Vorremmo ringraziare Jürgen Soll per utili discussioni e Chris Carrie per la lettura critica del manoscritto. Questo progetto è stato finanziato dalla DFG e Fonds der chemischen Industrie (numero di borse di studio SFB 1035, progetto A04 alla SS e fare 187/22 per RS).

1. Trasformazione di BiFC Costruisce in Agrobacteria <ol><li> Clonazione di costrutti BiFC <ol><li> Amplificare il gene di interesse da un modello appropriato utilizzando oligonucleotidi contenenti accompagnamento ATTB siti. Eseguire una PCR utilizzando un polimerasi correzione di bozze. Adattare la lunghezza della fase di ricottura per la combinazione di primer creazione e la lunghezza del passo allungamento secondo la dimensione del frammento. Controllare il prodotto di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio e purificarlo utilizzando una PCR Clean-up Kit. </li><li> Eseguire la reazione BP con il frammento ottenuto e il vettore di entrata utilizzando ricombinasi BP. Mescolare 15-150 ng del prodotto attB-PCR con 150 ng del vettore entrata, aggiungere 2 ml di ricombinasi BP e riempire con tampone TE ad un volume totale di 8 microlitri. Incubare la reazione per 1 ora a RT e fermare la reazione con l&#39;aggiunta di 2 ml proteinasi K per 10 min a 37 ° C. </li><li> Trasformare l&#39;intera reazione in competente E. coli DH5a; Cellule e schermare le colonie ottenute da Colony PCR per il corretto inserimento del frammento di DNA nel vettore. Sequenziamento del DNA dei plasmidi positivi viene effettuato per verificare l&#39;assenza di mutazioni. </li><li> Utilizzare il clone di entrata ottenuto per LR ricombinazione con l&#39;appropriato vettore di destinazione usando un ricombinasi LR. Mescolare 50-150 ng di entrata vettore con 150 ng del vettore destinazione, aggiungere 1 ml LR recombinase e riempire con tampone TE ad un volume totale di 5 ml. Incubare la reazione per 1 ora a RT e fermare la reazione con l&#39;aggiunta di 1 ml proteinasi K per 10 min a 37 ° C. </li><li> Trasformare l&#39;intera reazione in cellule competenti di E. coli DH5a e schermo colonie ottenute dalla colonia PCR per il corretto inserimento del frammento di DNA nel vettore. Sequenziamento del DNA non è necessario in questa fase. </li><li> Isolare DNA plasmidico con un kit plasmide Mini a garantire un elevato grado di purezza. </li></ol></li><li> Preparazione della chimicamente competenti Agrobacteria (ceppo AGL1, rifampicina e resistenza Carbenicillin) <ol><li> Streak out agrobatteri da una cultura magazzino e crescere per 24 ore a 28 ° C. </li><li> Inoculare 5 ml terreno LB con una singola colonia e incubare una notte a 28 ° C. </li><li> Inoculare 50 ml terreno LB con 2 ml di coltura durante la notte e crescere per circa 4 ore a 28 ° C per un OD 600 di 1,0. </li><li> Centrifugare le cellule a 3000 xg per 15 min a 4 ° C e risospendere il pellet in 1 ml sterilizzati ghiacciata CaCl 2 (10 mM). Mantenere le cellule in ghiaccio dopo questo passaggio. </li><li> Preparare aliquote (100 pl) delle celle, congelare immediatamente in azoto liquido e conservare a -80 ° C. </li></ol></li><li> Trasformazione di chimica competente Agrobacteria <ol><li> Scongelare una aliquota di cellule AGL1 competenti su ghiaccio. Aggiungere 1-2 pg di DNA plasmidico da cellule. Incubare per 5 min in ghiaccio, 5 min in azoto liquido e 5 min a 37 ° C. Aggiungere 600 microlitri terreno LB alle cellule e snasello a 650 rpm per 4 ore a 28 ° C. </li><li> Centrifugare le cellule per 1 min a 8000 xg e scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 50 ml di mezzo LB rimanente e piastra su piastre LB contenenti antibiotici appropriati. Sigillare le piastre e incubare per 2 giorni a 28 ° C. Colonie di evidenziare la presenza del plasmide da colonia PCR. </li><li> Inoculare una colonia positiva in 5 ml di terreno LB contenente antibiotici appropriati e incubare a 28 ° C durante la notte. Miscelare 500 ml di coltura durante la notte con 500 microlitri 50% glicerolo sterilizzato e congelare a -80 ° C. </li><li> Seminare le agrobatteri in terreno LB