O fertilizante Produtos especializados Company (SFP) é reconhecida por fornecer os fundos necessários para este estudo.

1. Amostras Preparar <ol><li> Prepare a 2 ml de solução de enzima, e de 0,5 ml de solução de substrato para cada ensaio experimental. Dilui-se as soluções de concentrados de enzima e substrato em soluções tampão com composição idêntica para minimizar o calor de diluição e mistura, durante a adição do substrato. <ol><li> Escolha das condições de buffer que forem adequadas para evitar alteração do pH durante o experimento. Por exemplo, HEPES 20 mM, pH 7, é adequada para medições em pH neutro. NOTA: Se troca de prótons está envolvido, entalpias de protonação dos buffers usados ​​devem ser considerados, porque eles afetam o AH medida da reação. Possíveis efeitos específicos do tampão ou moléculas de aditivos no sistema em análise devem ser tidos em conta. Se os solventes orgânicos (por exemplo, DMSO) são incluídos na solução de enzima, adicionar-lhes exactamente a mesma concentração em solução de substrato. </li><li> Para o experimento M1, iniciarcom a concentração de enzima na gama de nM (por exemplo, 1 nM) e com uma concentração de substrato, pelo menos, três ordens de grandeza maior do que a concentração de enzima e, acima de K M. </li><li> Para o experimento M2, comece com concentração de enzima na faixa de pM-NM (por exemplo, 15 horas). A concentração do substrato na seringa está no intervalo mM (por exemplo, 400 mM). NOTA: Na única injeção M1 experimento, as concentrações devem ser suficientes para alcançar a conversão total do substrato no produto ao longo do tempo experimental. Portanto, a concentração da enzima depende da taxa de enzima: se enzimas com baixo kcat estão em estudo, a concentração de enzima mais altas (até 10 uM) deve ser usado. Por outro lado, as concentrações de enzimas utilizadas na experiência M2 deve assegurar que o substrato é injectado apenas marginalmente (menos do que 5%) consumido e que a reacção enzimática prossegue no estado estacionário. Por esta razão, maior é oa eficiência da enzima, menor a concentração de enzima necessária. No final da experiência, a concentração do substrato na célula de amostra deve ser maior do que o K H. </li></ol></li><li> Verifique cuidadosamente enzima e concentrações de substrato com um procedimento analítico apropriado (por exemplo, a absorvância a 280 nm, colorimétricos, ensaios BCA 11. Isso é necessário para obter o cálculo preciso e fiável dos parâmetros termodinâmicos e cinéticos. </li><li> Medir o pH das soluções e verificar que o desfasamento de ambos a enzima e as soluções de substrato pH é mínima sob as condições experimentais (± 0,05 unidades de pH). </li></ol> 2. Realização do experimento NOTA: O mesmo procedimento deve ser aplicado tanto para a M1 e M2 do experimento, os quais são realizados um após o outro. <ol><li> Verificar que a célula de amostra e a seringa de injecção são limpas de acordo com o fabricanteinstruções. Encher a seringa de carregamento fornecida com o aparelho com água destilada, inserir a agulha suavemente na célula de amostra, encher a célula e remover o líquido, usando a mesma seringa. Usando este método, lava-se a célula de amostra, duas vezes com água destilada e duas vezes com o tampão. </li><li> Coloque a célula de amostra com 2 ml de solução de enzima usando a seringa de carga, evitando cuidadosamente a formação de bolhas de ar. Injectar-se lentamente a solução para dentro da célula, até que derrama a parte superior da haste da célula. Produzir um surto de ca. De 0,25 ml de solução para dentro da célula. Repita duas vezes. Essa etapa remove bolhas de ar presas na célula de amostra. </li><li> Coloque a agulha da seringa de carga na borda entre a haste da célula e a porta de célula e remover qualquer solução em excesso. </li><li> Inicie o programa de VP-Viewer e, a partir da interface de computador, equilibrar o instrumento ITC a uma temperatura de 3 ° C abaixo da temperatura experimental desejado. Isso é necessário para evitar longas equilíbrioperíodos antes do experimento, devido ao dispositivo de resfriamento instrumental passiva. </li><li> Encher a célula de referência com água destilada, com o mesmo procedimento acima. Quando tampões com elevada força iónica ou alta osmolaridade são na solução da amostra, o mesmo tampão deve ser usada como solução de referência. </li><li> Ligação de uma seringa de plástico para a abertura de enchimento da seringa de injecção, utilizando um tubo de silicone fino. Encha a seringa de injeção colocando a ponta da agulha em água e elaboração, até que a água sai da porta de enchimento superior, indicando que a seringa está cheia. Em seguida, passar a ponta da seringa da água e elaborar o ar, para esvaziar a seringa de injeção. Com este procedimento, lavar a seringa de injecção com um tampão, e extrair o ar através do sistema. Posteriormente, coloca a agulha de injecção em um tubo estreito que contém 0,5 ml de solução de substrato, cuidadosamente elaborar e encher completamente a seringa de injecção, deixando pequena quantidade de solução no fundo do tubo. </li><li> Dointerface do computador, pressione &quot;Fechar preenchimento porta&quot;. Remover o tubo de carga de silício. Pressione &quot;Purge e reabastecer&quot; para permitir que a seringa para retirar as bolhas de ar e expulsá-los de volta para a solução a granel. Repita duas vezes. </li><li> Mova a seringa de injeção, limpe nas laterais para remover todas as gotas e coloque a agulha da seringa de injeção na célula de amostra. </li><li> No