Biz yazının eleştirel okuma için yararlı tartışmalar ve Chris Carrie için Jürgen Soll teşekkür etmek istiyorum. Bu proje DFG ve Fonds der Chemischen Industrie (hibe numaraları SFB 1035, SS proje A04 ve RS 187/22 yapın) tarafından finanse edildi.

1.. BiFC transformasyonu, Agrobacterium içerisinde oluşturur <ol><li> BiFC yapıların klonlanması <ol><li> Yan attB siteleri içeren oligonükleotidler kullanılarak uygun bir şablonundan ilgilenilen geni yükseltin. Bir düzeltme polimeraz kullanılarak, bir PCR gerçekleştirin. Tasarlanan primer kombinasyonu tavlama aşamasının uzunluğunu ve parça büyüklüğüne göre uzama aşamasının uzunluğu ayarlayın. Agaroz jel elektroforezi ile PCR ürünü kontrol ediniz ve bir PCR Temizleme Kit kullanılarak kendisini saflaştırmak. </li><li> Elde edilen fragmanı ile BP reaksiyonu ve bir BP rekombinaz kullanılarak giriş vektörü yapın. Giriş 150 ng vektör ile attB-PCR ürününün 15-150 ng karıştırın, BP rekombinazın 2 ul ekleyin ve 8 ul bir toplam hacme TE tampon maddesi ile doldurmak. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin ve reaksiyonu 37 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 2 ul Proteinaz K eklenerek reaksiyonu durdurmak </li><li> , Yeterli E. içine tüm reaksiyon Transform coli DH5a, Hücreleri ve vektör içine DNA fragmanının sokulması için doğru bir koloni PCR ile elde edilen koloniler ekran. Pozitif DNA sekanslama plasmidlerin mutasyonların varlığını doğrulamak için gerçekleştirilir. </li><li> Bir LR recombinase kullanarak uygun hedef vektörü ile LR rekombinasyon için elde edilen giriş klonu kullanın. Hedef vektör 150 ng giriş vektörü 50-150 ng karıştırın, 1 ul LR rekombinazı ilave edin ve 5 ul bir toplam hacme TE tampon maddesi ile doldurmak. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin ve reaksiyonu 37 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1 ul Proteinaz K eklenerek reaksiyonu durdurmak </li><li> Vektöre DNA fragmanının sokulması için doğru koloni PCR ile elde edilen koloniler, yeterli E. coli DH5a hücreleri ve ekran içine tüm reaksiyon dönüşümü. DNA diziliş analizi, bu aşamada gerekli değildir. </li><li> Yüksek bir saflık derecesine ulaşmak için bir plazmid mini kiti ile plazmid DNA izole edilir. </li></ol></li><li> Kimyasal olarak yetkili Agrobacteria (hazırlanmasısuşu AGL1, Rifampisin ve Carbenisilin direnci) <ol><li> Çizgi Bir stok kültüründen Agrobakterium ve 28 ° C&#39;de 24 saat için büyümeye </li><li> Tek bir koloni, 5 ml LB ortamı aşılamak ve 28 ° C de bir gece inkübe </li><li> Inoküle 50 2, gece boyunca kültürün ml ve 1.0 OD 600 ile 28 ° C de yaklaşık 4 saat için büyümeye sahip ml LB ortamı. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüj ve hücreler buz soğukluğunda CaCl2 (10 mM) steril 1 ml pelletini. Bu adımdan sonra hücreleri buz üzerinde tutun. </li><li> -80 ° C&#39;de, sıvı azot ve mağaza hemen dondurma, hücrelerin alikotları (100 ul) hazırlayın </li></ol></li><li> Kimyasal olarak yetkili Agrobacterium transformasyonu <ol><li> Buz üzerinde yetkili AGL1 hücrelerinin bir kısım Çözülme. Hücrelere plasmid DNA 1-2 ug ekleyin. Buz üzerinde 5 dakika, 37 ° C de sıvı azot ile 5 dakika içinde 5 dakika boyunca inkübe Hücre ve s 600 ul LB ortamı ilave edin28 ° C&#39;de 4 saat boyunca 650 rpm&#39;de hake </li><li> 8,000 xg&#39;de 1 dakika için hücreler santrifüj ve süpernatant atılır. Uygun antibiyotikler ihtiva eden LB plakaları üzerinde kalan LB ortamı ve plaka 50 ul pelet tekrar. Plakları kapatın ve 28 ° C&#39;de 2 gün boyunca inkübe Koloni PCR ile plazmidin varlığı için ekran kolonileri. </li><li> Uygun antibiyotik içeren 5 ml LB ortamı içinde bir pozitif koloni inoküle ve gece boyunca 28 ° C&#39;de inkübe edin. 500 ul% 50 gliserol ile sterilize edilmiş, gece boyunca kültürün 500 ul karıştırın ve -80 ° C&#39;de dondurularak </li><li> Tütün yapraklarının geçici transformasyon için gliserol stoğundan