We thank Katherine Clark for technical assistance. A.D.R.G. is funded in part by 5K01MH097957-03

Adulto (3-4 meses de idade) ratos machos em um C57BL / 6 fundo misto foram utilizados neste protocolo. Os animais foram mantidos em um ciclo claro / escuro de 12 horas de luz, e permitiu o livre acesso a comida e água. Todos os procedimentos realizados neste protocolo foram realizados de acordo com protocolos aprovados pela Comissão de Drexel University Institutional Animal Care e Use. 1. Preparar Área Cirúrgica <ol><li> Desinfetar mesa cirúrgica com etanol 70%, em seguida, cobrir toda a bancada cirúrgica com absorventes higiênicos e providenciar instrumentos cirúrgicos adjacente ao estereotáxica. </li><li> Configurar equipamento estereotáxico sem braço manipulador. Organizar a almofada de aquecimento na estereotáxico e ajustado para 37 ° C. Evitar o sobreaquecimento do animal, colocando um pequeno pedaço de papel toalha ou almofada cirúrgica entre o animal ea almofada de aquecimento. </li><li> Com uma tesoura autoclavados, cortar pequenos pedaços de gelfoam autoclavado em uma placa de Petri estéril contendo solução salina 0,9% estéril até ready para uso. Nota: Manter ambiente de trabalho estéril, utilizando instrumentos esterilizados e suprimentos cirúrgicos estéreis. Re-esterilizar instrumentos cirúrgicos durante o procedimento ou entre animais por meio de imersão em um esterilizador talão de 10-15 segundos, conforme necessário. Manter luvas limpas durante todo o procedimento, esfregando as mãos com álcool a 70%, conforme necessário, de desinfectar. </li></ol> 2. Prepping mouse para Cirurgia <ol><li> Remover rato de gaiola e pesar (g). </li><li> Colocar o mouse na câmara de indução isoflurano e definir oxigênio a 2 L / min e vaporizador isoflurano a 5 para induzir um plano cirúrgico de anestesia, cerca de 3-5 min. Monitore a respiração desacelerou e imobilização. Verifique se o mouse está totalmente sedado utilizando o reflexo toe pitada. </li><li> Quando o mouse está totalmente sedado, coloque no quadro estereotáxico, prenda o nariz no cone do nariz, que está ligado com a tubulação para o isoflurano. Insira barras de ouvido no canal do ouvido e aperte, garantindo a cabeça é estável. </li><li> Raspar a cabeça de orelha a orelha, e de entre os olhos para atrás das orelhas. </li><li> Esterilizar a pele com toalhetes alternados de álcool isopropílico e uma solução de betadine iodo, 3 vezes cada um. </li><li> Aplicar lágrimas artificiais para ambos os olhos para evitar que sequem durante o procedimento cirúrgico. </li></ol> 3. Procedimento Cirúrgico <ol><li> Monitore a profundidade da anestesia por beliscar a ponta ou cauda. O rato está localizado no plano cirúrgico apropriado quando não houver nenhuma resposta, e a respiração é lenta e uniforme. </li><li> Faça uma incisão na pele parasagittal de apenas atrás dos olhos para quase entre as orelhas em um único movimento, firme, usando uma lâmina de bisturi n ° 11. Mova pele de lado e clip lado direito com pinça hemostática. </li><li> Limpar crânio de membrana sobreposta usando o lado maçante do No. 11 bisturi e algodão derrubou aplicadores. Opcionalmente, limpe o crânio com algodão aplicador derrubado mergulhados em solução salina a 0,9%. Deixar secar completamente. </li><li> Nósção uma pequena régua, marcar a borda anterior da craniotomia a 1 mm caudal para a sutura coronária, e a borda esquerda da craniotomia em 1 mm lateral à sutura sagital (Figura 1), com um marcador permanente. Em seguida, marque a direita e fronteiras caudal da craniotomia a 4 mm das suturas sagital e coronal, respectivamente (Figura 1). </li><li> Usando uma broca de 0,5 mm, começar a fazer a craniotomia por perfuração lentamente seguindo o contorno marcador permanente. Tenha cuidado para não romper o crânio completamente. Pressione suavemente a parte isolada de osso parietal com No. 5 fórceps, áreas de fraqueza dará lugar à pressão. Quando o osso diluído é suficientemente fraca ao longo do perímetro, a peça óssea está pronta para remoção. NOTA: Se a dificuldade experiências investigador remoção do osso em uma única peça, isso sugere que o osso não estava suficientemente diluído durante a perfuração. Considere a perfuração do crânio ainda mais em animais subsequentes para Facilitate fácil remoção da peça óssea. </li><li> Usando uma seringa de 10 ml, equipado com uma agulha G 23, aplicam-se uma pequena quantidade de 0,9% de solução salina para absorver o osso isolado e área perfurada. </li><li> Prenda o braço manipulador ao equipamento