computador, defina os parâmetros de funcionamento apropriadas. A enzima experimental e concentrações de substrato pode ser indicado. <ol><li> No experimento M1, definida, pelo menos, duas adições (5-30 ul) de substrato para verificar a reprodutibilidade. Ajustar o tempo de espaçamento entre cada injecção (por exemplo, 1000 seg) suficientemente grande para assegurar que os sinais de calor retorna à linha de base antes da adição seguinte. </li><li> No experimento M2, definir múltiplas (por exemplo, 15 x 5-10 ul) injeções. Defina o intervalo entre as injeções (por exemplo, 180 seg), permitindo que o sistema stabilize a energia térmica para a nova linha de base após cada injecção. NOTA: O tempo de espaçamento entre as injecções no experimento M2 deve ser curto o suficiente para evitar a conversão de uma quantidade significativa de substrato, permitindo que as medições para ser realizada sob condições de estado estacionário. </li><li> No experimento M2, utilizar pequenos volumes (por exemplo, 2 ul) para a primeira injecção, cujo valor correspondente é descartado durante a análise de dados subsequente. Com efeito, muitas vezes apresenta artefactos devido à difusão inicial de substrato por meio da ponta da seringa, e para a presença de bolhas de ar aprisionadas no interior da agulha de uma seringa. </li><li> Definir a potência de referência, o nível aproximado em que a linha de base será colocada antes da reacção começar, a um valor de 20. Em seguida, defina a enzima experimental e as concentrações de substrato e escolheu um nome para o experimento. </li><li> Definir a temperatura experimental, tipicamente a 25 ° C. ITC permite temperaturas de trabalho entre 2<html> ° C e 80 ° C. O experimento está pronto para correr. Pressione o botão &quot;Start&quot; para iniciar o experimento. </li></ol></li><li> Uma vez que a experiência terminou, limpar a célula de amostra e a seringa de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Repetir o ensaio pelo menos uma ou duas vezes para verificar a reprodutibilidade dos dados. </li></ol> 3. Análise de Dados <ol><li> A partir do programa de análise, clique no botão &quot;Ler dados&quot;, e navegue até a pasta onde o arquivo. Itc do experimento M2 realizada está localizado. Clique na seta de rolagem para baixo do &quot;Arquivos do tipo&quot; e selecione &quot;ensaio enzimático (é?)&quot;. Posteriormente, clique e abrir o arquivo. Itc do experimento M2. </li><li> Obter o AH da reacção de integração da curva do experimento M1 de acordo com a Equação 5. &quot;Width =&quot; 126 &quot;/&gt; (5) <ol><li> Clique no botão &quot;Ler dados&quot;, e selecione o arquivo. Itc do experimento M1 realizada. Usando Origin, divida o traço em diferentes partes contendo um pico cada e salvar cada pico como um arquivo opj.. Abra o ficheiro correspondente ao primeiro pico, resultante do desvio da linha de base no termograma de uma única injecção M1 experimento, integrar e dividir o valor da área obtido, expresso em μcal, pela concentração final do substrato na célula da amostra, expressa em ^ M, e por o volume da célula expressa em litros, a determinação, de acordo com a Equação 5, o AH da reacção. </li><li> Repetir o mesmo procedimento para o segundo pico da experiência M1 e obter um valor médio para as duas medições ÔH. </li></ol></li><li> Determinar dQ / dt a partir do experimento M2 medindo a diferença entre a linha de base original e a nova linha de base a seguir a cada injecção. Converta o eXperimental dados para as taxas de reacção de acordo com a equação 4, utilizando o valor de entalpia obtido na experiência M1 e ajustar os dados à equação de Michaelis-Menten. <ol><li> A partir do programa de análise, clique no botão &quot;Ler dados&quot;, e selecione o arquivo. Itc do experimento M2 realizada. Clique na seta de rolagem para baixo do &quot;Arquivos do tipo&quot; e selecione &quot;ensaio enzimático (é?)&quot;. </li><li> A caixa de diálogo Enzyme Assay abre, permitindo selecionar um dos quatro modelos. Selecione &quot;Método 2 - só Substrato&quot; da janela. </li><li> Na janela de AH, indicam o valor de AH obtidos no passo 4.2. </li><li> Clique no botão &quot;Concentração&quot; para verificar os valores da concentração a ser utilizada no procedimento de ajuste. Clique no botão &quot;Tempo médio (P)&quot;. A caixa de diálogo é aberta dando a oportunidade de mudar ou aceitar o valor padrão. Este valor representa o tempo antes de cada injectarion em que as médias de instrumentos do sinal de potência para determinar o nível de energia em cada concentração de substrato. Clique em OK para confirmar o valor padrão. </li><li> Clique no botão &quot;Zero Eixo Y&quot;. O cursor se transforma em uma cruz permitindo dobrar clique em um ponto, para colocar em y = 0. Dê um duplo clique apenas antes do primeiro ponto de injeção. </li><li> Clique no botão Calcular Taxa. A tarifa é representada graficamente em função da concentração de substrato, obtido pela divisão do substrato adicionado durante a titulação para o volume da célula de amostra (tendo em conta os efeitos de diluição). Esta operação dá uma curva típica de Michaelis-Menten, que pode ser montada para se obter o K e M k cat. </li><li> Se alguns pontos devem ser excluídos, selecione o botão &quot;Dados truncar&quot;. Mova os marcadores de dados para excluir os pontos de dados ruins e dê um duplo clique em um dos marcadores ou pressione Enter. </li><li> Use a função &quot;Fit para modelar&quot; para ajustar a curva eobter as constantes cinéticas. </li></ol></li></ol>