contenenti antibiotici appropriati direttamente dal glicerolo magazzino per la trasformazione transiente di foglie di tabacco. </li></ol></li></ol> 2. Trasformazione transitoria delle foglie di tabacco <ol><li> Agrobacteria crescita <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni stock: acetosyringone (150 mm, sciogliere in 70% EtOH), deposito come aliquote a -20 ° C. MES / KOH (0,1 M) pH 5.7, conservare a 4 ° C (filtro sterile attraverso un filtro 0,2 micron per prevenire la crescita batterica durante la conservazione più a lungo), MgCl 2 (1 M) stock, conservare a temperatura ambiente. </li><li> Inoculare 10 ml di terreno LB contenente antibiotici appropriati con 50 ml di stock cultura AGL1 glicerolo contenente il plasmide di interesse in una provetta sterile da 50 ml ed incubare a 28 ° C per almeno 24 ore in agitazione a 190 rpm fino a un diametro esterno di 600 tra 1,0 -2.0 è raggiunto. </li><li> Batteri centrifugare a 3000 xg per 15 min. Risospendere il pellet in mezzo infiltrazione fresco [MgCl2 (10 mM), MES / KOH (10 mM) pH 5.7, acetosyringone (150 mM)] e regolare la sospensione in una OD 600 di 1,0. </li><li> Incubare le cellule Agrobacteria in un agitatore in testa per 2 ore nel buio. Le cellule possono quindi essere utilizzati per l&#39;infiltrazione. </li></ol></li><li> Infiltrazione di foglie di tabacco <ol><li> Utilizzare tresettimana vecchio tabacco (Nicotiana benthamiana) piante. Scegliere diverse foglie più vecchie per infiltrazione. </li><li> Miscelare volumi uguali dei agrobatteri trasportano i costrutti di interesse (3 ml ciascuna). Prendete una siringa da 5 ml senza ago per l&#39;infiltrazione. Infiltrarsi nella sospensione cellulare attentamente le foglie di tabacco premendo la siringa sul lato inferiore delle foglie in più punti. </li><li> Annaffiare le piante e lasciarli al buio per due giorni. </li></ol></li></ol> 3. Protoplast Preparazione Preparazione Protoplast di foglie di tabacco è stato adattato da Koop et al. 16 e leggermente modificato. <ol><li> Preparazione Buffer <ol><li> Preparare F-PCN medio: Macro-sali [KNO3 (1012 mcg / ml), CaCl 2 • 2H 2 O (440 mg / ml), MgSO 4 • 7H 2 O (370 mg / ml), KH 2 PO 4 ( 170 mg / ml), NH 4-succinato [(20 mm; preparare un 2 m stock solution (succinato (236 mcg / ml) e NH 4 Cl (106 mcg / ml), portato a pH 5,8 per sciogliere)], Micro-sali [EDTA-Fe (III) X na-sale (40 mcg / ml), KJ (0,75 mg / ml), H 3 BO 3 (3 mg / ml), MnSO 4 • H 2 O (10 mcg / ml), ZnSO 4 • 7H 2 O (2 mg / ml), Na 2 MoO 4 • 7H 2 O (0,25 mg / ml), CuSO 4 • 5H 2 O (0,025 mcg / ml), CoCl 2 • 6H 2 O (0,025 mcg / ml)], MES (390 mcg / ml), glucosio (circa 80 ug / ml) osmolarità 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Conservare in aliquote a -20 ° C. </li><li> Preparare mezzo F-PIN: Tutti gli ingredienti come F-PCN ma invece di utilizzo saccarosio glucosio (circa 110 mcg / ml), osmolarità 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Conservare in aliquote a -20 ° C. </li><li> Preparare W5 medio: 150 mM NaCl, 125 mM CaCl 2, 5 mM KCl, 2 mM MES, osmolarità 550-580 mOsm, pH 5.7 (KOH). Conservare a 4 °, C (filtro sterile attraverso un filtro 0,2 micron per prevenire la crescita batterica durante la conservazione più a lungo). </li><li> Preparare soluzione enzimatica fresca per l&#39;isolamento di protoplasti (0,1 g cellulasi, 0,03 g macerozym in 10 ml F-PIN). Incubare la soluzione a 55 ° C per 10 minuti e raffreddare a RT. Aggiungere 100 pl di 10% BSA a 10 ml di soluzione. </li></ol></li><li> Isolamento di protoplasti <ol><li> Mettere una foglia infiltrato in una capsula di Petri e aggiungere la soluzione enzimatica fresca. Utilizzare una nuova lametta per tagliare la foglia in circa 0,5 cm 2 pezzi di dimensioni. Trasferire la foglia-pezzi con soluzione enzimatica in un pallone vuoto infiltrazione ed il vuoto infiltrarsi per circa 20 secondi fino a quando le bolle d&#39;aria emergono dalle foglie (rilascio del vuoto con molta attenzione). </li><li> Agitare la beuta per 90 min a 40 rpm nell&#39;oscurità. </li><li> Rilasciare