estereotáxico. Anexar uma nova lâmina de bisturi n ° 11 para o titular da sonda com o lado afiado da lâmina virada para rostralmente. Nota: Embora os tecidos rostral e caudal experimentar as arestas vivas e sem corte da lâmina, respectivamente, a danos mecânicos induzida pela lesão penetrante é comparável em toda a extensão da lesão. Observamos há diferenças consideráveis ​​das principais características da gliose reativa incluindo upregulation de expressão ou a proliferação GFAP, entre as seções rostral e caudal. </li><li> Mantendo o braço manipulador fora do caminho, levante cuidadosamente o osso isolado usando 5/45 fórceps anguladas. Insira a ponta da pinça para o lado do osso isolada e elevador, usando alavanca para retirar o pedaço de osso deixado para trás em um full movimento. NOTA: Tenha cuidado para não apunhalar o cérebro ou perturbar a dura por baixo do crânio. </li><li> Pegue um pequeno pedaço da espuma gel absorvível embebida e coloque sobre o cérebro descoberto para evitar que ela seque e absorva todo o sangue que possa estar presente. </li><li> Uma vez que a espuma de gel está no lugar, balançar o braço manipulador no lugar e ajustar lâmina para o centro da craniotomia sobre a espuma gel. Remover a espuma de gel e reduzir a lâmina até que a ponta toca a dura-máter sem a perfuração da dura-máter. Mark dorsal / ventral coordenadas utilizando a escala vernier no braço vertical da estereotáxico. </li><li> Usando o braço manipulador, abaixe lentamente a lâmina precisamente três milímetros no cérebro. Isto é conseguido usando as marcas de escala vernier do braço manipulador. Permitir lâmina para ficar no lugar de 5-10 seg. Mova o braço estereotáxico com acessório lâmina rostral para caudal três vezes, permitindo que a lâmina para alcançar os limites rostral e caudal da craniotomia antes de passar para o opposite fim. NOTA: A dura-máter não é removido antes de inserir a lâmina. Em contraste com a dura-máter de rato, que é ~ 80 um de espessura 7, a dura-máter do rato é consideravelmente mais finas (apenas algumas camadas celulares de espessura) e não produz uma resistência apreciável para a lâmina de bisturi durante a inserção. Usar uma nova lâmina de bisturi para cada rato para assegurar que cada animal recebe uma lesão consistente. </li><li> Lentamente levantar o braço estereotáxico, retirando a lâmina do cérebro. Após a remoção da lâmina, coloque imediatamente um outro pedaço de gelfoam na superfície do cérebro para absorver qualquer excesso de sangue ou fluido. </li><li> Enquanto isso, retirar o braço estereotáxico e dispor da lâmina de bisturi n ° 11. Uma vez que o sangramento parou, remova o gelfoam. </li><li> Fechar a ferida por sutura da pele com sutura não absorvível, tal como ethilon ou prolene. As suturas devem ser removidos 9-10 dias após a cirurgia. </li><li> Devolver o mouse para sua gaiola, e permitir que o mouse para se recuperar lentamente em um heating pad eo monitor para detectar quaisquer sinais de angústia. A recuperação da anestesia induzida por isoflurano tipicamente ocorre dentro de 2-5 minutos após a remoção do isofluorano. Não deixe o animal sem supervisão até que ele recuperou recumbancy esternal. </li><li> Administrar 0,5-1 ml de solução de Ringer lactato subcutaneamente para garantir a hidratação. </li></ol> 4. Cuidados pós-cirúrgica <ol><li> Acompanhar de perto os animais no pós-operatório até a recuperação da anestesia, antes de voltar para a colônia. <ol><li> Para reduzir a dor e desconforto pós-operatório, administrar 0,05-0,1 mg / kg de buprenorfina por injecção ip imediatamente após o procedimento. </li><li> Observe os animais por 2-3 dias após a cirurgia para sinais severos de angústia, como movimentos restritos, a falta de preparação, ou perda de peso. Euthanize animais que demonstram algum destes sinais de sofrimento e retire do estudo. </li></ol></li><li> Para examinar histopatológico de tecidos lesados, eutanásia animais por stanperfusão intracardíaca dard. <ol><li> Resumidamente, anestesiar os animais com uma overdose de cetamina / xilazina e, em seguida perfundidos intracardial com 15-20 mL de NaCl a 0,9%, ou até que o fígado é limpa de sangue, seguido por 60 ml de paraformaldeído a 4% no final da experiência. </li></ol></li><li> Dissecar cérebros e pós-correção para 2-4 h em paraformaldeído a 4% antes da transferência para solução de sacarose 30%. Secção cérebros num crióstato a 40-60 uM, e processo por procedimentos histológicos ou imuno-histoquímicos convencionais, ou como descritos em Garcia 8,9. </li></ol>