<ol>
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Os autores não têm nada a revelar.

Significado do ITC para estudar a atividade enzimática em relação a métodos existentes Para além das suas aplicações clássicas para estudar equilíbrio de ligação, calorimetria de titulação isotérmica oferece um método rápido e confiável para caracterizar as reacções enzimáticas em solução usando o calor de reacção como uma sonda, sem a necessidade de modificação do sistema ou rotulagem. Os parâmetros cinéticos de k cat e K ...

A determinação quantitativa de reações bioquímicas fornece insights sobre os processos biológicos a base da vida. Calorimetria oferece uma metodologia livre de etiqueta para caracterizar quantitativamente praticamente todas as reações químicas em solução. Esta técnica mede o calor libertado ou absorvido ao longo do tempo, e é, portanto, um sistema de detecção universal e uma metodologia muito conveniente para quantificar a quantidade de moléculas de reacção de ligação (ou seja, a termodinâmica), bem como para medir a velocidade da reacção (isto é, a cinética). Em particular, calorimetria de titulação isotérmica (ITC) foi adotado como método de escolha para caracterizar a termodinâmica dos equilíbrios biomoleculares, envolvendo proteína-ligante, proteína-proteína, proteína-íons metálicos e interações DNA-proteína 1-6. Além disso, a capacidade de ITC para fornecer informação cinética faz com que seja um sistema poderoso para medir a catálise da enzima, embora o potencial desta aplicação é aindasubestimado 7-9. A equação de Michaelis-Menten de 10 é uma descrição quantitativa das reacções enzimáticas, uma vez que proporciona uma relação entre a velocidade de reacção e a concentração do substrato, dependendo de dois parâmetros cinéticos: a constante de Michaelis (K M) e a constante de velocidade catalítica (kcat) . O kcat / K M é referida como a eficiência catalítica de uma enzima. Na prática, a determinação de K M e K cat para uma reacção específica proporciona uma descrição completa da catálise. Numa reacção típica enzimática (Figura 1), um substrato (S) interage com a enzima (E), formando o complexo enzima-substrato (ES), que é subsequentemente activado no estado de transição (ES *). O último é convertido no complexo enzima-produto (PE) que, eventualmente, se dissocia. Estes passos são descritos através da reacção seguinte. <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq1.jpg" width="197" /> (1) onde k é uma constante de velocidade para a formação do complexo ES, k -1 é a constante de velocidade da dissociação do complexo ES, enquanto kcat é a constante de velocidade catalítica ou número de turnover. De acordo com a equação de Michaelis-Menten de 10, a taxa da reacção pode ser calculado como: <img fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq2.jpg" width="144" /> (2) em que M = K (k-1 + k cat) / k 1 e k cat = Vmax / [E], com v max sendo a velocidade máxima atingida quando todos enzima é ligada ao substrato. O calorímetro de titulação isotérmica é o instrumento utilizado neste estudo para caracterizar a hidrólise enzimática de ureia. Este instrumento é feito de um escudo adiabático contendo duas pilhas em forma de cunhadas (Figura 1). Estas estão ligadas ao lado de fora, com tubos de acesso estreitas. A célula da amostra (cerca de 1,4 ml) é carregado com a solução de enzima, enquanto que a célula de referência é geralmente cheia com água ou com o solvente usado para a análise. Uma seringa de rotação com uma agulha comprida e uma pá de agitação ligado, geralmente contendo ca. 0,3 ml de solução de substrato, é montada na célula de amostra. Um dispositivo termoeléctrico mede a diferença de temperatura entre a amostra e a célula de referência e, usando uma &quot;rede de realimentação da célula&quot;, que mantém esta diferença a zero pela adição ou subtracção de calor. Durante o ensaio, o substrato é injectado na solução de enzima a uma temperatura escolhida constante. Quando o enzymatic reacção tem lugar, a quantidade de calor libertada ou absorvida é proporcional ao número de moléculas de substrato que são convertidos em moléculas do produto. Além disso, a taxa de fluxo de calor está directamente relacionada com a velocidade da reacção. Os dados medidos, aparecendo como um desvio de calor a partir do traçado da linha de base inicial (Figura 1), representam a energia térmica (μcal / seg) fornecido pelo aparelho para a célula de amostra, que é proporcional ao fluxo de calor que ocorre na célula de amostra ao longo do tempo. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51487/51487fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Representação esquemática do calorímetro de titulação isotérmica para estudar as reacções enzimáticas. Uma reacção enzimática que ocorre na titulação do substrato (na seringa de injecção), para a solução de enzima (na célula de amostra) resulta em uma mudança da terapmal poder liberado pelo calorímetro, necessário para manter a diferença de temperatura entre a célula de amostra e a constante da célula de referência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51487/51487fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> Em geral, a troca de calor (Q) é proporcional à entalpia molar da reacção (AH) e o número de moles de produto gerado (n), que por sua vez é determinado pelos tempos totais de volume da concentração: <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq3.jpg" width="200" /> (3) A formação do produto ao longo do tempo (dP / dt), o que corresponde à velocidade da reacção, pode, assim, ser relacionado com a quantidade de calor gerado durante o mesmo tempo (dQ / dt), através da relação: <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq4.jpg" width="150" /> (4) De acordo com esta equação, a fim de se obter um lote de Michaelis-Menten, é necessário medir i) o total AH entalpia molar, e ii) o fluxo de calor dQ / dt, em diferentes concentrações de substrato. Geralmente, isto é realizado em duas experiências diferentes: na primeira experiência (Método 1, M1), o substrato é injectado na solução de enzima e do calor para a conversão completa do substrato é medida; na segunda experiência (Método 2, M2), injecções múltiplas de substrato são realizados e a taxa de produção de calor é medido em diferentes concentrações de substrato. Estes dois conjuntos de dados são suficientes para derivar os parâmetros cinéticos K M e k cat. No presente artigo, um protocolo geral para determinar os parâmetros cinéticos de reações enzimáticas realizadas utilizando ITC é descrito. O método foi aplicado a hidrólise da uréia por Canavalia ensiformis uréiase, como um sistema de referência. A boa concordância entre os resultados obtidos através deste método e os dados relatados na literatura demonstra a confiabilidade desta abordagem.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="796">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">HEPES</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td style="width:323px;">dissolving in water and adjusting pH with NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">TRIZMA-Base</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td>dissolving in water and adjusting pH with HCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:111px;">Riedel-de-Haen</td>
			<td style="width:119px;">4270</td>
			<td>dissolving in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:111px;">Riedel-de-Haen</td>
			<td style="width:119px;">30427</td>
			<td>dissolving in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Urea</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">U4128</td>
			<td>dissolving in water at 40 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">Canavalia ensiformis urease (type C-3)</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">U0251</td>
			<td>dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">VP-ITC on Origin 7.0</td>
			<td style="width:111px;">MicroCal (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;">SYS13901</td>
			<td>instrument&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0</td>
			<td style="width:111px;">MicroCal (GE Healthcare)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>data acquisition software supplied with the instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hot biological catalysis: isothermal titration calorimetry to characterize enzymatic reactions

Calorimetria de titulação isotérmica (ITC) é uma técnica bem descrito que mede o calor liberado ou absorvido durante uma reação química, utilizando-o como uma sonda intrínseca para caracterizar praticamente todos os processos químicos. Hoje em dia, esta técnica é amplamente aplicada para determinar os parâmetros termodinâmicos de equilíbrio de ligação biomoleculares. Além disso, o ITC demonstrou ser capaz de medir directamente a cinética e os parâmetros termodinâmicos (cat K, K M, ÔH) de reacções enzimáticas, embora esta aplicação é ainda pouco explorados. Como as mudanças de calor ocorrer espontaneamente durante a catálise enzimática, a ITC não exige qualquer modificação ou rotulagem do sistema sob análise e pode ser realizada em solução. Além disso, o método tem pouca quantidade de material. Estas propriedades fazem com que uma ferramenta de valor inestimável ITC, poderosa e única para o estudo da cinética de enzimas em várias aplicações, tais como, por exemplo, a descoberta de medicamentos. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Neste trabalho um método baseado em ITC experimental para quantificar a cinética e termodinâmica das reações enzimáticas é minuciosamente descrito. Este método é aplicado para determinar k cat e K M da hidrólise enzimática de uréia por Canavalia ensiformis (feijão de porco) urease. Cálculo da entalpia molar intrínseca (AH int) a reacção é realizada. Os valores assim obtidos são consistentes com os dados anteriores descritos na literatura, o que demonstra a fiabilidade do método.

