ברצוננו להודות ליורגן סול לדיונים מועילים וכריס קארי לקריאה ביקורתית של כתב היד. פרויקט זה מומן על ידי chemischen DFG וFonds der Industrie (SFB מספרי מענקים 1035, A04 פרויקט לאס והאם 187/22 לRS).

1. טרנספורמציה של BiFC הבונה בAgrobacteria <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיבוט של מבני BiFC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את הגן של עניין מתבנית מתאימה באמצעות oligonucleotides מכילה attB אתרי איגוף. לבצע PCR באמצעות פולימראז הגהה. להתאים את אורך צעד חישול לשילוב פריימר תוכנן ואת אורכו של שלב התארכות בהתאם לגודל השבר. בדוק את המוצר ה-PCR על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose ולטהר אותו על ידי שימוש בערכת ה-PCR לנקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את תגובת BP עם שבר שהושג ואת וקטור הכניסה באמצעות recombinase BP. מערבבים 15-150 ng של מוצר attB-PCR עם 150 ng של וקטור הכניסה, להוסיף 2 μl של recombinase BP ולהתמלא בTE חיץ להיקף כולל של 8 μl. דגירה התגובה עבור שעה 1 ב RT ולעצור את התגובה על ידי הוספת 2 μl proteinase K 10 דקות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך כל התגובה לE. המוסמך coli DH5α; תאים ומסך המושבות מתקבלות על ידי המושבה PCR להכנסה נכונה של קטע DNA לתוך הווקטור. רצף ה-DNA של פלסמידים חיוביים מתבצע כדי לוודא היעדר המוטציות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשיבוט הכניסה מתקבל עבור רקומבינציה LR עם וקטור היעד המתאים באמצעות recombinase LR. מערבבים 50-150 ננוגרם של וקטור הכניסה עם 150 ng של וקטור היעד, להוסיף recombinase LR μl 1 ולהתמלא בTE חיץ להיקף כולל של 5 μl. דגירה התגובה עבור שעה 1 ב RT ולעצור את התגובה על ידי הוספת 1 μl proteinase K 10 דקות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך כל התגובה לתאים המוסמכים E. coli DH5α ומסך המתקבלים על ידי מושבות המושבה PCR להכנסה נכונה של קטע DNA לתוך הווקטור. רצפי DNA אין צורך בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את ה-DNA פלסמיד עם ערכת פלסמיד Mini כדי להבטיח רמה גבוהה של טוהר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Agrobacteria כימית המוסמך (AGL1 המתח, ריפאמפיצין והתנגדות Carbenicillin) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> agrobacteria פס מ תרבות המניה ולגדול ל24 שעות ב28 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 5 מיליליטר מדיום LB עם מושבה אחת ודגירת הלילה בשעה 28 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 50 מיליליטר מדיום LB עם 2 מיליליטר של תרבות הלילה ולגדול לכ 4 שעות ב28 ° C ל OD 600 של 1.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב XG 3,000 15 דקות ב 4 ° C ו resuspend את הכדור ב 1 מיליליטר עיקור קר כקרח CaCl 2 (10 מ&quot;מ). שמור את התאים על קרח לאחר שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן aliquots (100 μl) של התאים, להקפיא באופן מיידי בחנקן הנוזלי ולאחסן ב -80 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרנספורמציה של Agrobacteria כימי המוסמך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירו aliquot אחד מתאי AGL1 המוסמכים על קרח. להוסיף 1-2 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד לתאים. דגירה במשך 5 דקות על קרח, 5 דקות בחנקן נוזלי ו5 דקות ב37 ° C. הוספת 600 מדיום LB μl לתאים והיםהייק ב650 סל&quot;ד במשך 4 שעות ב28 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים 1 דקות ב8,000 XG וזורקים supernatant. Resuspend את הכדור ב50 μl של המדיום שנותר LB וצלחת על צלחות LB המכילות האנטיביוטיקה המתאימה. לאטום את הצלחות ודגירה עבור 2 ימים ב28 ° C. מושבות מסך לנוכחות של פלסמיד על ידי המושבה PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבה אחת חיובית ב5 מיליליטר מדיום LB המכיל האנטיביוטיקה המתאימה ולדגור על 28 ° C במשך הלילה. מערבבים 500 μl של תרבות הלילה עם 500 μl 50% גליצרול מעוקר ולהקפיא ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן agrobacteria במדיום LB המכיל האנטיביוטיקה המתאימה ישירות ממניית גליצרול לשינוי זמני של עליי טבק. </li></ol></li></ol> 