A bióquips de DNA é uma plataforma de pesquisa atraente para a biologia auto-sintética, originalmente desenvolvida pelo grupo BASF, que permite o funcionamento de circuitos genéticos in vitro por longos períodos de tempo. Com este protocolo, esperamos disponibilizar essa tecnologia para uma gama mais ampla de pesquisadores. Nosso método, chamado litografia bephore, representa uma estratégia para a imobilização do DNA com base na reação de deslocamento da cadeia de DNA.
A força dessa técnica está em suas capacidades litográficas de várias etapas, sua simples reprodutibilidade e a disponibilidade comercial de todos os componentes. Semelhante a outras soluções biochip, o bephore pode ser combinado com diferentes tecnologias. Por exemplo, escovas genéticas funcionais podem ser montadas dentro de micropartidás para expressão proteica.
Para começar, prepare uma mistura de RCA misturando cinco partes de água com uma parte de uma solução de 30% de amônia em um copo de vidro. Aqueça a mistura a 70 graus Celsius em uma placa quente enquanto mexe. Uma vez que atinja 70 graus Celsius, adicione uma parte de peróxido de hidrogênio 30%.
Em seguida, coloque um wafer de silício de 100 milímetros de diâmetro na solução, para remover material orgânico e partículas dele. Depois de 30 minutos, retire o substrato, enxágue-o bem com água de uma garrafa de lavagem e seque-o com uma arma de nitrogênio. Proceda imediatamente com a PEGylation do substrato.
Para isso, primeiro diluir biotina-PEG-Silane em tolueno seco a 5 miligramas por mililitro, e vórtice a solução até que esteja bem misturada. Com o substrato colocado em uma placa de vidro Petri, lentamente pipeta a solução sobre o substrato, cobrindo toda a superfície, mas evite permitir que a solução flua sobre a borda. Uma vez que a superfície esteja coberta, feche a placa de Petri e adicione uma tampa adicional.
Após 30 minutos, retire a tampa e adicione aproximadamente 40 mililitros de álcool isopropílico à placa de Petri. Em seguida, pegue o substrato, enxágüe-o novamente completamente com álcool isopropílico, e seque-o com uma arma de nitrogênio. Quando secar, armazene o substrato no escuro até que seja necessário.
Prepare um substrato usando um cortador de vidro ou um bisturi para formar um centímetro por pedaços de um centímetro. Em seguida, adicione uma simples marca de alinhamento, fazendo um pequeno arranhão do centro em direção a uma borda do substrato. Tire qualquer pequena partícula do chip usando uma arma de nitrogênio.
Em seguida, misture duas gotículas de uma cola de silicone de dois componentes e aplique a cola na superfície do chip, deixando a área ao redor da ponta do arranhão em branco. Lá a cola fornece uma barreira hidrofóbica, mantendo soluções aquosas no chip. Isso facilita as etapas subsequentes de lavagem e reduz a quantidade de DNA necessária para incubações.
Em um passo posterior, a cola pode ser facilmente descascada. Nas etapas a seguir, o DNA fotocleásable é manuseado apenas em um ambiente de luz amarela. Cubra o chip com cerca de 10 microliters de uma mistura bephore à temperatura ambiente, e coloque o chip em uma caixa parcialmente cheia de água para reduzir a evaporação.
Depois de uma hora, lave o chip várias vezes com PBS para remover qualquer mistura de bephore não ligada. Em seguida, adicione 10 microliters da mistura de passivação ao chip. Depois de duas horas, lave o chip várias vezes com PBS para remover os agentes de passivação sem limites.
Corte uma máscara de foto impressa no tamanho apropriado para caber um suporte de máscara adequado. Insira-o na posição do campo stop e use as marcas de alinhamento para alinhar a máscara no suporte. Com o substrato colocado no estágio de microscopia, insira um filtro vermelho no caminho de iluminação e concentre-se na superfície do substrato.
Em seguida, navegue até a região do substrato que será exposta. Em seguida, insira o suporte da máscara, bloqueie a iluminação e mude para o filtro UV. Em baixa intensidade de luz, abra o obturador e use a câmera para focar rapidamente a máscara no substrato.
Com o substrato agora alinhado e a máscara em foco, bloqueie o caminho da luz para a câmera, e ilumine o substrato em alta intensidade de luz para o tempo de exposição desejado. Após a exposição, remova a amostra do microscópio e remova cuidadosamente o máximo de tampão possível do substrato sem secá-la. Em seguida, adicione 10 a 20 microliters de DNA com a sequência para fixação à superfície.