A urease (EC 3.5.1.5; ureia amidohidrolase) é uma enzima que contém níquel multisubunit encontrado em Archea, bactérias, plantas e eucariotas unicelulares. Esta proteína actua no último passo da mineralização do azoto orgânico, que catalisam a hidrólise de ureia em amónia e carbamato, o qual se decompõe espontaneamente para dar uma segunda molécula de amoníaco e bicarbonato (Equação 6) 12. <img fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51487/514...

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Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions

Isotérmico medidas de calorimetria de titulação fluxo de calor liberado ou absorvido nas reações químicas. Este método pode ser usado para quantificar a enzima-catálise. Neste trabalho, o protocolo para a instalação instrumental, experiência em execução e análise de dados é geralmente descrito, e aplicada à caracterização de hidrólise enzimática de uréia por jack urease do feijão.

Hot Catálise Biológica: Calorimetria isotérmica de titulação para caracterizar reações enzimáticas

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as ...

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20.4K visualizações.  University of Bologna.  Isotérmico medidas de calorimetria de titulação fluxo de calor liberado ou absorvido nas reações químicas. Este método pode ser usado para quantificar a enzima-catálise. Neste trabalho, o protocolo para a instalação instrumental, experiência em execução e análise de dados é geralmente descrito, e aplicada à caracterização de hidrólise enzimática de uréia por jack urease do feijão. 

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Preparation of Silica Nanoparticles Through Microwave-assisted Acid-catalysis

Microwave-assisted synthetic techniques were used to quickly and reproducibly produce silica nanoparticle sols using an acid catalyst with nanoparticle diameters ranging from 30-250 nm by varying the reaction conditions. Through the selection of a microwave compatible solvent, silicic acid precursor, catalyst, and microwave irradiation time, these microwave-assisted methods were capable of overcoming the previously reported shortcomings associated with synthesis of silica nanoparticles using microwave reactors. The siloxane precursor was hydrolyzed using the acid catalyst, HCl. Acetone, a low-tan &#948; solvent, mediates the condensation reactions and has minimal interaction with the electromagnetic field. Condensation reactions begin when the silicic acid precursor couples with the microwave radiation, leading to silica nanoparticle sol formation. The silica nanoparticles were characterized by dynamic light scattering data and scanning electron microscopy, which show the materials&#39; morphology and size to be dependent on the reaction conditions. Microwave-assisted reactions produce silica nanoparticles with roughened textured surfaces that are atypical for silica sols produced by St&#246;ber&#39;s methods, which have smooth surfaces.

Silica nanoparticles were prepared using acid-catalysis of a siloxane precursor and microwave-assisted synthetic techniques resulting in the controlled growth of nanomaterials ranging from 30-250 nm in diameter. The growth dynamics can be controlled by varying the initial silicic acid concentration, time of the reaction, and temperature of reaction.

Microwave-assisted synthetic techniques were used to quickly and reproducibly produce silica nanoparticle sols using an acid catalyst with nanoparticle ...

Química

Retropinacol/Cross-pinacol Coupling Reactions - A Catalytic Access to 1,2-Unsymmetrical Diols

Unsymmetrical 1,2-diols are hardly accessible by reductive pinacol coupling processes. A successful execution of such a transformation is bound to a clear recognition and strict differentiation of two similar carbonyl compounds (aldehydes &#8594; secondary 1,2-diols or ketones &#8594; tertiary 1,2-diols). This fine-tuning is still a challenge and an unsolved problem for an organic chemist. There exist several reports on successful execution of this transformation but they cannot be generalized. Herein we describe a catalytic direct pinacol coupling process which proceeds via a retropinacol/cross-pinacol coupling sequence. Thus, unsymmetrical substituted 1,2-diols can be accessed with almost quantitative yields by means of an&#160;operationally simple performance under very mild conditions. Artificial techniques, such as syringe-pump techniques or delayed additions of reactants are not necessary. The procedure we describe provides a very rapid access to cross-pinacol products (1,2-diols, vicinal diols). A further extension of this new process, e.g. an enantioselective performance could provide a very useful tool for the synthesis of unsymmetrical chiral 1,2-diols.

A novel account for the synthesis of unsymmetrical 1,2-diols based on a retropinacol/cross-pinacol coupling mechanism is described. Due to the catalytic execution of this reaction a considerable improvement compared to conventional cross-pinacol couplings is achieved.

Retropinacol / Cross-pinacol reações de acoplamento - A Acesso Catalítica para 1,2-assimétricos Dióis

Unsymmetrical 1,2-diols are hardly accessible by reductive pinacol coupling processes. A successful execution of such a transformation is bound to a clear ...

