私たちは、原稿の重要な読書のための有用な議論とクリスキャリーのためのユルゲン·Sollのに感謝したいと思います。このプロジェクトは、（SSに助成金​​番号SFB 1035、プロジェクトA04とRSに22分の187の操作を行います）、DFGとフォン·デア·chemischenインダストリーによって資金を供給された。

1。 BIFCの形質転換は、アグロバクテリウム中の構築<ol><li> BIFC構築物のクローニング<ol><li>隣接のattB-部位を含むオリゴヌクレオチドを​​用いて、適切なテンプレートから目的の遺伝子を増幅する。プルーフリーディングポリメラーゼを用いてPCRを行う。フラグメントサイズに応じて設計したプライマーの組み合わせ、および伸長工程の長さにアニーリング工程の長さを適合させる。アガロースゲル電気泳動によってPCR産物を確認し、PCRクリーンアップキットを使用して、それを精製する。 </li><li>得られた断片とのBP反応とBPリコンビナーゼを使用して、エントリーベクターを実行します。エントリーベクターの150 ngののattB-PCR産物の15から150 ngのを混ぜて、BPリコンビナーゼの2μlを添加し、8μlの全量を、TE緩衝液でいっぱいに。 RTで1時間反応をインキュベートし、37℃で10分間、2μlのプロテ​​イナーゼKを添加することにより反応を停止</li><li> コンピテントに反応全体を変換する大腸菌 DH5α;細胞およびベクターへのDNA断片の正確な挿入のためにコロニーPCRによって得られたコロニーを選別。陽性プラスミドのDNA配列決定は、変異の有無を確認するために行われる。 </li><li> LRリコンビナーゼを使用して適切なデスティネーションベクターでLR組換えについて得られたエントリークローンを使用してください。デスティネーションベクターの150 ngのエントリーベクターの50〜150 ngのを混ぜて、1μlのLRリコンビナーゼを追加し、5μlの全量を、TE緩衝液でいっぱいに。 RTで1時間反応をインキュベートし、37℃で10分間、1μlのプロテ​​イナーゼKを添加することにより反応を停止</li><li>ベクターへのDNA断片の正確な挿入のためにコロニーPCRによりコロニーを得たコンピテント大腸菌DH5α細胞とスクリーンへの反応全体を変換します。 DNA配列決定は、この段階では必要ではない。 </li><li>高純度を確保するために、プラスミドミニキットを用いてプラスミドDNAを単離する。 </li></ol></li><li>化学的にコンピテントアグロバクテリウムの調製（AGL1株、リファンピシンおよびカルベニシリン耐性） <ol><li>ストリークうち保存培養からのアグロバクテリウムとは、28℃で24時間、成長する</li><li>単一コロニーを5ミリリットルのLB培地に接種し、28℃で一晩インキュベート</li><li>一晩培養物2mlを、50 mlのLB培地に接種し、OD 600が1.0 になるまで28℃で約4時間成長する。 </li><li> 4℃で15分間、3,000×gで細胞を遠心分離し、氷冷のCaCl 2（10mM）を1mlの滅菌ペレットを再懸濁する。このステップの後、氷上で細胞を維持する。 </li><li> -80℃で液体窒素とストアにすぐに凍結し、細胞のアリコート（100μL）を準備</li></ol></li><li>化学的にコンピテントアグロバクテリウムの変容<ol><li>氷上で有能AGL1細胞の1アリコートを解凍。細胞へのプラスミドDNAの1〜2μgのを追加します。 37℃で、氷上で5分間インキュベートし、液体窒素で5分間で5分間細胞とSに600μlのLB培地を追加28℃で4時間650rpmでメルルーサ</li><li> 8,000×gで1分間細胞を遠心分離し、上澄みを捨てる。適切な抗生物質を含むLBプレート上の残りのLB培地とプレートの50μlにペレットを再懸濁します。プレートをシールし、28℃で2日間インキュベートコロニーPCRによるプラスミドの存在のための画面コロニー。 </li><li>適切な抗生物質を含む5 mlのLB培地で1陽性コロニーを接種し、一晩28℃でインキュベートする。 500μlの50％滅菌グリセロールで一晩培養液500μlを混合し、-80℃で凍結</li><li>タバコの葉の一過性の形質転換のためにグリセロールストックから直接、適切な抗生物質を含むLB培地でアグロバクテリウムを接種する。 </li></ol></li></ol> 2。タバコ葉の一過性の形質転換<ol><li>アグロバクテリアの成長<ol><li>以下のストック溶液を調製：アセトシリンゴン（150ミリメートル、70で溶解％エタノール）、-20℃でアリコートとしてストアMES / KOH（0.1M）pHは5.7、4℃（長期保存中に細菌の増殖を防ぐために0.2μmのフィルターを通して滅菌フィルター）で保存し、 塩化マグネシウム（1 M）株、室温で保存する。 </li><li>無菌50mlチューブへの関心のプラスミドを含有するAGL1グリセロールストック培養液50μlとの適切な抗生物質を含む10mlのLB培地に接種し、1.0の間のOD 600まで、190 rpmで振とうし、少なくとも24時間、28℃でインキュベート-2.0に達した。 </li><li> 15分間3000×gで遠心分離菌。作りたての浸潤培地中のペレット[ 塩化マグネシウム（10ミリモル）、MES / KOH（10 mM）のpHは5.7、アセトシリンゴン（150μM）]を再懸濁し、OD 1.0の600にサスペンションを調整します。 </li><li>暗闇の中で2時間のオーバーヘッドシェーカーでアグロバクテリウム細胞をインキュベートする。