protoplasti agitando per 1 min a 90 giri al minuto. Filtrare la soluzione attraverso una garza (100 micron) in 15 ml di tubo di centrifugazione (fondo tondo). </li&gt; <li> Sovrapporre la soluzione protoplasto con 2 ml di tampone F-PCN e centrifugare per 10 minuti a 70 g (accelerazione e decelerazione lenta) a temperatura ambiente. </li><li> Protoplasti intatte accumulano all&#39;interfaccia di soluzione enzimatica e F-PCN. Prendete un ampio orifizio 1 punta ml pipetta per trasferire i protoplasti intatti in un tubo da centrifuga fresco e riempire con il tampone W5. Centrifugare per 2 minuti a 100 xg (accelerazione lenta e decelerazione) per far sedimentare i protoplasti. </li><li> Rimuovere con cura il supernatante utilizzando una pipetta e risospendere pellet in circa 200 microlitri tampone W5, a seconda della quantità di protoplasti. </li><li> Utilizzare sempre punte orifizio largo per evitare rottura di protoplasti intatti. </li></ol></li></ol> 4. Laser Scanning Microscopy <ol><li> Preparazione del campione <ol><li> Incollare due piccole strisce di sigillante intorno ad un vetrino da microscopio (2 cm l&#39;uno dall&#39;altro). Mettere 20 ml di soluzione di protoplasti tra le strisce e posizionare con cura un vetro di coperturasulla parte superiore. Le strisce sigillanti assicurarsi che i protoplasti non vengono schiacciate dal vetro di copertura. </li><li> Per campioni totali foglia tagliare un pezzo di 1 cm dalla foglia e posizionarlo su un vetrino da microscopio con il lato inferiore del foglio rivolto verso l&#39;alto. Aggiungere circa 30 ml H 2 O, posizionare un vetro di copertura sulla parte superiore e fissare saldamente con nastro adesivo su entrambi i lati. </li></ol></li><li> Impostazioni di immagini e microscopio confocale <ol><li> Imaging viene eseguita con un microscopio confocale a scansione laser Leica, Tipo: TCS SP5. Per ingrandimento usare una lente obiettivo (HCX PL APO CS) con una magnitudo di 63X con glicerolo come mezzo di imaging. Impostare l&#39;apertura numerica a 1,3. Utilizzare il software Leica Application Suite / Advanced Fluorescence per la valutazione (vedi Dati supplementari S1). </li><li> Impostare il laser Argon al 30% e la potenza del laser a 488 nm ad un&#39;intensità del 18% per monitorare il segnale BiFC ricostituito a 515 nm e impostare una larghezza di banda di emissione rivelatore PMT 495-550. </li&gt; <li> Per monitorare clorofilla autofluorescenza impostare un secondo di banda di emissione rivelatore PMT 650-705. </li><li> Per monitorare segnale mCherry usa il laser HeNe 561, impostare l&#39;intensità del laser 561-18% e la larghezza di banda di emissione di un terzo rivelatore PMT 587-610. </li><li> Assicurarsi che le immagini di tutti i canali del rivelatore PMT sono prese con le stesse impostazioni di guadagno (guadagno deve essere compresa tra 800-900 escludere segnali di fondo). </li><li> Scattare foto in larghezza format / altezza di 1024 x 1024 pixel con una velocità di scansione di 100 Hz. </li><li> Per Z stackings utilizzano una distanza massima di 0,5 micron tra ogni pila. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Citovsky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+interacting+proteins+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta.">Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).</li><li>Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+to+study+protein-protein+interactions+in+living+plant+cells.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells.</a> Methods Mol. Biol. 479, 189-202 (2009).</li><li>Weinthal, D., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein-protein+interactions+in+plant+cells+by+bimolecular+fluorescence+complementation+assay.">Imaging protein-protein interactions in plant cells by bimolecular fluorescence complementation assay.</a> Trends Plant Sci. 14, 59-63 (2009).</li><li>Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+protein-protein+interactions+in+plants+by+bimolecular+fluorescence+complementation.">The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).