2. טרנספורמציה חולפת של עליי טבק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Agrobacteria צמיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות המניות הבאים: acetosyringone (150 מ&quot;מ, מתמוסס ב70% EtOH), חנות aliquots ב -20 ° C. pH MES / KOH (0.1 M) 5.7, לאחסן ב 4 ° C (סינון סטרילי דרך מסנן 0.2 מיקרומטר כדי למנוע התפתחות חיידקים במהלך אחסון ארוך יותר), מניית MgCl 2 (ז 1), חנות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 10 מיליליטר מדיום LB המכיל אנטיביוטיקה המתאימה עם 50 μl של תרבות מניית גליצרול AGL1 המכילה את הפלסמיד של עניין בצינור מיליליטר סטרילי 50 ולדגור על 28 מעלות צלזיוס במשך לפחות 24 שעות רועד ב190 סל&quot;ד עד OD 600 בין 1.0 הוא הגיע -2.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיידקי צנטריפוגה ב 3,000 XG במשך 15 דקות. Resuspend את הכדור במדיום הסתננות טרי [MgCl 2 (10 מ&quot;מ), pH MES / KOH (10 מ&quot;מ) 5.7, acetosyringone (150 מיקרומטר)] ולהתאים את ההשעיה לOD 600 של 1.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאי agrobacteria בייקר תקורה לשעה 2 בחושך. התאים לאחר מכן ניתן להשתמש לחדירה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסתננות של עליי טבק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בשלושטבק ישן שבוע צמחים (benthamiana Nicotiana). בחר כמה עלים מבוגרים להסתננות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב כמויות שווה של agrobacteria נושא את המבנים של עניין (3 מיליליטר כל אחד). קח מזרק 5 מיליליטר ללא מחט להסתננות. לחדור את ההשעיה התא בזהירות לתוך עלי הטבק על ידי לחיצה על המזרק בצד התחתון של העלים בכמה מקומות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשקות את הצמחים ולהשאיר אותם בחושך במשך יומיים. </li></ol></li></ol> 3. Protoplast הכנה הכנת Protoplast של עליי טבק הותאמה מKoop et al. 16 ושונים מעט. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת חיץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום F-PCN: מאקרו-מלחים [kno 3 (1012 מיקרוגרם / מיליליטר), CaCl 2 • 2H 2 O (440 מיקרוגרם / מיליליטר), 4 MgSO • 7H 2 O (370 מיקרוגרם / מיליליטר), KH 2 PO 4 ( 170 מיקרוגרם / מיליליטר), [4 succinate-NH (20 מ&quot;מ; להכין סול מניית 2 Mution (succinate (236 מיקרוגרם / מיליליטר) ו4 Cl NH (106 מיקרוגרם / מיליליטר), להתאים את ה-pH 5.8 לפזר)], מיקרו מלחים [EDTA-Fe (III) x Na-מלח (40 מיקרוגרם / מיליליטר), KJ (0.75 מיקרוגרם / מיליליטר), H 3 BO 3 (3 מיקרוגרם / מיליליטר), 4 MnSO • H 2 O (10 מיקרוגרם / מיליליטר), 4 ZnSO • 7H 2 O (2 מיקרוגרם / מיליליטר), Na 2 Moo 4 • 7H 2 O (0.25 מיקרוגרם / מיליליטר), 4 CuSO • 5H 2 O (0.025 מיקרוגרם / מיליליטר), CoCl 2 • 6 שעות 2 O (0.025 מיקרוגרם / מיליליטר)], MES (390 מיקרוגרם / מיליליטר), גלוקוז (כ 80 מיקרוגרם / מיליליטר) mOsm osmolarity 550, pH 5.8 (KOH). חנות בaliquots ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום F-PIN: כל המרכיבים כמו F-PCN אבל במקום סוכרוז גלוקוז שימוש (כ 110 מיקרוגרם / מיליליטר), osmolarity 550 mOsm, pH 5.8 (KOH). חנות בaliquots ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום W5: 150 mM NaCl, 125 מ&quot;מ CaCl 2, 5 מ&quot;מ KCl, MES 2 מ&quot;מ, osmolarity 550-580 mOsm, pH 5.7 (KOH). חנות ב 4 °; C (מסנן סטרילי דרך מסנן 0.2 מיקרומטר כדי למנוע התפתחות חיידקים במהלך אחסון ארוך יותר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון אנזים טרי לבידוד protoplast (0.1 cellulase גרם, 0.03 macerozym גרם ב10 מיליליטר F-PIN). דגירה הפתרון ב55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ומגניבות RT. הוספה של BSA 10% 100 μl ל10 מיליליטר פתרון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של protoplasts <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים עלה אחד הסתנן לתוך צלחת פטרי ולהוסיף את פתרון האנזים הטרי. השתמש בסכין גילוח חדש לחתוך את העלה לכ 0.5 סנטימטר 2 חתיכות בגודל. מעביר את העלים החלקים עם פתרון האנזים לתוך בקבוק ואקום חדירה והאבק לחדור לכ 20 שניות עד בועות אוויר יוצאות