confinement conditions inside living cells, as opposed to conventional biochemical reconstitution. Methods for encapsulation inside GUVs are often not easy to implement, and success rates can differ significantly from lab to lab. One technique that has proven to be successful for encapsulating more complex protein systems is called continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE). Here, a cDICE-based method is presented for rapidly encapsulating cytoskeletal proteins in GUVs with high encapsulation efficiency. In this method, first, lipid-monolayer droplets are generated by emulsifying a protein solution of interest in a lipid/oil mixture. After being added into a rotating 3D-printed chamber, these lipid-monolayered droplets then pass through a second lipid monolayer at a water/oil interface inside the chamber to form GUVs that contain the protein system. This method simplifies the overall procedure of encapsulation within GUVs and speeds up the process, and thus allows us to confine and observe the dynamic evolution of network assembly inside lipid bilayer vesicles. This platform is handy for studying the mechanics of cytoskeleton-membrane interactions in confinement.

This article introduces a simple method for expeditious production of giant unilamellar vesicles with encapsulated cytoskeletal proteins. The method proves to be useful for bottom-up reconstitution of cytoskeletal structures in confinement and cytoskeleton-membrane interactions.

Encapsulamento rápido do Citoesqueleto Reconstituído Dentro de Vesículos Unilamellar Gigantes

Giant unilamellar vesicles (GUVs) are frequently used as models of biological membranes and thus are a great tool to study membrane-related cellular ...