doğrudan uygun bir antibiyotik ihtiva eden LB ortamı içinde Agrobacteria&#39;yı inoküle. </li></ol></li></ol> 2. Tütün Yapraklarının geçici Dönüşüm <ol><li> Agrobacteria&#39;ı büyüme <ol><li> Aşağıdaki stok çözümleri hazırlayın: Acetosyringone (150 mm, 70 çözülür-20 ° C &#39;de parçalar olarak% EtOH), mağaza MES / KOH (0.1 M), pH 5.7, 4 ° C (daha uzun süre depolama sırasında bakteri gelişimini önlemek için bir 0.2 uM filtre aracılığıyla steril filtre) saklayın, MgCl2 (1 M), hisse senedi, oda sıcaklığında saklayın. </li><li> Bir steril 50 ml tüp içinde, ilgi konusu plazmidi içeren AGL1 gliserol stok kültüründen 50 ul ile uygun bir antibiyotik ihtiva eden 10 ml LB ortamı aşılamak ve en az 24 saat 1.0 arasında bir OD 600 kadar, 190 rpm&#39;de çalkalanarak 28 ° C&#39;de inkübe -2.0 ulaşılır. </li><li> Santrifüj bakteriler 15 dakika boyunca 3.000 xg&#39;de. Taze infiltrasyon ortam içinde pelet [MgCI2 (10 mM), MES / KOH (10 mM), pH 5.7, Acetosyringone (150 uM)] yeniden süspanse edin ve 1.0 OD 600 için süspansiyon ayarlayın. </li><li> Karanlıkta, 2 saat için bir havai çalkalayıcıda Agrobacteria hücreleri inkübe edin. Hücreler daha sonra sızma için kullanılabilir. </li></ol></li><li> Tütün yaprakları Sızma <ol><li> Üç kullanınhaftalık tütün (Nicotiana benthamiana) bitkileri. Süzülmesi için birkaç eski yaprakları seçin. </li><li> Ilgilenilen yapıları (her biri 3 mi) taşıyan agrobakteri eşit hacimlerde karıştırın. Infiltrasyon için bir iğne olmayan bir 5 ml şırınga al. Çeşitli yerlerde yaprakların alt tarafında şırınga basarak tütün yaprakları dikkatli bir hücre süspansiyonu sızmak. </li><li> Bitkilerin su ve iki gün boyunca karanlıkta onları bırakın. </li></ol></li></ol> 3. Protoplast Hazırlık Tütün yapraklarının Protoplast hazırlanması Koop et al. 16 uyarlanmıştır ve biraz değiştirilmiştir. <ol><li> Tampon hazırlanması <ol><li> F-PCN orta hazırlayın: makro tuzları, [3 (1012 ug / ml) KNO, CaCl2 • 2H 2 O (440 ug / ml), MgSO 4 • 7H 2 O (370 ug / ml), KH 2 PO 4 ( 170 ug / ml), NH 4-süksinat [(20 mM, bir 2 M stok eriyiği hazırlamakution] (süksinat (236 ug / ml) ve NH4CI (106 ug / ml), çözünmesi için pH 5.8 &#39;e ayarlayın), mikro tuzları [EDTA-Fe (III), Na-tuzu (40 ug / ml) x KJ (0.75 ug / ml), 3 H BO 3 (3 ug / ml), 4 MnSO • H2O (10 ug / ml), 4 ZnSO • 7H 2 O (2 ug / ml), Na 2 MoO 4 • 7H 2 O (0.25 ug / ml), • 4 CuSO 5H 2 O (0.025 ug / ml), CoCl2 • 6H 2 O (0.025 ug / ml)], MES (390 ug / ml), glikoz (yaklaşık 80 ug / ml), ozmotik basıncı 550 mOsm, pH 5.8 (KOH). -20 ° C &#39;de parçalar halinde saklayın </li><li> F-PIN orta hazırlayın: F-PCN olarak yerine glikoz kullanımı sukroz (yaklaşık olarak 110 ug / ml), osmolarite 550 mOsm, pH 5.8 (KOH) bütün katkı maddeleri. -20 ° C &#39;de parçalar halinde saklayın </li><li> W5 orta hazırlayın: 150 mM NaCI, 125 mM CaCl2, 5 mM KCI, 2 mM MES, osmolaritesi 550-580 mOsm, pH 5.7 (KOH). 4 ° Mağazası, C (daha uzun depolama sırasında bakteri gelişimini önlemek için bir 0.2 mikron filtre içinden, steril filtre). </li><li> Protoplast izolasyonu (0.1 g selülaz, 10 ml F-PIN 0.03 g macerozym) için taze enzim çözeltisi hazırlayın. 10 dakika ve oda sıcaklığına soğutun boyunca 55 ° C&#39;de çözelti inkübe edin. 10 ml çözeltiye,% 10 BSA, 100 ul ekleyin. </li></ol></li><li> Protoplastların izolasyonu <ol><li> Bir Petri kutusu içine bir infiltre yaprak koyun ve taze enzim çözeltisi ekleyin. Yaklaşık olarak 0.5 cm büyüklüğünde parçalar halinde 2 yaprak kesmek için yeni bir jilet kullanın. Bir vakum-infiltrasyon şişeye enzim çözeltisi ile yaprak parçaları transfer ve hava kabarcıkları (çok dikkatli bir şekilde serbest bırakma vakum) yaprakların ortaya kadar vakum yaklaşık olarak 20 saniye boyunca sızmak. </li><li> Karanlıkta 40 rpm&#39;de 90 dakika boyunca çalkalanır. </li><li> 90 rpm&#39;de 1 dakika boyunca çalkalanarak protoplast serbest bırakın. Bir 15 ml santrifüj tüpüne (yuvarlak alt) içine gazlı bez (100 uM) ile solüsyon filtre. </li&gt; <li> 70 x g&#39;de oda sıcaklığında (yavaş hızlanma ve yavaşlama) 10 dakika boyunca 2 ml F-PCN tampon ve santrifüj ile protoplast çözelti Yerleşimi. </li><li> Bozulmamış protoplastlar enzim çözeltisi ve F-PCN arayüzünde birikir. Yeni bir santrifüj tüpü içine sağlam protoplastlarını aktarmak ve W5 tamponu ile doldurmak için geniş bir delik 1 ml pipet alın. Protoplast pelet 100 x g (yavaş hızlanma ve yavaşlama) 2 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> Protoplast miktarına bağlı olarak, yaklaşık olarak 200 ul W5 tamponu içinde bir pipet ve pelet tekrar süspansiyon kullanılarak dikkatli bir şekilde süpernatantı. </li><li> Her zaman olduğu gibi protoplast yırtılmasının önlenmesi için geniş delikli ipuçlarını kullanın. </li></ol></li></ol> 4. Lazer Tarama Mikroskopi <ol><li> Örnek hazırlanması <ol><li> Bir mikroskop lamı etrafında sızdırmazlık iki küçük şeritler (2 cm arayla) yapıştırın. Şeritler arasındaki protoplast çözeltisinin 20 ul koyun ve dikkatli bir şekilde bir cam kapak yerüstüne. Sızdırmazlık şeritleri Protoplastlar cam kapak tarafından ezilmiş olmadığından emin olun. </li><li> Toplam yaprak örnekleri yaprak 1 cm parça kesip yukarı bakacak yaprağın alt tarafı ile bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin için. , Yaklaşık 30 ul H 2 O ekleyin üstüne bir kapak cam yerleştirin ve her iki tarafta yapışkan bantla sıkıca sabitleyin. </li></ol></li><li> Konfokal görüntüleme ve mikroskop ayarları <ol><li> TCS SP5: Görüntüleme Leica, Tipi konfokal lazer tarama mikroskobu ile yapılır. Büyütme için görüntüleme ortamı olarak gliserol ile 63X bir şiddetinde bir objektif (HCX PL APO CS) kullanın. Sayısal açıklık 1.3 ayarlayın. Değerlendirme için Leica Application Suite / Gelişmiş Flüoresan yazılımını (Ek Bilgi S1 bakınız) kullanın. </li><li> 515 nm &#39;de yeniden BiFC sinyalinin izlenmesi ve bir PMT 495-550 detektör emisyon bant genişliğini ayarlamak için% 18 oranında bir yoğunluğu 488 nm&#39;de% 30 Argon lazer ve lazer gücü. </li&gt; <li> Klorofil otoflüoresanı izlemek için 650-705 ikinci PMT detektör emisyon bant genişliğini ayarlayabilirsiniz. </li><li> MCherry sinyali HeNe lazer kullanmak 561 izlemek için, lazerin yoğunluğu 561-18 ve% 587-610 üçüncü PMT detektörün emisyon bant genişliği ayarlanır. </li><li> Tüm PMT detektör kanallarına fotoğraf aynı kazanç ayarları (kazancı arka plan sinyallerini dışlamak 800-900 arasında olmalıdır) ile alınır emin olun. </li><li> 100 Hz tarama hızı ile 1024 x 1024 piksel bir biçim genişlik / yükseklik fotoğraflar çekin. </li><li> Z-stackings her yığını arasında 0.5 mikron maksimum mesafe kullanmak için. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Citovsky, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+interacting+proteins+by+bimolecular+fluorescence+complementation+in+planta.">Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta.</a> J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).</li><li>Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+to+study+protein-protein+interactions+in+living+plant+cells.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells.</a> Methods Mol. Biol. 479, 189-202 (2009).</li><li>Weinthal, D., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein-protein+interactions+in+plant+cells+by+bimolecular+fluorescence+complementation+assay.">Imaging protein-protein interactions in plant cells by bimolecular fluorescence complementation assay.</a> Trends Plant Sci. 14, 59-63 (2009).</li><li>Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+protein-protein+interactions+in+plants+by+bimolecular+fluorescence+complementation.">The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).</li><li>Ohad, N., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+to+assay+protein-protein+interaction+in+plants.">Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants.</a> Methods Mol. Biol. 655, 347-358 (2010).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Lee, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+a+cDNA+library+for+protein-protein+interactions+directly+in+planta.">Screening a cDNA library for protein-protein interactions directly in planta.</a> Plant Cell. 24, 1746-1759 (2012).</li><li>McFarlane, H. E., Shin, J. J., Bird, D. A., Samuels, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+ABCG+transporters,+which+are+required+for+export+of+diverse+cuticular+lipids,+dimerize+in+different+combinations.">Arabidopsis ABCG transporters, which are required for export of diverse cuticular lipids, dimerize in different combinations.</a> Plant Cell. 22, 3066-3075 (2010).</li><li>Dunschede, B., Bals, T., Funke, S., Schunemann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+studies+between+the+chloroplast+signal+recognition+particle+subunit+cpSRP43+and+the+full-length+translocase+Alb3+reveal+a+membrane-embedded+binding+region+in+Alb3+protein.">Interaction studies between the chloroplast signal recognition particle subunit cpSRP43 and the full-length translocase Alb3 reveal a membrane-embedded binding region in Alb3 protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35187-35195 (2011).</li><li>Gehl, C., Waadt, R., Kudla, J., Mendel, R. R., Hansch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+GATEWAY+vectors+for+high+throughput+analyses+of+protein-protein+interactions+by+bimolecular+fluorescence+complementation.">New GATEWAY vectors for high throughput analyses of protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol. Plant. 2, 1051-1058 (2009).</li><li>Qbadou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+chaperone+Hsp90+delivers+precursor+proteins+to+the+chloroplast+import+receptor+Toc64.">The molecular chaperone Hsp90 delivers precursor proteins to the chloroplast import receptor Toc64.</a> EMBO J. 25, 1836-1847 (2006).</li><li>Schweiger, R., Muller, N. C., Schmitt, M. J., Soll, J., Schwenkert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtTPR7+is+a+chaperone+docking+protein+of+the+Sec+translocon+in+Arabidopsis.">AtTPR7 is a chaperone docking protein of the Sec translocon in Arabidopsis.</a> J. Cell Sci. , (2012).</li><li>Schweiger, R., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtTPR7+as+part+of+the+Arabidopsis+Sec+post-translocon.">AtTPR7 as part of the Arabidopsis Sec post-translocon.</a> Plant Signal Behav. 8, (2013).</li><li>Nelson, B. K., Cai, X., Nebenfuhr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolored+set+of+in+vivo+organelle+markers+for+co-localization+studies+in+Arabidopsis+and+other+plants.">A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants.</a> Plant J. 51, 1126-1136 (2007).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+analysis+as+a+probe+of+protein+interactions+in+living+cells.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells.</a> Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).</li><li>Koop, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+foreign+sequences+into+the+tobacco+plastome+via+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation.">Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation.</a> Planta. 199, 193-201 (1996).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bir BiFC deney planlama üzerine birkaç nokta dikkate alınmalıdır. Ilgilenilen protein ile ilgili yapısal bilgi gerekli olduğundan, topoloji zar kapsayan proteinleri ile çalışan bilinen zorundadır. Floresan proteinleri aynı hücre içi kabininde bulunan ya da etkileşim sağlamak için bir zarın aynı yan yüz gerekir. Bir N-terminal hedefleme sekansı gerekli proteinleri analiz Doğal olarak, yalnızca C-ucu işareti olarak kabul edilebilir. Bu etiket, bir GFP-etiketli proteini ifade ile, örneğin, daha ö...