מהעלים (ואקום שחרורו בזהירות רבה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער את הבקבוק ל90 דקות ב40 סל&quot;ד בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר protoplasts ידי טלטול 1 דקות ב90 סל&quot;ד. סנן את הפתרון באמצעות גזה (100 מיקרומטר) לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר (תחתית עגולה). </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> Overlay פתרון protoplast עם 2 מיליליטר חיץ F-PCN ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 70 XG (תאוצה איטית והאטה) ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> protoplasts ללא פגע לצבור על הממשק של פתרון האנזים וה-F-PCN. קח את קצה פיפטה מיליליטר רחב פתח 1 להעביר protoplasts השלמה לתוך צינור צנטריפוגות טרי ולהתמלא בחיץ W5. צנטריפוגה במשך 2 דקות ב100 XG (האצה האטה איטית) לגלולת protoplasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant בזהירות באמצעות פיפטה וגלולה resuspend בכ 200 חיץ W5 μl, בהתאם לכמות של protoplasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמשו תמיד בטיפי פתח רחבים כדי למנוע פקיעה של protoplasts ללא פגע. </li></ol></li></ol> 4. לייזר סריקה מיקרוסקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מדגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק שתי רצועות קטנות של חומר איטום סביב שקופיות מיקרוסקופ (למעט 2 סנטימטר). הנח 20 μl של פתרון protoplast בין הרצועות ומניח את מכסה זכוכית בזהירותעל העליונה. רצועות איטום לוודא כי protoplasts אינם נמעך על ידי כיסוי הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסך דגימות עלים לחתוך חתיכת 1 סנטימטר מהעלה ולמקם אותו על גבי שקופיות מיקרוסקופ עם הצד התחתון של העלה פונה כלפי מעלה. להוסיף כ 30 μl H 2 O, למקם את כוס על גבי עטיפה ולתקן אותה בחוזקה עם דבק בשני הצדדים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרות הדמיה ומיקרוסקופ confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה מתבצעת באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר מיקה, סוג: TCS SP5. להגדלת שימוש בעדשה אובייקטיבית (HCX PL APO CS) עם סדר גודל של 63X עם גליצרול כמדיום הדמיה. הגדר את הצמצם המספרי ל1.3. השתמש בתוכנת Leica Application Suite / מתקדם הקרינה להערכה (ראה משלימה נתונים S1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את לייזר ארגון ל30% וכוח הלייזר ב488 ננומטר לעוצמת 18% לפקח על אות BiFC מחדש ב515 ננומטר ולהגדיר רוחב פס פליטה אחד PMT גלאי 495-550. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפקח autofluorescence כלורופיל להגדיר רוחב פס פליטת גלאי PMT שני 650-705. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפקח על אות mCherry להשתמש בליזר HeNe 561, להגדיר את עוצמת הלייזר 561-18% ורוחב פס הפליטה של ​​גלאי PMT שלישי 587-610. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי תמונות של כל ערוצי גלאי PMT נלקחות עם אותן הגדרות הרווח (רווח צריך להיות בין 800-900 להוציא אותות רקע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם תמונות ברוחב / גובה תבנית של 1024 x 1024 פיקסלים עם מהירות סריקה של 100 הרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור Z-stackings להשתמש במרחק מרבי של 0.5 מיקרומטר בין כל ערימה. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Citovsky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+interacting+proteins+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta.">Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).</li><li>Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+to+study+protein-protein+interactions+in+living+plant+cells.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells.</a> Methods Mol. Biol. 479, 189-202 (2009).</li><li>Weinthal, D., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein-protein+interactions+in+plant+cells+by+bimolecular+fluorescence+complementation+assay.">Imaging protein-protein interactions in plant cells by bimolecular fluorescence complementation assay.