<ol>
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[corrected].</a> Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

É fundamental que o crânio ou dura subjacente não sejam danificados durante a perfuração. Use uma leve pressão durante a perfuração para garantir o crânio não é perfurada. Além disso, deve ser tomado cuidado ao levantar o pedaço do crânio para garantir a dura não é levantado com o osso. A lesão forebrain facada descrito aqui modelos de uma lesão penetrante no SNC. Embora menos clinicamente traduzível do que os modelos de TBI como FPI ou ICC, o modelo de lesão forebrain fa...

A major challenge for developing successful therapies to treat the injured CNS is an incomplete understanding of the complex multicellular events that are triggered by the trauma. Reactive astrocytes are gaining increasing recognition as a promising target for novel therapies1. Though historically regarded as hostile to neural repair, reactive astrocytes are now recognized as critical components of a complex, multicellular neuroprotective response that includes attenuation of inflammatory processes and limiting secondary damage and neurodegeneration2-6. Although the neuropathological characteristics of reactive gliosis have long been well defined, the cellular and molecular mechanisms regulating reactive gliosis, and the diverse array of downstream consequences remain poorly understood. Understanding the mechanisms that drive reactive gliosis, as well as the subsequent cellular and molecular events, is an important step towards developing strategies aimed at promoting the neuroprotective properties of reactive gliosis, while attenuating the detrimental effects. 
Here we demonstrate a method to induce severe reactive astrogliosis in the forebrain of adult mice using a stab injury. In contrast to other traumatic brain injury (TBI) models, such as controlled cortical impact (CCI) or fluid percussion injury (FPI), which require specialized equipment to produce an injury, the forebrain stab requires only a stereotaxic device to stabilize the head and a No. 11 scalpel blade. Thus the forebrain stab lesion model is more broadly accessible to a wide range of laboratories that do not have access to the specialized devices necessary for creating an FPI or CCI injury. The method described here enables investigators to reliably and reproducibly trigger a robust gliosis response to investigate subsequent cellular and molecular events. Once recovered from surgery, animals that have received a forebrain stab injury can survive for prolonged periods without the need for specialized care and can be returned to the colony for acute, intermediate, or chronic studies. Though less clinically translatable than FPI or CCI models of TBI, a forebrain lesion produced by a stab injury serves as a simple yet useful experimental model to investigate basic biological mechanisms underlying reactive gliosis and other neuropathological events following trauma to the CNS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereotax</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>726049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed micro drill</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>724950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stainless steel scalpel blade, #11</td>
			<td>MedVet</td>
			<td>JOR581S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/45 angled forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam sponge 12cmx7mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9841478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies and other reagents</td>
			<td>Manufacturer</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Dilution (brightfield) 
			Dilution (fluorescence)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rb anti-GFAP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>&#160;Z033429-2</td>
			<td>1:20k 
			1:1k</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shp anti-BrdU</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1893</td>
			<td>1:2k 
			1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-rabbit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-1000&#160;</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated rabbit anti-sheep</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-6000</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexafluor 488 goat anti-rabbit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexafluor 568 donkey anti-sheep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21099</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3571</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

triggering reactive gliosis in vivo by a forebrain stab injury

Following injury to the CNS, astrocytes undergo a broad range of biochemical, morphological, and molecular changes collectively referred to as reactive astrogliosis. Reactive astrocytes exert both inflammatory and protective effects that inhibit and promote, respectively, neural repair. The mechanisms underlying the diverse functional properties of reactive astrogliosis are not well understood. Achieving a greater understanding of these mechanisms is critical to developing therapeutic strategies to treat the injured CNS. Here we demonstrate a method to trigger reactive astrogliosis in the adult mouse forebrain using a forebrain stab lesion. This lesion model is simple, reliable, and requires only a stereotaxic device and a scalpel blade to produce the injury. The use of stab lesions as an injury model in the forebrain is well established and amenable to studies addressing a broad range of neuropathological outcomes, such as neuronal degeneration, neuroinflammation, and disruptions in the blood brain barrier (BBB). Thus, the forebrain stab injury model serves as a powerful tool that can be applied for a broad range of studies on the CNS response to trauma.

Porque os animais submetidos a esse procedimento não requerem períodos de sobrevivência especializados cuidados pós-operatórios, curtos ou de tempo de longo prazo são facilmente incorporados no estudo, dependendo da necessidade de investigar patologia aguda ou crônica após a lesão. Principais recursos de gliose reativa, como regulação alta de GFAP e hipertrofia de soma, pode ser observado logo em 2-3 dias após a lesão. A fase de pico da proliferação de astrócitos reativos é durante os dias 3-5 após les...

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Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

This article describes a detailed protocol to produce a forebrain stab injury in adult mice. The stab injury induces severe reactive gliosis and glial scar formation which can be subsequently examined by standard immunohistochemistry methods.

Disparo Reactive Gliose<em&gt; In Vivo</em&gt; Por um Stab Lesão Encéfalo anterior

Following injury to the CNS, astrocytes undergo a broad range of biochemical, morphological, and molecular changes collectively referred to as reactive ...

triggering-reactive-gliosis-in-vivo-by-a-forebrain-stab-injury

Research

JoVE Journal

Medicine

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

10.4K visualizações.  Drexel University. This article describes a detailed protocol to produce a forebrain stab injury in adult mice. The stab injury induces severe reactive gliosis and glial scar formation which can be subsequently examined by standard immunohistochemistry methods. 