Protein komplekslerinin oluşumunu incelenmesi ve in vivo olarak bitki hücrelerinde hücresel lokalizasyonu ağları araştırmak için gereklidir, sinyalizasyon ve metabolik süreçleri. BiFC doğrudan canlı bitki hücresine 1-5 içinde, doğal ortamda, protein-protein etkileşimleri görselleştirme sağlar. BiFC bir yeniden floresan protein için bir floresan protein kurşun iki özelliğine sahip olmayan N-ve C-terminal parçalarının tamamlanmasını yaklaşım. Birçok farklı floresan proteinlerin fragmanları da bu, yeşil floresan proteini (GFP), kimyasal olarak üç farklı artıkları 6 tarafından oluşturulduğu bir kromofor, örneğin, protein etkileşimlerini tespit etmek için kullanılmıştır. Floresan proteinleri ilgi iki proteinlere kaynaştırılabilir iki nonfluorescent parçalarının neden olduğu bir ilmek ya da beta-iplikçik içinde yarıya indirilebilir. Deney, bir hücre içi compartme etkileşimleri tespit etmek için kullanılabilirgenetik füzyon proteinleri ifade etmek için modifiye edilebilir bir aerobik olarak büyüyen bir organizmaya veya hücrelerde nt. , Iki proteinin hücre içinde yakın ilişkiye de zorlamaktadır geliyorsa, floresan kurulur ve dışsal florofor veya boyalarla 3 ilavesi olmadan mikroskobu ile izlenebilir. Proteinler, kolaylıkla üretilen tütün konstruktları ile yaprak arasında Agrobacterium aracılı transformasyon kullanılarak ifade edilebilir çünkü Tütün (Nicotiana benthamiana), bitki protein etkileşimini görselleştirmek için uygun bir model organizma olduğu kanıtlanmıştır. Agrobacteria bitki hücrelerine ilgi konusu genin iletimine aracılık enzim için kodlama yapan bir sözde Ti plazmidi (tümör indükleyici) kullanın. BiFC çözünür hem de bütün hücre bölmesi içinde zar proteinleri için de uygulanabilir olduğunu ve in vivo olarak başarılı bir şekilde etkileşen proteinleri tespit etmek hem de etkileşim bölgelerine analiz etmek için son yıllarda kullanılmıştır7-9 proteinler içinde. Katılan genlerin sentezlenmesi üzerine, floresan protein etkileşimi gibi, endoplazmik retikulum (ER), plazma membranı veya kloroplast gibi daha büyük hücre yapıları için uygun olan, yaprak doğrudan görselleştirilebilir. Ancak, daha fazla rafine yapılarda lokalizasyonunu izlemek için, örneğin kloroplast zarf, bu dönüştürülmüş tütün yapraklarından izole edilmiş protoplastlarda floresan görselleştirmek için tavsiye edilir. Bir C-terminal veya N-terminal floresan etiket bitkiler 10 BiFC yaklaşım için kullanılacak olan ya da ihtiva eden BiFC vektörler bir dizi. Aşağıda açıklanan protokol tetratricopeptide tekrar yanaşan proteinleri Toc64 ve AtTPR7 kloroplast dış zarf ve sırasıyla endoplazmik retikulum, 11-13 ikamet içeren (TPR) etki ile sitozolik ısı şok proteini 90 (HSP90) etkileşimini incelemek için kullanılmıştır. Bu amaçla, HSP90 Ct kaynaştırılmıştırSCFP (SCFP C) erminal parçasıdır. Etiket, N-terminal TPR etki tipte kelepçe HSP90&#39;ın C-terminal MEEVD bağlanma motifi erişim sağlamak için şaperon kaynaşmış oldu. Buna paralel olarak, Venüs (Venus N) en N-ucu kısmı yerleştirme proteinleri sırasıyla Toc64 ve AtTPR7 içeren TPR etki sitosolik etki ile kaynaştırılır. Negatif kontrol