</a> Trends Plant Sci. 14, 59-63 (2009).</li><li>Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+protein-protein+interactions+in+plants+by+bimolecular+fluorescence+complementation.">The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).</li><li>Ohad, N., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+to+assay+protein-protein+interaction+in+plants.">Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants.</a> Methods Mol. Biol. 655, 347-358 (2010).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Lee, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+a+cDNA+library+for+protein-protein+interactions+directly+in+planta.">Screening a cDNA library for protein-protein interactions directly in planta.</a> Plant Cell. 24, 1746-1759 (2012).</li><li>McFarlane, H. E., Shin, J. J., Bird, D. A., Samuels, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+ABCG+transporters,+which+are+required+for+export+of+diverse+cuticular+lipids,+dimerize+in+different+combinations.">Arabidopsis ABCG transporters, which are required for export of diverse cuticular lipids, dimerize in different combinations.</a> Plant Cell. 22, 3066-3075 (2010).</li><li>Dunschede, B., Bals, T., Funke, S., Schunemann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+studies+between+the+chloroplast+signal+recognition+particle+subunit+cpSRP43+and+the+full-length+translocase+Alb3+reveal+a+membrane-embedded+binding+region+in+Alb3+protein.">Interaction studies between the chloroplast signal recognition particle subunit cpSRP43 and the full-length translocase Alb3 reveal a membrane-embedded binding region in Alb3 protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35187-35195 (2011).</li><li>Gehl, C., Waadt, R., Kudla, J., Mendel, R. R., Hansch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+GATEWAY+vectors+for+high+throughput+analyses+of+protein-protein+interactions+by+bimolecular+fluorescence+complementation.">New GATEWAY vectors for high throughput analyses of protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol. Plant. 2, 1051-1058 (2009).</li><li>Qbadou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+chaperone+Hsp90+delivers+precursor+proteins+to+the+chloroplast+import+receptor+Toc64.">The molecular chaperone Hsp90 delivers precursor proteins to the chloroplast import receptor Toc64.</a> EMBO J. 25, 1836-1847 (2006).</li><li>Schweiger, R., Muller, N. C., Schmitt, M. J., Soll, J., Schwenkert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtTPR7+is+a+chaperone+docking+protein+of+the+Sec+translocon+in+Arabidopsis.">AtTPR7 is a chaperone docking protein of the Sec translocon in Arabidopsis.</a> J. Cell Sci. , (2012).</li><li>Schweiger, R., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtTPR7+as+part+of+the+Arabidopsis+Sec+post-translocon.">AtTPR7 as part of the Arabidopsis Sec post-translocon.</a> Plant Signal Behav. 8, (2013).</li><li>Nelson, B. K., Cai, X., Nebenfuhr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolored+set+of+in+vivo+organelle+markers+for+co-localization+studies+in+Arabidopsis+and+other+plants.">A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants.</a> Plant J. 51, 1126-1136 (2007).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+analysis+as+a+probe+of+protein+interactions+in+living+cells.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells.</a> Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).</li><li>Koop, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+foreign+sequences+into+the+tobacco+plastome+via+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation.">Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation.</a> Planta. 199, 193-201 (1996).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