Mizoroki-Heck Cross-coupling Reactions Catalyzed by Dichloro{bis[1,1',1''-(phosphinetriyl)tripiperidine]}palladium Under Mild Reaction Conditions

Dichloro-bis(aminophosphine) complexes of palladium with the general formula of [(P{(NC5H10)3-n(C6H11)n})2Pd(Cl)2] (where n = 0-2), belong to a new family of easy accessible, very cheap, and air stable, but highly active and universally applicable C-C cross-coupling catalysts with an excellent functional group tolerance. Dichloro{bis[1,1',1''-(phosphinetriyl)tripiperidine]}palladium [(P(NC5H10)3)2Pd(Cl)2] (1), the least stable complex within this series towards protons; e.g. in the form of water, allows an eased nanoparticle formation and hence, proved to be the most active Heck catalyst within this series at 100 &#176;C and is a very rare example of an effective and versatile catalyst system that efficiently operates under mild reaction conditions. Rapid and complete catalyst degradation under work-up conditions into phosphonates, piperidinium salts and other, palladium-containing decomposition products assure an easy separation of the coupling products from catalyst and ligands. The facile, cheap, and rapid synthesis of 1,1',1"-(phosphinetriyl)tripiperidine and 1 respectively, the simple and convenient use as well as its excellent catalytic performance in the Heck reaction at 100 &#176;C make 1 to one of the most attractive and greenest Heck catalysts available.
We provide here the visualized protocols for the ligand and catalyst syntheses as well as the reaction protocol for Heck reactions performed at 10 mmol scale at 100 &#176;C and show that this catalyst is suitable for its use in organic syntheses.

Mizoroki-Heck Cross-coupling Reactions Catalyzed by Dichloro{bis[1,1&#039;,1&#039;&#039;-phosphinetriyltripiperidine]}palladium Under Mild Reaction Conditions

Dichloro{bis[1,1',1''-(phosphinetriyl)tripiperidine]}palladium [(P(NC5H10)3)2Pd(Cl)2] (1) is an easy accessible, cheap, and air stable, but highly active Heck catalyst with an excellent functional group tolerance that efficiently operates under mild reaction conditions to give the coupling products in very high yields.

Mizoroki-Heck Reações de acoplamento cruzado catalisado por Dicloro {bis [1,1 &#39;, 1&#39;&#39; - (phosphinetriyl) tripiperidine]} paládio sob condições de reação leves

Dichloro-bis(aminophosphine) complexes of palladium with the general formula of [(P{(NC5H10)3-n(C6H11)n})2Pd(Cl)2] (where n = 0-2), belong to a new family ...

Light-driven Enzymatic Decarboxylation

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. Recycling of the electron donors NADH or NADPH requires the use of additional enzymes and sacrificial substrates. Interestingly, several oxidoreductases accept hydrogen peroxide as electron donor. While being inexpensive, this reagent often reduces the stability of enzymes. A solution to this problem is the in situ generation of the cofactor. The continuous supply of the cofactor at low concentration drives the reaction without impairing enzyme stability. This paper demonstrates a method for the light-catalyzed in situ generation of hydrogen peroxide with the example of the heme-dependent fatty acid decarboxylase OleTJE. The fatty acid decarboxylase OleTJE was discovered due to its unique ability to produce long-chain 1-alkenes from fatty acids, a hitherto unknown enzymatic reaction. 1-alkenes are widely used additives for plasticizers and lubricants. OleTJE has been shown to accept electrons from hydrogen peroxide for the oxidative decarboxylation. While addition of hydrogen peroxide damages the enzyme and results in low yields, in situ generation of the cofactor circumvents this problem. The photobiocatalytic system shows clear advantages regarding enzyme activity and yield, resulting in a simple and efficient system for fatty acid decarboxylation.

We describe a protocol for the light-catalyzed generation of hydrogen peroxide &#8212; a cofactor for oxidative transformations.

Claro conduzido enzimática descarboxilação

Oxidoreductases belong to the most-applied industrial enzymes. Nevertheless, they need external electrons whose supply is often costly and challenging. ...

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of metabolic transformations. Hyperpolarization via dissolution DNP circumvents part of the sensitivity issues thanks to the large out-of-equilibrium nuclear magnetization stemming from the electron-to-nucleus spin polarization transfer. The high NMR signal obtained can be used to monitor chemical reactions in real time. The downside of hyperpolarized NMR resides in the limited time window available for signal acquisition, which is usually on the order of the nuclear spin longitudinal relaxation time constant, T1, or, in favorable cases, on the order of the relaxation time constant associated with the singlet-state of coupled nuclei, TLLS. Cellular uptake of endogenous molecules and metabolic rates can provide essential information on tumor development and drug response. Numerous previous hyperpolarized NMR studies have demonstrated the relevancy of pyruvate as a metabolic substrate for monitoring enzymatic activity in vivo. This work provides a detailed description of the experimental setup and methods required for the study of enzymatic reactions, in particular the pyruvate-to-lactate conversion rate in presence of lactate dehydrogenase (LDH), by hyperpolarized NMR.