olarak, sitosol içinde yer alır ve bu nedenle, uygun bir kontrol olarak yalnızca SCFP C çözünür C-terminal parçası klonlandı. Üzerinde çalışılan proteinlerin floresan etiketler yakın ve bu şekilde floresan sinyalinin sulandırma izin vermek üzere, aynı hücre bölmesi yüz vardır. Farklı bir floresan etiket ile kaynaşmış bir işaretleyici protein etkileşimi hücre içi lokalizasyonu göstermek için ortak transforme edilebilir yeniden floresan sinyalinin lokalizasyonunu belirlemek. MCherrry kaynaşık bir ER markör proteinin aynı anda dönüştürülmüştürAtTPR7 14 bulunan ER durumda. Klorofil otofloresansı Toc64 durumunda kloroplast marker olarak görev yaptı. Bu sayede sadece sitosolik HSP90 ile, sırasıyla şaperon Toc64 ve AtTPR7, in vivo etkileşim tütün yapraklarının doğrudan izlenebilir değil, aynı zamanda etkileşim hücre içi lokalizasyonu araştırılabilir. BiFC, protein-protein etkileşimlerini incelemek için diğer yöntemler için tamamlayıcı bir yaklaşım olarak uygundur. Coimmunoprecipitation ya da nitro pull-down deneylerde göre, örneğin, herhangi bir özel antikorlar ilgi konusu proteinleri için kullanılabilir olması gerekir, ve proteinler, özellikle membran proteinleri için, zor olabilir, in vitro olarak rekombinant ifade edilmesi gerekmez. Proteinler kaynaşık floresan etiketler 15 etkileşimi ile yakalanır Üstelik, aynı zamanda geçici etkileşimler, BIFC kullanılarak izlenebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="888">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">3&#39;,5&#39;-Dimethoxy-4&#39;-hydroxyacetophenone</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">D134406</td>
			<td style="width:195px;">Acetosyringone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Cellulase, Onozuka-R10</td>
			<td style="width:147px;">Serva</td>
			<td style="width:255px;">16419</td>
			<td>from Trichoderma viridae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Macerozyme R-10&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Serva</td>
			<td style="width:255px;">28302</td>
			<td>from Rhizopus sp</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:293px;">GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">11789-(020)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit</td>
			<td style="width:147px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">11791-(020)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:255px;">27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit</td>
			<td style="width:147px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:255px;">740609-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">pDEST-GWVYNE</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">pDEST-VYNE(R)GW</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:293px;">pDEST-SCYCE(R)GW</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;">Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant</td>
			<td>Gateway-cloning (Invitrogen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein-protein interactions visualized by bimolecular fluorescence complementation in tobacco protoplasts and leaves