על תכנון ניסוי BiFC כמה נקודות צריכה להיחשב. למרות שאין מידע מבני על החלבונים של העניין נדרש, טופולוגיה צריכה להיות ידועה בעת עבודה עם חלבוני קרום פורש. חלבוני הניאון צריכים להתגורר באותו התא subcellular או פנים באותו הצד של קרום כדי לאפשר אינטראקציה. באופן טבעי, בעת ניתוח חל...

לומד את היווצרות של קומפלקסי חלבונים והלוקליזציה שלהם בתאי צמח in vivo היא חיונית כדי לחקור רשתות סלולריות, איתות ותהליכי חילוף חומרים. BiFC מאפשר הדמיה של אינטראקציות בין חלבונים בסביבה הטבעית שלהם ישירות בתוך תא הצמח החי 1-5. בBiFC להתקרב לשלמה של שני שברי N-ו-C-מסוף nonfluorescent של עופרת חלבון פלואורסצנטי לחלבון פלואורסצנטי מחדש. שברי חלבוני ניאון רבים ושונים שימשו כדי לזהות אינטראקציות חלבון, למשל החלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP) כרומופור של אשר נוצר כימי על ידי שלוש שאריות שונות 6. ניתן לחצות חלבוני ניאון בתוך לולאה או SS-גדיל להביא שני שברי nonfluorescent אשר ניתן התמזגו שני החלבונים של עניין. Assay יכול לשמש כדי לזהות אינטראקציות בכל compartme subcellularnt בכל אורגניזם גדל אירובי או תאים שיכולים להיות מהונדס גנטי כדי לבטא חלבוני ההיתוך. אם שני החלבונים באים בסמיכות בתוך התא, הקרינה היא מחדש והוא יכול להיות במעקב על ידי מיקרוסקופ ללא התוספת של fluorophores או צבעים 3 אקסוגניים. טבק (benthamiana Nicotiana) הוכיח להיות אורגניזם מודל נוח לדמיין את האינטראקציה של חלבונים צמחיים, שכן בקלות ניתן לבטא חלבונים על ידי ניצול שינוי בתיווך Agrobacterium של טבק עם המבנים שנוצרו. Agrobacteria להשתמש פלסמיד שנקרא Ti (גידול גרימת) קידוד עבור אנזימים שלתווך התמרה של הגן של עניין לתאי צמח. BiFC הוא גם ישים עבור מסיס, כמו גם לחלבוני קרום בתוך כל התאים הסלולריים ושמש בהצלחה בשנים האחרונות לזהות אינטראקציה חלבוני in vivo, כמו גם לנתח אתרי אינטראקציהבתוך החלבונים 7-9. על הביטוי של הגנים הציגו, את האינטראקציה של חלבוני הניאון ניתן דמיינו ישירות בעלים, אשר מתאימה למבנים הסלולר גדולים יותר, כמו reticulum endoplasmic (ER), קרום הפלזמה או כלורופלסטים. עם זאת, כדי לפקח על הלוקליזציה במבנים מעודנים יותר, למשל, את מעטפת הכלורופלסט, רצוי לדמיין את הקרינה בprotoplasts מבודדת מעלי טבק השתנו. קבוצה של וקטורי BiFC המכילים גם C-מסוף או תג ניאון N-מסוף צריך לשמש לגישת BiFC בצמחי 10. הפרוטוקול המתואר להלן שימש כדי לחקור את האינטראקציה חלבון cytosolic הלם חום 90 (Hsp90) של עם חוזר tetratricopeptide תחום (TPR) המכיל חלבוני עגינת Toc64 וAtTPR7 מתגוררים במעטפת החיצונית הכלורופלסט וreticulum endoplasmic, בהתאמה 11-13. לצורך כך, Hsp90 היה התמזגו לCtחלק erminal של SCFP (SCFP C). התג היה N-סופני התמזגו למלווה כדי להבטיח נגישות של המוטיב בטרמינל C-MEEVD המחייב של Hsp90 כדי לצבוט מסוג תחומים TPR. במקביל, חלק N-המסוף של ונוס (Venus N) היה התמזגו לתחומי cytosolic של תחום TPR המכיל חלבוני עגינת Toc64 וAtTPR7, בהתאמה. כביקורת שלילית שאנו משובטים חלק מסיס בטרמינל C-C של SCFP אך ורק בו מתגורר בcytosol ולכן שליטה מתאימה. תגי הניאון של החלבונים למדו צריכים להתמודד באותו תא סלולארי כדי לאפשר לסמיכות ובכך הכינון מחדש של אות הניאון. כדי לקבוע את הלוקליזציה של אות הניאון מחדש חלבון סמן התמזגו לתג ניאון שונה ניתן cotransformed כדי להדגים את לוקליזציה subcellular של האינטראקציה. חלבון סמן ER התמזגו mCherrry הפך בו זמנית במקרה של ER ממוקם 14 AtTPR7. Autofluorescence של כלורופיל שימש כסמן הכלורופלסט במקרה של Toc64. לפי זה לא רק האינטראקציה in vivo של Toc64 וAtTPR7, בהתאמה, עם מלווה Hsp90 cytosolic ניתן לנטר ישירות בי הטבק אלא גם לוקליזציה subcellular של האינטראקציה יכולה להיחקר. BiFC מתאים גם כגישה משלים לשיטות אחרות לומדות אינטראקציות בין חלבונים. בהשוואה לcoimmunoprecipitation או בניסויים נפתחים מבחנה, למשל, אין נוגדנים ספציפיים צריכים להיות זמין לחלבונים של עניין, והחלבונים לא צריכים לבוא לידי ביטוי recombinantly במבחנה, מה שיכול להיות מאתגר, במיוחד לחלבונים בממברנה. יתר על כן, גם ניתן לנטר אינטראקציות חולפות באמצעות BiFC, שכן החלבונים שנתפסו על ידי האינטראקציה של תגי הניאון התמזגו 15.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="888">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">3&#39;,5&#39;-Dimethoxy-4&#39;-hydroxyacetophenone</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">D134406</td>
			<td style="width:195px;">Acetosyringone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Cellulase, Onozuka-R10</td>
			<td style="width:147px;">Serva</td>
			<td style="width:255px;">16419</td>
			<td>from Trichoderma viridae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Macerozyme R-10&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Serva</td>
			<td style="width:255px;">28302</td>
			<td>from Rhizopus sp</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:293px;">GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">11789-(020)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">11791-(020)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:255px;">27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit</td>
			<td style="width:147px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:255px;">740609-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">pDEST-GWVYNE</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">pDEST-VYNE(R)GW</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:293px;">pDEST-SCYCE(R)GW</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves

חלבונים רבים האינטראקציה transiently עם חלבונים אחרים או משולבים מתחמי חלבון רב כדי לבצע את תפקידם הביולוגי. שלמת bimolecular פלואורסצנטי (BiFC) היא שיטת in vivo כדי לפקח כגון אינטראקציות בתאי צמח. בפרוטוקול המובא חלבוני המועמד חקרו הם התמזגו לחצאים משלימים של חלבוני ניאון ומבני בהתאמה מוכנסי תאי צמח באמצעות שינוי בתיווך Agrobacterium. בהמשך לכך, החלבונים באים לידי ביטוי בtransiently עלי טבק וניתן לאתר אותות ניאון המשוחזר עם לייזר סריקת מיקרוסקופ confocal בתאים שלמים. זה מאפשר הדמיה לא רק של האינטראקציה עצמה, אלא גם לוקליזציה subcellular של קומפלקסי החלבונים ניתן לקבוע. לצורך כך, ניתן coexpressed גנים סמן המכילים תג ניאון יחד עם מבני BiFC, וכך לדמיין מבנים הסלולר כגון tהוא endoplasmic reticulum, מיטוכונדריה, מנגנון Golgi או קרום הפלזמה. אות הניאון ניתן לנטר באופן ישיר בתאי עלה אפידרמיס או בprotoplasts הבודד, אשר יכול להיות מבודד בקלות מהעלים הטבק השתנו. BiFC הוא אידיאלי ללמוד אינטראקציות בין חלבונים בסביבה הטבעית שלהם בתוך התא החי. עם זאת, יש לו כדי להיחשב כי הביטוי צריך להיות מונע על ידי יזמים חזקים וששותפי האינטראקציה משתנים עקב שילוב של תגי הקרינה גדולים יחסית, מה שעלול להפריע למנגנון האינטראקציה. עם זאת, BiFC הוא גישה משלים מצוינת לשיטות נפוצות מיושמות אחרות חוקרים אינטראקציות בין חלבונים, כגון coimmunoprecipitation, במבחני חוץ גופית נפתחים או ניסויי שמרים ושניים-היברידיים.