The sensitivity enhancement provided by dissolution dynamic nuclear polarization (DNP) enables following metabolic processes in real time by NMR and MRI. The characteristics and performances of a dedicated dissolution DNP setup designed for study enzymatic reactions are discussed.

Dissolução dinâmico Nuclear Polarização Instrumentação para em tempo real enzimática Reaction Taxa de Medições por RMN

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

A Protocol for Safe Lithiation Reactions Using Organolithium Reagents

Organolithium reagents are powerful tools in the synthetic chemist&#39;s toolbox. However, the extreme pyrophoric nature of the most reactive reagents warrants proper technique, thorough training, and proper personal protective equipment. To aid in the training of researchers using organolithium reagents, a thorough, step-by-step protocol for the safe and effective use of tert-butyllithium on an inert gas line or within a glovebox is described. As a model reaction, preparation of lithium tert-butyl amide by the reaction of tert-butyl amine with one equivalent of tert-butyl lithium is presented.

The safe and proper use of organolithium reagents is described.

Um protocolo para reações seguras litiação Usando organolï¿½io Reagentes

Organolithium reagents are powerful tools in the synthetic chemist&#39;s toolbox. However, the extreme pyrophoric nature of the most reactive reagents ...

Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. Their synthesis by conventional organic chemistry often requires tedious multi-step synthesis processes, with difficult control of the stereochemical outcome. We present a protocol to enzymatically synthetize amino alcohols starting from the readily available L-lysine in 48 h. This protocol combines two chemical reactions that are very difficult to conduct by conventional organic synthesis. In the first step, the regio- and diastereoselective oxidation of an unactivated C-H bond of the lysine side-chain is catalyzed by a dioxygenase; a second regio- and diastereoselective oxidation catalyzed by a regiodivergent dioxygenase can lead to the formation of the 1,2-diols. In the last step, the carboxylic group of the alpha amino acid is cleaved by a pyridoxal-phosphate (PLP) decarboxylase (DC). This decarboxylative step only affects the alpha carbon of the amino acid, retaining the hydroxy-substituted stereogenic center in a beta/gamma position. The resulting amino alcohols are therefore optically enriched. The protocol was successfully applied to the semipreparative-scale synthesis of four amino alcohols. Monitoring of the reactions was conducted by high performance liquid chromatography (HPLC) after derivatization by 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene. Straightforward purification by solid-phase extraction (SPE) afforded the amino alcohols with excellent yields (93% to &#62;95%).

Chiral amino alcohols are versatile molecules for use as scaffolds in organic synthesis. Starting from L-lysine, we synthesize amino alcohols by an enzymatic cascade reaction combining diastereoselective C-H oxidation catalyzed by dioxygenase followed by cleavage of the carboxylic acid moiety of the corresponding hydroxyl amino acid by a decarboxylase.

Reações Enzimáticas em Cascata para a Síntese de Aminoálcoois Quirais a partir de L-lisina

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

Employing Pressurized Hot Water Extraction (PHWE) to Explore Natural Products Chemistry in the Undergraduate Laboratory

A recently developed pressurized hot water extraction (PHWE) method which utilizes an unmodified household espresso machine to facilitate natural products research has also found applications as an effective teaching tool. Specifically, this technique has been used to introduce second- and third-year undergraduates to aspects of natural products chemistry in the laboratory. In this report, two experiments are presented: the PHWE of eugenol and acetyleugenol from cloves and the PHWE of seselin and (+)-epoxysuberosin from the endemic Australian plant species Correa reflexa. By employing PHWE in these experiments, the crude clove extract, enriched in eugenol and acetyleugenol, was obtained in 4-9% w/w from cloves by second-year undergraduates and seselin and (+)-epoxysuberosin were isolated in yields of up to 1.1% w/w and 0.9% w/w from C. reflexa by third-year students. The former exercise was developed as a replacement for the traditional steam distillation experiment providing an introduction to extraction and separation techniques, while the latter activity featured guided-inquiry teaching methods in an effort to simulate natural products bioprospecting. This primarily derives from the rapid nature of this PHWE technique relative to traditional extraction methods that are often incompatible with the time constraints associated with undergraduate laboratory experiments. This rapid and practical PHWE method can be used to efficiently isolate various classes of organic molecules from a range of plant species. The complementary nature of this technique relative to more traditional methods has also been demonstrated previously.