次いで、細胞を浸潤のために使用することができる。 </li></ol></li><li>タバコの葉の浸潤<ol><li> 3を使用してください週齢のタバコ（ ベンサミアナタバコ ）の植物。浸透のためのいくつかの古い葉を選択してください。 </li><li>興味の構築物を運ぶアグロバクテリウム等容量（3ミリリットルずつ）混ぜる。浸透のための針なしに5ミリリットルの注射器を取る。いくつかの場所で、葉の下側に注射器を押すことによって、タバコの葉に慎重に細胞懸濁液に潜入。 </li><li>植物を水と2日間、暗闇の中でそれらを残す。 </li></ol></li></ol> 3。プロトプラストの準備タバコの葉のプロトプラスト調製は、クープら 16から適応し、わずかに変更した。 <ol><li>バッファの準備<ol><li> F-PCN媒体を準備します。マクロの塩は、[3（1012μg/ mlの）をKNO、塩化カルシウム2•2H 2 O（440μg/ ml）を、硫酸マグネシウム4•7H 2 O（370μg/ ml）を、KH 2 PO 4（ 170μg/ ml）を、NH 4-コハク酸[（20ミリモル、2Mの株式ゾルを調製ution]（コハク酸（236μg/ ml）を、およびNH 4 Cl水溶液（106μg/ mlの）を、溶解させてpHを5.8に調整）、マイクロ塩は、[EDTA-鉄（III）、Na塩（40μg/ mlの）× KJ（0.75μg/ ml）を、H 3 BO 3（3μg/ ml）を、のMnSO 4•H 2 O（10μg/ ml）を、硫酸亜鉛4•7H 2 O（2μg/ ml）を、 硫酸ナトリウムのMoO 4• 7H 2 O（0.25μg/ ml）を、 硫酸銅•5H 2 O（0.025μg/ ml）を、のCoCl 2•6H 2 O（0.025μg/ ml）を]、MES（390μg/ ml）を、グルコース（約80μgの/ ml）の浸透圧は550 mOsmで、pHは5.8（KOH）。 -20℃での分量を保存する</li><li> F-PINの媒体を準備し、F-PCNとしてではなく、グルコース利用のスクロース（約110μg/ ml）を、浸透圧は550 mOsmで、pHは5.8（KOH）の全成分。 -20℃での分量を保存する</li><li> 150のNaCl、125のCaCl 2、5mMのKCl、2mMのMES、浸透圧は550から580 mOsmで、pHは5.7（KOH）：W5メディアを準備します。 4℃で保存、C（長期保存中に細菌の増殖を防ぐために0.2μmフィルターで無菌フィルター）。 </li><li>プロトプラストを単離するための新鮮な酵素溶液（0.1グラムセルラーゼ、10ミリリットルのFピン0.03グラムのmacerozym）を準備します。 10分間、55℃で溶液をインキュベートし、室温まで冷却。 10ミリリットルの溶液に、10％のBSAを100μlを加える。 </li></ol></li><li>プロトプラストの分離<ol><li>ペトリ皿に1浸透させ、葉を置き、新​​鮮な酵素溶液を加える。約0.5cm 2サイズの断片に葉をカットする新しいカミソリの刃を使用しています。真空浸透フラスコに酵素液と葉の部分を転送し、気泡が（非常に慎重に解放真空）の葉から出てくるまで、真空を約20秒間浸透させる。 </li><li>暗闇の中で40 rpmで90分間、フラスコを振る。 </li><li> 90 rpmで1分間振とうすることによりプロトプラストを放します。 15ミリリットル遠心チューブ（丸底）にガーゼ（100μM）に溶液をろ過する。 </li&gt; <li> 2ミリリットル、室温で70 XG（緩加速と減速）で10分間のF-PCNバッファと遠心でプロトプラスト溶液を重ねる。 </li><li>プロトプラストを無傷の酵素溶液及びF-PCNの界面に蓄積する。新鮮な遠心管にそのままプロトプラストを転送し、W5緩衝液で一杯に広い開口部1ミリリットルピペットチップを取る。プロトプラストをペレットに100 XG（緩加速と減速）で2分間遠心分離する。 </li><li>プロトプラストの量に応じて、約200μlのW5バッファにピペット再懸濁ペレットを使用して、慎重に上清を除去します。 </li><li>常に完全なプロトプラストの破裂を防ぐために、広い開口部のヒントを参考にしてください。 </li></ol></li></ol> 4。レーザー走査顕微鏡<ol><li>試料調製<ol><li>顕微鏡用スライド（2センチメートル離れて）を中心に、シール材の二つの小さな細片を貼り付けます。ストリップ間のプロトプラスト溶液20μlを置き、慎重にカバーガラスを配置上に。シーラントストリップは、プロトプラストをカバーガラスで押しつぶされていないことを確認してください。 </li><li>総葉のサンプルについては葉から1cmの部分をカットし、上向きに葉の下側を顕微鏡スライド上に置きます。約30μlのH 2 Oを追加する上にカバーガラスを配置し、両面に粘着テープでしっかりと固定します。 </li></ol></li><li>共焦点イメージング顕微鏡の設定<ol><li> TCS SP5：イメージングは​​ライカ、型から共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて行われる。倍率ためのイメージング媒体としてグリセリンと63Xの大きさは、対物レンズ（HCX PL APO CS）を使用しています。開口数を1.3に設定します。ライカ·アプリケーション·スイート/評価のための高度な蛍光ソフトウェアを（補足データS1を参照）を使用します。 </li><li> 515 nmでの再構成BIFC信号を監視し、495から550まで1 PMT検出器の放射帯域幅を設定するために18％の強度に30％のアルゴンレーザーおよび488nmのレーザパワーを設定する。 </lI&gt; <li>クロロフィルの自家蛍光をモニターするには、650から705秒PMT検出放射帯域幅を設定。 </li><li> mCherry信号はヘリウムネオンレーザー561を使用し監視するために、レーザの強度百分の561から18と587から610まで三PMT検出器の放射帯域幅を設定。 </li><li>すべてのPMT検出器チャネルの画像は、同じゲイン設定（ゲインがバックグラウンド信号を除外するために800〜900の間でなければなりません）で撮影されていることを確認してください。 </li><li> 100Hzのスキャン速度で1024×1024ピクセルの形式幅/高さで撮影する。 </li><li> Z-スタッキングのために各スタック間0.5μmの最大距離を使用しています。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Citovsky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+interacting+proteins+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta.">Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).</li><li>Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+to+study+protein-protein+interactions+in+living+plant+cells.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells.</a> Methods Mol. Biol. 479, 189-202 (2009).</li><li>Weinthal, D., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein-protein+interactions+in+plant+cells+by+bimolecular+fluorescence+complementation+assay.">Imaging protein-protein interactions in plant cells by bimolecular fluorescence complementation assay.</a> Trends Plant Sci. 14, 59-63 (2009).</li><li>Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+protein-protein+interactions+in+plants+by+bimolecular+fluorescence+complementation.">The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).</li><li>Ohad, N., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+to+assay+protein-protein+interaction+in+plants.">Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants.</a> Methods Mol. Biol. 655, 347-358 (2010).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Lee, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+a+cDNA+library+for+protein-protein+interactions+directly+in+planta.">Screening a cDNA library for protein-protein interactions directly in planta.</a> Plant Cell. 24, 1746-1759 (2012).</li><li>McFarlane, H. E., Shin, J. J., Bird, D. A., Samuels, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+ABCG+transporters,+which+are+required+for+export+of+diverse+cuticular+lipids,+dimerize+in+different+combinations.">Arabidopsis ABCG transporters, which are required for export of diverse cuticular lipids, dimerize in different combinations.</a> Plant Cell. 22, 3066-3075 (2010).