</li><li>Ohad, N., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+to+assay+protein-protein+interaction+in+plants.">Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants.</a> Methods Mol. Biol. 655, 347-358 (2010).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Lee, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+a+cDNA+library+for+protein-protein+interactions+directly+in+planta.">Screening a cDNA library for protein-protein interactions directly in planta.</a> Plant Cell. 24, 1746-1759 (2012).</li><li>McFarlane, H. E., Shin, J. J., Bird, D. A., Samuels, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+ABCG+transporters,+which+are+required+for+export+of+diverse+cuticular+lipids,+dimerize+in+different+combinations.">Arabidopsis ABCG transporters, which are required for export of diverse cuticular lipids, dimerize in different combinations.</a> Plant Cell. 22, 3066-3075 (2010).</li><li>Dunschede, B., Bals, T., Funke, S., Schunemann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+studies+between+the+chloroplast+signal+recognition+particle+subunit+cpSRP43+and+the+full-length+translocase+Alb3+reveal+a+membrane-embedded+binding+region+in+Alb3+protein.">Interaction studies between the chloroplast signal recognition particle subunit cpSRP43 and the full-length translocase Alb3 reveal a membrane-embedded binding region in Alb3 protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35187-35195 (2011).</li><li>Gehl, C., Waadt, R., Kudla, J., Mendel, R. R., Hansch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+GATEWAY+vectors+for+high+throughput+analyses+of+protein-protein+interactions+by+bimolecular+fluorescence+complementation.">New GATEWAY vectors for high throughput analyses of protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol. Plant. 2, 1051-1058 (2009).</li><li>Qbadou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+chaperone+Hsp90+delivers+precursor+proteins+to+the+chloroplast+import+receptor+Toc64.">The molecular chaperone Hsp90 delivers precursor proteins to the chloroplast import receptor Toc64.</a> EMBO J. 25, 1836-1847 (2006).</li><li>Schweiger, R., Muller, N. C., Schmitt, M. J., Soll, J., Schwenkert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtTPR7+is+a+chaperone+docking+protein+of+the+Sec+translocon+in+Arabidopsis.">AtTPR7 is a chaperone docking protein of the Sec translocon in Arabidopsis.</a> J. Cell Sci. , (2012).</li><li>Schweiger, R., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtTPR7+as+part+of+the+Arabidopsis+Sec+post-translocon.">AtTPR7 as part of the Arabidopsis Sec post-translocon.</a> Plant Signal Behav. 8, (2013).</li><li>Nelson, B. K., Cai, X., Nebenfuhr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolored+set+of+in+vivo+organelle+markers+for+co-localization+studies+in+Arabidopsis+and+other+plants.">A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants.</a> Plant J. 51, 1126-1136 (2007).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+analysis+as+a+probe+of+protein+interactions+in+living+cells.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells.</a> Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).</li><li>Koop, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+foreign+sequences+into+the+tobacco+plastome+via+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation.">Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation.</a> Planta. 199, 193-201 (1996).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Dopo la pianificazione di un esperimento BiFC devono essere considerati diversi punti. Nonostante non sia richiesta informazioni strutturali sulle proteine ​​di interesse, la topologia deve essere conosciuto quando si lavora con proteine ​​di membrana spanning. Le proteine ​​fluorescenti devono risiedere nello stesso compartimento subcellulare o affrontare lo stesso lato di una membrana per consentire l&#39;interazione. Naturalmente, quando si analizzano le proteine ​​che richiedono una sequenza di targe...