Çoğu protein, diğer proteinler ile geçici olarak etkileşebilir ya da biyolojik işlevi gerçekleştirmek için, çok-protein kompleksleri halinde entegre edilmiştir. Bimoleküler floresan tamamlama (BiFC), bitki hücrelerindeki bu tür etkileşimlerin görüntülenmesi için bir in vivo bir yöntemdir. Sunulan protokol, incelenen aday proteinlerin floresan proteinleri tamamlayıcı yarılarına kaynaşmış ve ilgili yapılan, Agrobacterium aracılı transformasyon yoluyla bitki hücrelerine dahil edilir. Daha sonra, proteinler, geçici tütün yapraklarının olarak ifade edilmiştir ve geri floresan sinyalleri sağlam hücrelerde konfokal lazer tarama mikroskobu ile tespit edilebilir. Bu etkileşimin kendisinin sadece görselleştirme sağlar, aynı zamanda protein komplekslerinin hücre içi lokalizasyonu belirlenebilir. Bu amaçla, bir fluoresan etiketi ihtiva eden marker genleri böylece bu t olarak hücresel yapılarının görselleştirme, BiFC konstruktları ile birlikte eksprese edilebilirO retikulum, mitokondri, Golgi aygıtı ya da plazma zarı endoplazmik. Flüoresan sinyal ya doğrudan yaprak epidermal hücrelerde ya da kolayca dönüştürülmüş tütün yapraklarından izole edilebilir tek protoplastlar içinde izlenebilir. BiFC ideal olarak canlı hücre içinde kendi doğal ortamda, protein-protein etkileşimleri incelemek için uygundur. Bununla birlikte, bu ifade, güçlü promotörler ile tahrik edilecek ve etkileşim ortakları nedeniyle etkileşim mekanizması ile etkileşebilir nispeten büyük floresan etiketler, füzyonu için modifiye olduğu olduğu kabul edilmelidir. Bununla birlikte, bu tür BiFC coimmunoprecipitation gibi protein-protein etkileşimleri, in vitro pull-down testleri ya da maya iki-hibrid deneylerini araştıran diğer yaygın olarak uygulanan yöntemler için mükemmel tamamlayıcı bir yaklaşımdır.