בדוגמא זו השתמשנו בשיטת BiFC לעקוב אחר האינטראקציה של Hsp90 המלווה המולקולרי cytosolic עם חלבוני העגינה קרום AtTPR7 וToc64. AtTPR7 הוא חלק מtranslocon Sec ואינטראקציה עם מלווים cytosolic, שאולי לספק preproteins הפרשה לטרנסלוקציה לאחר translational על קרום ER. כמו כן, Toc64 במעטפת החיצונית הכלורופלסט פועל ביבוא...

Watch this Scientific Journal Video about Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves at JoVE.com

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

היווצרות של קומפלקסי חלבוני in vivo ניתן דמיינו ידי שלמת הקרינה bimolecular. שותפי אינטראקציה הם התמזגו לחלקי משלימים של תגי ניאון והביעו transiently בי טבק, וכתוצאה מכך אות ניאון מחדש על סמיכות של שני חלבונים.

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

protein-protein-interactions-visualized-bimolecular-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

20.8K Views.  Ludwig-Maximilians-Universität, München.  היווצרות של קומפלקסי חלבוני in vivo ניתן דמיינו ידי שלמת הקרינה bimolecular. שותפי אינטראקציה הם התמזגו לחלקי משלימים של תגי ניאון והביעו transiently בי טבק, וכתוצאה מכך אות ניאון מחדש על סמיכות של שני חלבונים. 

Video: Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

מיון פלואורסצנטי תא פעיל של Protoplasts הצמח

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג&#39;ין

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

In-vivo גילוי של חלבונים אינטראקציות על מיקרו-בדוגמת משטחים

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Electrofusion Cell דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as immunoprecipitation do not provide information on the spatial localization of complexes. In contrast, BiFC monitors the interaction and subcellular compartmentalization of protein complexes. In this method, a fluororescent protein is split into amino- and carboxy-terminal non-fluorescent fragments which are then fused to two proteins of interest. Interaction of the proteins results in reconstitution of the fluorophore (Figure 1)1,2. A limitation of BiFC is that once the fragmented fluorophore is reconstituted the complex is irreversible3. This limitation is advantageous in detecting transient or weak interactions, but precludes a kinetic analysis of complex dynamics. An additional caveat is that the reconstituted flourophore requires 30min to mature and fluoresce, again precluding the observation of real time interactions4. BiFC is a specific example of the protein fragment complementation assay (PCA) which employs reporter proteins such as green fluorescent protein variants (BiFC), dihydrofolate reductase, b-lactamase, and luciferase to measure protein:protein interactions5,6. Alternative methods to study protein:protein interactions in cells include fluorescence co-localization and F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)7. For co-localization, two proteins are individually tagged either directly with a fluorophore or by indirect immunofluorescence. However, this approach leads to high background of non-interacting proteins making it difficult to interpret co-localization data. In addition, due to the limits of resolution of confocal microscopy, two proteins may appear co-localized without necessarily interacting. With BiFC, fluorescence is only observed when the two proteins of interest interact. FRET is another excellent method for studying protein:protein interactions, but can be technically challenging. FRET experiments require the donor and acceptor to be of similar brightness and stoichiometry in the cell. In addition, one must account for bleed through of the donor into the acceptor channel and vice versa. Unlike FRET, BiFC has little background fluorescence, little post processing of image data, does not require high overexpression, and can detect weak or transient interactions. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) is a method similar to FRET except the donor is an enzyme (e.g. luciferase) that catalyzes a substrate to become bioluminescent thereby exciting an acceptor. BRET lacks the technical problems of bleed through and high background fluorescence but lacks the ability to provide spatial information due to the lack of substrate localization to specific compartments8. Overall, BiFC is an excellent method for visualizing subcellular localization of protein complexes to gain insight into compartmentalized signaling.

The subcellular localization of proteins is important in determining the spatio-temporal regulation of cell signaling. Here, we describe bimolecular fluorescence complementation (BiFC) as a straightforward method for monitoring the spatial interactions of proteins in the cell.

השלמה Fluorescence bimolecular

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

איתור של אינטראקציות חלבון הצמח באמצעות bimolecular תואם Gateway הקרינה השלמה (BiFC) מערכת

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular: שיטה כמותית תפוקה גבוהה לחקר אינטראקציה בין חלבונים

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...