Studiare la formazione di complessi proteici e la loro localizzazione nelle cellule vegetali in vivo è essenziale per indagare reti cellulari, segnalazione e processi metabolici. BiFC permette la visualizzazione delle interazioni proteina-proteina nel loro ambiente naturale direttamente all&#39;interno della cellula vegetale vivente 1-5. Nel BiFC avvicinarsi alla complementazione di due frammenti N-e C-terminali non fluorescente di una proteina fluorescente piombo ad una proteina fluorescente ricostituito. Frammenti di molte proteine ​​fluorescenti differenti sono stati utilizzati per rilevare le interazioni proteina, ad esempio, la proteina fluorescente verde (GFP) cromoforo delle quali è formata da tre residui chimicamente distinte 6. Proteine ​​fluorescenti possono essere dimezzati all&#39;interno di un ciclo o ß-strand di provocare i due frammenti non fluorescente che possono essere fuse per entrambe le proteine ​​di interesse. Il test può essere utilizzato per rilevare le interazioni in qualsiasi compartme subcellularent in qualsiasi organismo aerobicamente crescente o celle che possono essere geneticamente modificato per esprimere le proteine ​​di fusione. Se le due proteine ​​entrano in prossimità all&#39;interno della cellula, la fluorescenza viene ricostituito e può essere monitorato mediante microscopia senza aggiunta di fluorofori esogeni o coloranti 3. Tabacco (Nicotiana benthamiana) ha dimostrato di essere un modello conveniente organismo per visualizzare l&#39;interazione di proteine ​​vegetali, poiché le proteine ​​possono facilmente essere espresse utilizzando la trasformazione mediata da Agrobacterium di foglie di tabacco con i costrutti generati. Agrobatteri utilizzano un cosiddetto plasmide Ti (cancerogeni) codificanti per enzimi che mediano la trasduzione del gene di interesse in cellule vegetali. BiFC è ben applicabile per solubile così come per le proteine ​​di membrana all&#39;interno di tutti i compartimenti cellulari ed è stato usato con successo negli ultimi anni per identificare proteine ​​interagenti in vivo e analizzare i siti di interazioneall&#39;interno delle proteine ​​7-9. Su espressione dei geni introdotti, l&#39;interazione delle proteine ​​fluorescenti può essere visualizzato direttamente in foglie, che è adatto per strutture cellulari più grandi, come il reticolo endoplasmatico (ER), la membrana plasmatica o cloroplasti. Tuttavia, per monitorare la localizzazione in strutture più raffinate, per esempio, la busta cloroplasto, si consiglia di visualizzare la fluorescenza in protoplasti isolati di foglie di tabacco trasformate. Un insieme di vettori BiFC contenenti sia un C-terminale o un tag fluorescente N-terminale deve essere utilizzato per l&#39;approccio BiFC in piante 10. Il protocollo descritto qui di seguito è stato utilizzato per studiare l&#39;interazione di citosolica heat shock protein 90 (HSP90) con la ripetizione tetratricopeptide (TPR) dominio contenente attracco proteine ​​Toc64 e AtTPR7 risiedono nella busta esterna cloroplasto e il reticolo endoplasmatico, rispettivamente, 11-13. A questo scopo, HSP90 è stata fusa al Ctparte erminal di SCFP (SCFP C). Il tag è N-terminale fusa al chaperone per garantire l&#39;accessibilità del C-terminale MEEVD motivo di legame di HSP90 al morsetto di tipo domini TPR. In parallelo, la parte N-terminale di Venere (Venus N) è stato fuso con i domini citosolici del dominio TPR contenente attracco proteine ​​Toc64 e AtTPR7, rispettivamente. Come controllo negativo abbiamo clonato la parte C-terminale solubile di SCFP C, solamente che risiede nel citosol ed è quindi un controllo appropriato. I tag fluorescenti delle proteine ​​studiate devono affrontare lo stesso compartimento cellulare per consentire la vicinanza e la ricostituzione del segnale fluorescente in tal modo. Per determinare la localizzazione del segnale fluorescente ricostituito una proteina marker fusa a un tag fluorescente differente può essere cotransformed per dimostrare la localizzazione subcellulare dell&#39;interazione. Una proteina marker ER fusa mCherrry fu trasformato simultaneamente nellacaso di ER si trova AtTPR7 14. L&#39;autofluorescenza della clorofilla servito come marcatore cloroplasto in caso di Toc64. Con questo non solo l&#39;interazione in vivo di Toc64 AtTPR7 e, rispettivamente, con la HSP90 chaperone citosolico può essere monitorato direttamente in foglie di tabacco, ma anche la localizzazione subcellulare dell&#39;interazione può essere indagata. BiFC è adatto come un approccio complementare ad altri metodi che studiano le interazioni proteina-proteina. Rispetto al coimmunoprecipitation o in esperimenti di pull-down in vitro, per esempio, anticorpi specifici devono essere disponibili per le proteine ​​di interesse, e le proteine ​​non devono essere espresso in modo ricombinante in vitro, che può essere difficile, specialmente per proteine ​​di membrana. Inoltre, anche le interazioni transitori possono essere monitorati utilizzando BiFC, poiché le proteine ​​sono catturate dalla interazione dei tag fluorescenti fusi 15.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="888">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">3&#39;,5&#39;-Dimethoxy-4&#39;-hydroxyacetophenone</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">D134406</td>
			<td style="width:195px;">Acetosyringone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Cellulase, Onozuka-R10</td>
			<td style="width:147px;">Serva</td>
			<td style="width:255px;">16419</td>
			<td>from Trichoderma viridae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Macerozyme R-10&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Serva</td>
			<td style="width:255px;">28302</td>
			<td>from Rhizopus sp</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:293px;">GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">11789-(020)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">11791-(020)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:255px;">27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit</td>
			<td style="width:147px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:255px;">740609-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">pDEST-GWVYNE</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">pDEST-VYNE(R)GW</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:293px;">pDEST-SCYCE(R)GW</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves

Molte proteine ​​interagiscono transitoriamente con altre proteine ​​o sono integrati in complessi multi-proteici di svolgere la loro funzione biologica. Bimolecular complementazione fluorescenza (BiFC) è un metodo in vivo per monitorare tali interazioni nelle cellule vegetali. Nel protocollo presentato proteine ​​candidate indagati sono fusi a metà complementari di proteine ​​fluorescenti ei rispettivi costrutti vengono introdotti nelle cellule vegetali tramite trasformazione mediata da Agrobacterium. Successivamente, le proteine ​​sono espresse transitoriamente in foglie di tabacco ei segnali fluorescenti restaurati possono essere rilevati con un microscopio confocale a scansione laser nelle cellule intatte. Ciò consente non solo la visualizzazione della stessa interazione, ma anche la localizzazione subcellulare dei complessi proteici può essere determinato. A tal fine, geni marcatori contenenti un tag fluorescente possono essere coexpressed insieme ai costrutti BiFC, visualizzando così strutture cellulari come tegli reticolo endoplasmatico, mitocondri, l&#39;apparato di Golgi o la membrana plasmatica. Il segnale fluorescente può essere monitorato direttamente nelle cellule epidermiche foglia o in protoplasti singoli, che possono essere facilmente isolato dalle foglie di tabacco trasformate. BiFC è ideale per studiare le interazioni proteina-proteina nel loro ambiente naturale all&#39;interno della cellula vivente. Tuttavia, va considerato che l&#39;espressione deve essere comandato da promotori forti e che i partner di interazione sono modificati per effetto fusione dei tag fluorescenza relativamente grandi, che potrebbero interferire con il meccanismo di interazione. Tuttavia, BiFC è un ottimo approccio complementare ad altri metodi comunemente applicati inquirenti interazioni proteina-proteina, come coimmunoprecipitation, vitro saggi di pull-down o esperimenti lievito-two-hybrid.