Bu örnekte, zar proteinleri yerleştirme AtTPR7 ve Toc64 ile sitosolik moleküler şaperon HSP90&#39;ın etkileşimini izlemek için BiFC yöntemi kullanılır. AtTPR7 Sec translokon bir parçası olan ve muhtemelen ER membranına translasyon sonrası translokasyon için salgılama preproteins teslim sitosolik şaperonlar, ile etkileşime girer. Aynı şekilde, kloroplast dış zarfa Toc64 HSP90 ilişkili kloroplast preproteins alarak post-translasyon ithalat davranır. Her iki protein de HSP90&#39;ın C-terminal MEEVD...

Watch this Scientific Journal Video about Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves at JoVE.com

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

In vivo protein komplekslerinin oluşumu bimoleküler floresan tamamlanmasıyla görselleştirilebilir. Etkileşim ortakları floresan etiketler tamamlayıcı bölümlerine bağlı ve geçici olarak tütün yaprakları olarak ifade edilen iki protein arasında yakın üzerine yeniden flüoresan sinyal elde edilir.

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

protein-protein-interactions-visualized-bimolecular-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

20.7K Görüntüleme.  Ludwig-Maximilians-Universität, München.  In vivo protein komplekslerinin oluşumu bimoleküler floresan tamamlanmasıyla görselleştirilebilir. Etkileşim ortakları floresan etiketler tamamlayıcı bölümlerine bağlı ve geçici olarak tütün yaprakları olarak ifade edilen iki protein arasında yakın üzerine yeniden flüoresan sinyal elde edilir. 

Video: Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Bitki protoplast Floresan Aktif Hücre Ayırma

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Biyoloji

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Helios Gen Tabancası kullanarak Soğan Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) Testi

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

Mikro desenli Yüzeyler, protein-protein etkileşimleri-vivo Algılama

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Hücre Elektrofüzyon Floresan Mikroskop ile görüntülendi

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as immunoprecipitation do not provide information on the spatial localization of complexes. In contrast, BiFC monitors the interaction and subcellular compartmentalization of protein complexes. In this method, a fluororescent protein is split into amino- and carboxy-terminal non-fluorescent fragments which are then fused to two proteins of interest. Interaction of the proteins results in reconstitution of the fluorophore (Figure 1)1,2. A limitation of BiFC is that once the fragmented fluorophore is reconstituted the complex is irreversible3. This limitation is advantageous in detecting transient or weak interactions, but precludes a kinetic analysis of complex dynamics. An additional caveat is that the reconstituted flourophore requires 30min to mature and fluoresce, again precluding the observation of real time interactions4. BiFC is a specific example of the protein fragment complementation assay (PCA) which employs reporter proteins such as green fluorescent protein variants (BiFC), dihydrofolate reductase, b-lactamase, and luciferase to measure protein:protein interactions5,6. Alternative methods to study protein:protein interactions in cells include fluorescence co-localization and F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)7. For co-localization, two proteins are individually tagged either directly with a fluorophore or by indirect immunofluorescence. However, this approach leads to high background of non-interacting proteins making it difficult to interpret co-localization data. In addition, due to the limits of resolution of confocal microscopy, two proteins may appear co-localized without necessarily interacting. With BiFC, fluorescence is only observed when the two proteins of interest interact. FRET is another excellent method for studying protein:protein interactions, but can be technically challenging. FRET experiments require the donor and acceptor to be of similar brightness and stoichiometry in the cell. In addition, one must account for bleed through of the donor into the acceptor channel and vice versa. Unlike FRET, BiFC has little background fluorescence, little post processing of image data, does not require high overexpression, and can detect weak or transient interactions. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) is a method similar to FRET except the donor is an enzyme (e.g. luciferase) that catalyzes a substrate to become bioluminescent thereby exciting an acceptor. BRET lacks the technical problems of bleed through and high background fluorescence but lacks the ability to provide spatial information due to the lack of substrate localization to specific compartments8. Overall, BiFC is an excellent method for visualizing subcellular localization of protein complexes to gain insight into compartmentalized signaling.

The subcellular localization of proteins is important in determining the spatio-temporal regulation of cell signaling. Here, we describe bimolecular fluorescence complementation (BiFC) as a straightforward method for monitoring the spatial interactions of proteins in the cell.

Bimoleküler Floresan tamamlama

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

Ağ Geçidi Uyumlu Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) kullanarak Bitki Protein Etkileşimleri Tespiti

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

Bimoleküler Floresan tamamlama akışı Sitometrik Analizi: Protein-protein etkileşim Eğitim Bir Yüksek Verimli Kantitatif Yöntemi

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi kullanma Canlı Hücrelerde Protein-protein etkileşimleri araştıran

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...