Employing Pressurized Hot Water Extraction PHWE to Explore Natural Products Chemistry in the Undergraduate Laboratory

Here, we employ a pressurized hot water extraction (PHWE) method, which utilizes an unmodified household espresso machine to introduce undergraduates to natural products chemistry in the laboratory. Two experiments are presented: PHWE of eugenol and acetyleugenol from cloves and PHWE of seselin and (+)-epoxysuberosin from the Australian plant Correa reflexa.

Empregando a extração de água quente sob pressão (PHWE) para explorar a química de produtos naturais no laboratório de graduação

A recently developed pressurized hot water extraction (PHWE) method which utilizes an unmodified household espresso machine to facilitate natural products ...

Imine Metathesis by Silica-Supported Catalysts Using the Methodology of Surface Organometallic Chemistry

With this protocol, a well-defined singlesite silica-supported heterogeneous catalyst [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] is designed and prepared according to the methodology developed by surface organometallic chemistry (SOMC). In this framework, catalytic cycles can be determined by isolating crucial intermediates. All air-sensitive materials are handled under inert atmosphere (using gloveboxes or a Schlenk line) or high vacuum lines (HVLs, &#60;10-5 mbar). The preparation of SiO2-700 (silica dehydroxylated at 700 &#176;C) and subsequent applications (the grafting of complexes and catalytic runs) requires the use of HVLs and double-Schlenk techniques. Several well-known characterization methods are used, such as Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR), elemental microanalysis, solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy (SSNMR), and state-of-the-art dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy (DNP-SENS). FTIR and elemental microanalysis permit scientists to establish the grafting and its stoichiometry. 1H and 13C SSNMR allows the structural determination of the hydrocarbon ligands coordination sphere. DNP SENS is an emerging powerful technique in solid characterization for the detection of poorly sensitive nuclei (15N, in our case). SiO2-700 is treated with about one equivalent of the metal precursor compared to the amount of surface silanol (0.30 mmol&#183;g-1) in pentane at room temperature. Then, volatiles are removed, and the powder samples are dried under dynamic high vacuum to afford the desired materials [(&#8801;Si-O-)Hf(&#951;2&#960;-MeNCH2)(&#951;1-NMe2)(&#951;1-HNMe2)]. After a thermal treatment under high vacuum, the grafted complex is converted into metal imido silica complex [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)]. [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] effectively promotes the metathesis of imines, using the combination of two imine substrates, N-(4-phenylbenzylidene)benzylamine, or N-(4-fluorobenzylidene)-4-fluoroaniline, with N-benzylidenetert-butylamine as substrates. A significantly lower conversion is observed with the blank runs; thus, the presence of the imido group in [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] is correlated to the catalytic performance.

A new group IV metal catalyst for imine metathesis is prepared by grafting amine metal complex onto dehydroxylated silica. Surface metal fragments are characterized using FT-IR, elemental microanalysis, and solid-state NMR spectroscopy. Further dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy experiments complement the determination of the coordination sphere.

Metathesis de imine por catalisadores sílica-apoiados usando a metodologia da química organometálica de superfície

With this protocol, a well-defined singlesite silica-supported heterogeneous catalyst [(&#8801;Si-O-)Hf(=NMe)(&#951;1-NMe2)] is designed and prepared ...

A Microwave-Assisted Direct Heteroarylation of Ketones Using Transition Metal Catalysis

Heteroarylation introduces heteroaryl fragments to organic molecules. Despite the numerous available reactions reported for arylation via transition metal catalysis, the literature on direct heteroarylation is scarce. The presence of heteroatoms such as nitrogen, sulfur and oxygen often make heteroarylation a challenging research field due to catalyst poisoning, product decomposition and the rest. This protocol details a highly efficient direct &#945;-C(sp3) heteroarylation of ketones under microwave irradiation. Key factors for successful heteroarylation include the use of XPhos Palladacycle Gen. 4 Catalyst, excess base to suppress side reactions and the high temperature and pressure achieved in a sealed reaction vial under microwave irradiation. The heteroarylation compounds prepared by this method were fully characterized by proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H NMR), carbon nuclear magnetic resonance spectroscopy (13C NMR) and high-resolution mass spectrometry (HRMS). This methodology has several advantages over literature precedents including broad substrate scope, rapid reaction time, greener procedure and operational simplicity by eliminating the preparation of intermediates such as silyl enol ether. Possible applications for this protocol include, but are not limited to, diversity-oriented synthesis for the discovery of biologically active small molecules, domino synthesis for the preparation of natural products and ligand development for new transition metal catalytic systems.

Heteroaryl compounds are important molecules utilized in organic synthesis, medicinal and biological chemistry. A microwave-assisted heteroarylation using palladium catalysis provides a rapid and efficient method to attach heteroaryl moieties directly to ketone substrates.

Uma Heteroaryação Direta assistida por micro-ondas de cetonas usando catalisisa metálica de transição

Heteroarylation introduces heteroaryl fragments to organic molecules. Despite the numerous available reactions reported for arylation via transition metal ...