In questo esempio si è usato il metodo BiFC per monitorare l&#39;interazione della HSP90 citosolico chaperone molecolare delle proteine ​​di membrana di docking AtTPR7 e Toc64. AtTPR7 fa parte del translocon Sec e interagisce con chaperone citosolico, che eventualmente offrono preproteine ​​secretori per traslocazione post-traduzionale alla membrana ER. Allo stesso modo, Toc64 la busta esterna cloroplasto agisce in import post-traslazionale ricevendo HSP90 preproteine ​​cloroplasti associati. Entrambe le pr...

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Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Formazione di complessi proteici in vivo può essere visualizzato da bimolecular fluorescenza complementazione. Partner di interazione sono fusi a parti complementari tag fluorescenti e transitoriamente espressi in foglie di tabacco, risultando in un segnale fluorescente ricostituito upon vicinanza delle due proteine.

Interazioni proteina-proteina visualizzati tramite bimolecular complementazione fluorescenza in protoplasti di tabacco e foglie

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

protein-protein-interactions-visualized-bimolecular-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

20.7K Views.  Ludwig-Maximilians-Universität, München.  Formazione di complessi proteici in vivo può essere visualizzato da bimolecular fluorescenza complementazione. Partner di interazione sono fusi a parti complementari tag fluorescenti e transitoriamente espressi in foglie di tabacco, risultando in un segnale fluorescente ricostituito upon vicinanza delle due proteine. 

Video: Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Fluorescenza separazione delle cellule attivate delle protoplasti impianto

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Ricerca

Biologia

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Biomolecolare fluorescenza complementazione (BiFC) Assay per interazione proteina-proteina nelle cellule Cipolla Utilizzando la Helios Gun Gene

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

In vivo di rilevamento di interazioni proteina-proteina su disegno micro, Superfici

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Elettrosaldabili cellula visualizzate con microscopia a fluorescenza

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imaging interazioni proteina-proteina In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as immunoprecipitation do not provide information on the spatial localization of complexes. In contrast, BiFC monitors the interaction and subcellular compartmentalization of protein complexes. In this method, a fluororescent protein is split into amino- and carboxy-terminal non-fluorescent fragments which are then fused to two proteins of interest. Interaction of the proteins results in reconstitution of the fluorophore (Figure 1)1,2. A limitation of BiFC is that once the fragmented fluorophore is reconstituted the complex is irreversible3. This limitation is advantageous in detecting transient or weak interactions, but precludes a kinetic analysis of complex dynamics. An additional caveat is that the reconstituted flourophore requires 30min to mature and fluoresce, again precluding the observation of real time interactions4. BiFC is a specific example of the protein fragment complementation assay (PCA) which employs reporter proteins such as green fluorescent protein variants (BiFC), dihydrofolate reductase, b-lactamase, and luciferase to measure protein:protein interactions5,6. Alternative methods to study protein:protein interactions in cells include fluorescence co-localization and F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)7. For co-localization, two proteins are individually tagged either directly with a fluorophore or by indirect immunofluorescence. However, this approach leads to high background of non-interacting proteins making it difficult to interpret co-localization data. In addition, due to the limits of resolution of confocal microscopy, two proteins may appear co-localized without necessarily interacting. With BiFC, fluorescence is only observed when the two proteins of interest interact. FRET is another excellent method for studying protein:protein interactions, but can be technically challenging. FRET experiments require the donor and acceptor to be of similar brightness and stoichiometry in the cell. In addition, one must account for bleed through of the donor into the acceptor channel and vice versa. Unlike FRET, BiFC has little background fluorescence, little post processing of image data, does not require high overexpression, and can detect weak or transient interactions. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) is a method similar to FRET except the donor is an enzyme (e.g. luciferase) that catalyzes a substrate to become bioluminescent thereby exciting an acceptor. BRET lacks the technical problems of bleed through and high background fluorescence but lacks the ability to provide spatial information due to the lack of substrate localization to specific compartments8. Overall, BiFC is an excellent method for visualizing subcellular localization of protein complexes to gain insight into compartmentalized signaling.

The subcellular localization of proteins is important in determining the spatio-temporal regulation of cell signaling. Here, we describe bimolecular fluorescence complementation (BiFC) as a straightforward method for monitoring the spatial interactions of proteins in the cell.

Bimolecolari complementazione fluorescenza

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

Rilevamento delle interazioni proteiche in pianta utilizzando un gateway compatibile complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC) Sistema

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

L&#39;analisi citofluorimetrica di bimolecular Complementation Fluorescenza: A High Throughput Metodo quantitativo per studiare l&#39;interazione proteina-proteina

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Indagare interazioni proteina-proteina in cellule vive utilizzando il trasferimento bioluminescenza Resonance Energy

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Probing ad alta densità di microarrays della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...