</li><li>Dunschede, B., Bals, T., Funke, S., Schunemann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+studies+between+the+chloroplast+signal+recognition+particle+subunit+cpSRP43+and+the+full-length+translocase+Alb3+reveal+a+membrane-embedded+binding+region+in+Alb3+protein.">Interaction studies between the chloroplast signal recognition particle subunit cpSRP43 and the full-length translocase Alb3 reveal a membrane-embedded binding region in Alb3 protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35187-35195 (2011).</li><li>Gehl, C., Waadt, R., Kudla, J., Mendel, R. R., Hansch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+GATEWAY+vectors+for+high+throughput+analyses+of+protein-protein+interactions+by+bimolecular+fluorescence+complementation.">New GATEWAY vectors for high throughput analyses of protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol. Plant. 2, 1051-1058 (2009).</li><li>Qbadou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+chaperone+Hsp90+delivers+precursor+proteins+to+the+chloroplast+import+receptor+Toc64.">The molecular chaperone Hsp90 delivers precursor proteins to the chloroplast import receptor Toc64.</a> EMBO J. 25, 1836-1847 (2006).</li><li>Schweiger, R., Muller, N. C., Schmitt, M. J., Soll, J., Schwenkert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtTPR7+is+a+chaperone+docking+protein+of+the+Sec+translocon+in+Arabidopsis.">AtTPR7 is a chaperone docking protein of the Sec translocon in Arabidopsis.</a> J. Cell Sci. , (2012).</li><li>Schweiger, R., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtTPR7+as+part+of+the+Arabidopsis+Sec+post-translocon.">AtTPR7 as part of the Arabidopsis Sec post-translocon.</a> Plant Signal Behav. 8, (2013).</li><li>Nelson, B. K., Cai, X., Nebenfuhr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolored+set+of+in+vivo+organelle+markers+for+co-localization+studies+in+Arabidopsis+and+other+plants.">A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants.</a> Plant J. 51, 1126-1136 (2007).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+analysis+as+a+probe+of+protein+interactions+in+living+cells.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells.</a> Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).</li><li>Koop, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+foreign+sequences+into+the+tobacco+plastome+via+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation.">Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation.</a> Planta. 199, 193-201 (1996).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