Coloque o substrato em uma caixa molhada para evitar que ele seque, e incubar o DNA no substrato por duas horas em temperatura ambiente. Para observar a expressão genética compartimentalizada em um microscópio invertido, primeiro prepare separadamente as duas partes do suporte da amostra. Comece colando um chip bephore com um pincel genético imobilizado no suporte do chip, usando fita adesiva de dois lados.
Em seguida, adicione um pouco de graxa de vácuo ao redor do orifício central da parte inferior do suporte e insira o suporte do chip. Agora monte a parte superior do suporte. Corte um fino chip PDMS com compartimentos o mais pequeno possível, deixando um canal aberto para um lado para depois permitir a troca de resíduos e moléculas precursoras por difusão Em seguida, o plasma-treat um deslizamento de tampa de vidro na parte de trás do chip PDMS com plasma de oxigênio.
Imediatamente após o tratamento, coloque o chip PDMS no centro do escorregador de vidro, com os compartimentos apontando para cima. Em seguida, asse o copo com o PDMS por uma hora a 70 graus Celsius. Pouco antes de montar todo o suporte de amostra, trate o slide de vidro com o chip PDMS como antes.
Em seguida, adicione um pouco de graxa de vácuo ao redor do grande orifício do suporte superior e coloque o deslizamento de vidro com o PDMS sobre ele. Pressione suavemente o vidro sobre a graxa. Remova cuidadosamente o buffer do chip e lave-o uma vez com 10 microliters de sistema de auto-expressão.
Em seguida, adicione 60 microliters de sistema de auto-expressão no chip e remova a cola de silicone de dois componentes das bordas. Agora, adicione 20 microliters do sistema de expressão ao PDMS. Depois de colocar a gota no PDMS, verifique rapidamente no microscópio estereoscópico que os compartimentos estão bem molhados e sem bolhas de ar.
Se houver bolhas de ar, tente lavá-las. Para montar as duas peças do suporte, e para alinhar câmaras e pincéis de DNA, trabalhe sob um microscópio estereoscópico. Imobilize o suporte inferior com um braço de pegação para que os dois parafusos e asa-de-asa sejam facilmente acessíveis com ambas as mãos.
Insira o suporte superior no suporte inferior e abaixe-o até que as gotículas do sistema de livre-célula se fundam. Em seguida, verifique se os compartimentos e a marca de alinhamento estão em uma região semelhante no plano XY. De baixo, estrague as asas até tocarem na parte inferior do suporte.
Ao alinhar os compartimentos e o chip no plano XY, aperte suavemente as pontas das asas. Esta etapa requer alguma experiência, e depende da construção do titular da amostra. O PDMS deve ser pressionado sobre o chip apenas com força suave.
Em seguida, pulverize uma esponja no compartimento anti-evaporação com água e insira o suporte na caixa. Em seguida, encha uma seringa de cinco mililitros com cola de silicone de dois componentes e use-a para selar a caixa. Finalmente, transfira a caixa para um microscópio controlado pela temperatura, e imagem o pincel de DNA e a reação usando microscopia de fluorescência.
Um processo litográfico de duas etapas, aqui realizado em um escorregador de vidro bephore, produz padrões sobrepostos de fios de DNA fluorescentemente rotulados. Nesta demonstração de expressão genética on-chip, o DNA é imobilizado na câmara à esquerda. Quando exposto à mistura de expressão, a proteína fluorescente amarela YPet é sintetizada a partir do DNA imobilizado.
Para avaliar a atividade do sistema de expressão genética, a recuperação da fluorescência é observada após uma etapa de branqueamento. Em duas horas, a intensidade da fluorescência recuperou-se rapidamente. No entanto, após quatro e seis horas, não se recuperou, indicando que sem um novo suprimento da mistura de expressão, a reação terminou por volta da hora quatro.
Embora a expressão genética seja limitada em um sistema fechado, ela pode ser sustentada por períodos mais longos de tempo, fornecendo os compartimentos de expressão com moléculas precursoras adicionais via micro-fluidics. O método bephore é usado para imobilizar oligonucleotídeos ou DNA de comprimento genético, que pode ser aplicado para construir sistemas de escovas de DNA interativas para expressão auto-regênica. A técnica também pode ser utilizada para outras aplicações em biofísica, como estudos de fluorescência de moléculas únicas.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ser capaz de fabricar bióps bephore de wafers ou slides de vidro, e integrá-los em seus projetos de pesquisa.