BIFC実験を計画する際に、いくつかの点を考慮する必要があります。目的のタンパク質についての構造情報は必要ありませんが、トポロジー、膜貫通タンパク質で作業するとき知る必要がある。蛍光タンパク質は、同じ細胞内区画内に存在する又は相互作用を可能にするために、膜の同じ側に直面している。 N末端標的化配列を必要とするタンパク質を分析する場合、当然、唯一のC-末端タグ?...

タンパク質複合体の形成を研究およびインビボでの植物細胞におけるそれらの局在化は、セルラーネットワークを調査するために不可欠であり、シグナリングおよび代謝プロセス。 BIFCを直接生きた植物細胞1-5内でのそれらの天然の環境におけるタンパク質-タンパク質相互作用の可視化を可能にする。 BIFC中で再構成した蛍光タンパク質と蛍光タンパク質鉛の二非蛍光N-およびC-末端フラグメントの相補性に近づく。多くの異なる蛍光タンパク質の断片タンパク質相互作用を検出するために使用されており、 例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）、化学的に三つの異なる残基6によって形成された発色団。蛍光タンパク質は、目的の両方のタンパク質に融合させることができる2つの非蛍光フラグメントを生じ、ループ又はβ-ストランド内半減することができる。アッセイは、任意の細胞内compartmeにおける相互作用を検出するために使用することができるntの遺伝子的に融合タンパク質を発現するように修飾することができる任意の好気的に成長する生物または細胞において。 2つのタンパク質が、細胞内で近接するようになった場合は、蛍光が再構成され、外因性蛍光団又は染料3を添加せずに顕微鏡によりモニターすることができる。 タンパク質は容易にタバコのアグロバクテリウム媒介形質転換を利用して表現することができるので、タバコ（ ニコチアナ·ベンサミアナ ） が発生構築物、葉、植物タンパク質との相互作用を可視化するための便利なモデル生物であることが証明された。アグロバクテリウムは、植物細胞に目的の遺伝子の伝達を媒介する酵素をコードする、いわゆるTiプラスミド（腫瘍誘発）を使用します。 BIFCは、可溶性のためだけでなく、すべての細胞区画内膜タンパク質のための十分に適用可能であり、成功して、生体内でのタンパク質相互作用識別するだけでなく、相互作用部位を分析するために、過去数年にわたり使用されてきた7-9タンパク質内。導入された遺伝子の発現の際に、蛍光タンパク質の相互作用は、例えば、小胞体（ER）などのより大きな細胞構造、原形質膜又は葉緑体に適している、葉を直接可視化することができる。しかし、より洗練された構造における局在化を監視するために、例えば、葉緑体エンベロープは、形質転換タバコの葉から単離されたプロトプラストの蛍光を可視化することが望ましい。 C-末端またはN-末端蛍光タグのいずれかを含むBIFCベクトルのセット10は、植物におけるBIFCアプローチのために使用されなければならない。後述のプロトコルは、テトラトリコペプチド反復タンパク質ドッキングToc64とAtTPR7は葉緑外側エンベロープそれぞれ小胞体、11-13に存在する含有（TPR）ドメインと細胞質ゾルの熱ショックタンパク質90（HSP90）の相互作用を研究するために使用した。この目的のために、HSP90は、Ctを融合させたSCFPのerminal一部（SCFP C）。タグは、N末端TPRドメイン型クランプするHSP90のC末端MEEVD結合モチーフのアクセシビリティを確保するためにシャペロンに融合した。並行して、ビーナス（金星N）のN末端 ​​部分は、それぞれ、ドッキングタンパク質Toc64とAtTPR7を含むTPRドメインの細胞質ゾルドメインに融合した。ネガティブコントロールとして、我々は細胞質ゾルに存在し、したがって、適切なコントロールであるだけにSCFP Cの可溶性C末端部分をクローニングした。 研究されたタンパク質の蛍光標識は、近接することにより、蛍光シグナルの再構成を可能にするために、同じ細胞区画に直面している。再構成された蛍光シグナルの局在を決定するために、異なる蛍光タグに融合されたマーカータンパク質の相互作用の細胞内局在を実証するために同時形質転換することができる。 mCherrryに融合ERマーカータンパク質は、同時に形質転換したAtTPR7 14に位置し、ER例。クロロフィルの自家蛍光はToc64例で葉緑のマーカーを務めた。これにより細胞質ゾルのHSP90シャペロンとそれぞれToc64とAtTPR7のin vivoでの相互作用だけでなく、タバコの葉を直接監視することができるだけでなく、相互作用の細胞内局在を調べることができる。 BIFCは、タンパク質 - タンパク質相互作用を研究する他の方法に相補的なアプローチとして適している。免疫共沈降する又はインビトロプルダウン実験で比較し、例えば、特定の抗体は、目的のタンパク質に利用可能である必要はなく、タンパク質、特に膜タンパク質のために、挑戦することができる、組換えによってin vitroで発現される必要はない。蛋白質が融合した蛍光タグ15との相互作用によって捕捉されるので、また一時的な相互作用は、BIFCを用いてモニターすることができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="888">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">3&#39;,5&#39;-Dimethoxy-4&#39;-hydroxyacetophenone</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">D134406</td>
			<td style="width:195px;">Acetosyringone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Cellulase, Onozuka-R10</td>
			<td style="width:147px;">Serva</td>
			<td style="width:255px;">16419</td>
			<td>from Trichoderma viridae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Macerozyme R-10&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Serva</td>
			<td style="width:255px;">28302</td>
			<td>from Rhizopus sp</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:293px;">GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">11789-(020)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">11791-(020)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:255px;">27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit</td>
			<td style="width:147px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:255px;">740609-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">pDEST-GWVYNE</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">pDEST-VYNE(R)GW</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:293px;">pDEST-SCYCE(R)GW</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves

多くのタンパク質は他のタンパク質と一過性に相互作用するか、それらの生物学的機能を実行するために多タンパク質複合体に組み込まれる。二分子蛍光相補性（BIFC）は、植物細胞内でこのような相互作用を監視するin vivo法である。提示されたプロトコルで調べ候補タンパク質は、蛍光タンパク質の相補的な半分に融合され、各構築物は、アグロバクテリウム媒介形質転換を介して植物細胞に導入される。続いて、タンパク質を一過性にタバコの葉において発現され、復元された蛍光シグナルは、無傷の細胞における共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて検出することができる。これは、相互作用自体だけでなく可視化を可能にするだけでなく、タンパク質複合体の細胞内局在を決定することができる。この目的のために、蛍光タグを含むマーカー遺伝子は、従って、例えば、tのような細胞構造を視覚化する、BIFC構築物とともに同時発現され得る彼は胞体、ミトコンドリア、ゴルジ装置または原形質膜を小胞体。蛍光シグナルは直接葉表皮細胞において、または容易に形質転換されたタバコの葉から単離することができる単一のプロトプラスト、のいずれかでモニターすることができる。 BIFCは、理想的には、生細胞内でそれらの天然の環境の中でのタンパク質 - タンパク質相互作用を研究するために適している。しかしながら、発現が強力なプロモーターによって駆動されなければならず、相互作用パートナーを相互作用による機構を妨害する可能性があり、比較的大きな蛍光タグの融合物に変更されていることを考慮しなければならない。それにもかかわらず、BIFCは、例えば共免疫沈降、タンパク質-タンパク質相互作用、 インビトロでのプルダウンアッセイまたは酵母ツーハイブリッド実験を調査する他の一般的に適用される方法への優れた相補的なアプローチである。

この例では、膜結合タンパク質AtTPR7とToc64とサイトゾルの分子シャペロンHSP90との相互作用をモニターするためにBIFC法を用いた。 AtTPR7はSecトランスの一部であり、おそらくER膜への翻訳後転座のために分泌プレタンパクを提供し、サイトゾルシャペロンと相互作用する。同様に、葉緑体の外封筒にToc64は、HSP90に関連する葉緑体プレタンパクを受信することにより、翻訳後の輸入に作用する。?...

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Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

インビボでのタンパク質複合体の形成は、二分子蛍光相補性によって視覚化することができる。相互作用パートナーは、蛍光タグの相補的部分に融合し、一過性にタバコの葉で表現、2つのタンパク質の接近したとき、再構成可能な蛍光シグナルをもたらしている。

タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

protein-protein-interactions-visualized-bimolecular-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

20.7K ビュー.  Ludwig-Maximilians-Universität, München.  インビボでのタンパク質複合体の形成は、二分子蛍光相補性によって視覚化することができる。相互作用パートナーは、蛍光タグの相補的部分に融合し、一過性にタバコの葉で表現、2つのタンパク質の接近したとき、再構成可能な蛍光シグナルをもたらしている。 

ビデオ: Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

植物プロトプラストの蛍光活性化細胞選別

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

生物学

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

ヘリオス遺伝子銃を用いたタマネギの細胞における蛋白質 - 蛋白質相互作用のための二分子蛍光相補（BiFC）アッセイ

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

マイクロパターン化表面でのタンパク質間相互作用の in vivo検出

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

細胞の電気融合を蛍光顕微鏡で可視化

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

イメージングタンパク質間相互作用 in vivoで</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as immunoprecipitation do not provide information on the spatial localization of complexes. In contrast, BiFC monitors the interaction and subcellular compartmentalization of protein complexes. In this method, a fluororescent protein is split into amino- and carboxy-terminal non-fluorescent fragments which are then fused to two proteins of interest. Interaction of the proteins results in reconstitution of the fluorophore (Figure 1)1,2. A limitation of BiFC is that once the fragmented fluorophore is reconstituted the complex is irreversible3. This limitation is advantageous in detecting transient or weak interactions, but precludes a kinetic analysis of complex dynamics. An additional caveat is that the reconstituted flourophore requires 30min to mature and fluoresce, again precluding the observation of real time interactions4. BiFC is a specific example of the protein fragment complementation assay (PCA) which employs reporter proteins such as green fluorescent protein variants (BiFC), dihydrofolate reductase, b-lactamase, and luciferase to measure protein:protein interactions5,6. Alternative methods to study protein:protein interactions in cells include fluorescence co-localization and F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)7. For co-localization, two proteins are individually tagged either directly with a fluorophore or by indirect immunofluorescence. However, this approach leads to high background of non-interacting proteins making it difficult to interpret co-localization data. In addition, due to the limits of resolution of confocal microscopy, two proteins may appear co-localized without necessarily interacting. With BiFC, fluorescence is only observed when the two proteins of interest interact. FRET is another excellent method for studying protein:protein interactions, but can be technically challenging. FRET experiments require the donor and acceptor to be of similar brightness and stoichiometry in the cell. In addition, one must account for bleed through of the donor into the acceptor channel and vice versa. Unlike FRET, BiFC has little background fluorescence, little post processing of image data, does not require high overexpression, and can detect weak or transient interactions. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) is a method similar to FRET except the donor is an enzyme (e.g. luciferase) that catalyzes a substrate to become bioluminescent thereby exciting an acceptor. BRET lacks the technical problems of bleed through and high background fluorescence but lacks the ability to provide spatial information due to the lack of substrate localization to specific compartments8. Overall, BiFC is an excellent method for visualizing subcellular localization of protein complexes to gain insight into compartmentalized signaling.

The subcellular localization of proteins is important in determining the spatio-temporal regulation of cell signaling. Here, we describe bimolecular fluorescence complementation (BiFC) as a straightforward method for monitoring the spatial interactions of proteins in the cell.

二分子蛍光相補

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

ゲートウェイ互換二分子蛍光相補（BiFC）システムを使用してプラントにおけるタンパク質相互作用の検出

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

二分子蛍光相補のフローサイトメトリー分析：タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのハイスループット定量法

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

生物発光共鳴エネルギー転移を用いて生細胞中のタンパク質 - タンパク質相互作用を調査する

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するために、高密度機能タンパク質マイクロアレイのプロービング

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...