Este trabalho foi financiado pela NSF conceder MCB-0817827.

Calorimetria de titulação isotérmica (ITC) é uma técnica bem estabelecida que pode determinar todos os parâmetros termodinâmicos (afinidade, entalpia e estequiometria) de uma interação obrigatório em um experimento 1. ITC obras de titulação um reagente em um segundo reagente sob condições isotérmicas. O sinal medido é o calor liberado ou absorvido na interação (ligação) dos dois reagentes. Uma série de injeções são realizadas eo sinal de calor abordagem zero como o reagente limitante torna-se saturado. Ajuste da isoterma dá os parâmetros termodinâmicos. Várias revisões estão disponíveis que descrevem a instrumentação, bem como as contas de coleta de dados e análise. 2,3 calorímetros Enquanto outros estão disponíveis (mais notadamente o ITC 200 com pequenos volumes), aqui nós descrevemos um protocolo geral para a VP-ITC fabricados por MicroCal (agora parte da GE Healthcare). 1. Amostras preparar <ol><li> A fim de preparar a macromolécula e ligante no buffer, algumas possíveis questões precisam ser abordadas. Se encaixa rigorosos exigem concentrações adequadas da macromolécula, a espécie que normalmente entra na célula amostra do ITC, e ligante, as espécies na seringa de injeção. Porque algumas proteínas agregadas à alta concentração necessária para a espécie na seringa de injeção, na maioria das vezes a proteína é carregada para dentro da célula da amostra. A concentração macromolécula ideal é determinada a partir de &quot;c&quot;, o produto da afinidade previsto do sistema, que pode ser estimada utilizando métodos ortogonais antes de usar ITC, ea concentração macromolécula total, onde c = K a * [M]. Valores ótimos de gama c 1-10, 1 embora seja possível obter dados precisos para a fraca ligação de sistemas sob condições específicas experimental com c-valores abaixo do limite inferior. 4 Assim, a concentração deve ser determinada macromolécula com esta gama de c valores em mente (ou seja, para um K a de 10 6 M -1, as concentrações de macromolécula de 1-10 mM deve ser usado). Conhecimento prévio da afinidade de ligação do sistema pode ajudar a minimizar a proteína utilizada para ITC através de uma melhor concepção da experiência ITC. A concentração do ligante deve ser suficientemente grande (7-25 vezes mais concentrado do que o K d para o site mais fraca ligação do ligando), de modo que a saturação ocorre no primeiro terço a metade da titulação. Montagem precisa dos dados também requer a saturação do sinal. Para sistemas com maior afinidade de ligação, uma menor concentração de ligante deve ser usado para evitar a saturação muito cedo na titulação, o que dará se encaixa imprecisas. Uma vez que o calor de controle de diluição (ou seja, a titulação do ligante em buffer) foi subtraído da titulação, a entalpia de saturação deve ser quase nula. </li><li> Porque impurezas pequena molécula pode dar origem a sinais artifactual nas medições ITC, é melhor, se possível, que a macromolécula e ligante ser exaustivamente dialisadas contra tampão. Alternativamente, cromatografia de coluna, dessalinização colunas spin, ou filtros de buffer troca centrífuga (por exemplo, Centricons) pode ser usado para alterar o buffer da macromolécula. Se o ligante é uma molécula pequena, ela pode ser preparado usando o buffer de diálise após a macromolécula dialisada foi ou por diálise contra membranas de diálise com cortes adequados para pequenas moléculas (ou seja, 100-500 Da para um Spectra / Por Float-A-Lyzer ). Diferenças na composição de amortecedor entre o ligante e soluções macromolécula pode levar ao sinal de artefatos a partir do calor da diluição de impurezas nas amostras. Após o preparo, certifique-se o pH da partida macromolécula buffer, e ligante (± 0,05 unidades de pH) como artefatos na entalpia podem surgir devido ao buffer efeitos protonação. 5 Certifique-se de preparar o suficiente de cada espécie. Para experimentos triplicado e um controle de diluição, a quantidade de material necessário vai depender do ITC usado. Mas, para instrumentos mais ITC que têm aproximadamente 2 ml de células da amostra de volume, pelo menos 6-7 ml de solução de macromolécula serão necessários, e pode ser convenientemente preparadas em tubos de 15 ml falcão. Para 300 mL seringas de injeção, 1-2 ml de solução deve ser adequada, e pode ser preparado em tubos ou falcon ou tubos de microcentrífuga. </li><li> , Poeira e outras partículas, pode causar artefatos na linha de base do thermogram ITC. É imperativo que eles sejam removidos antes de executar o experimento. Após a preparação das soluções de reserva da amostra, as amostras devem ser centrifugadas em tubos de microcentrífuga por cinco minutos em 8000 para 14.000 RPM a partículas de pelotas na solução. Remover o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o pellet, e colocá-lo em um novo tubo falcon / microcentrífuga. Se redutores são necessários para manter cisteínas reduzidas, use baixas concentrações e estoques fresca de β-mercaptoethanol, TCEP (tris (2-carboxila) fosfina) ou ditiotreitol para minimizar qualquer tipo de artefato devido à oxidação redutor. Além disso, a presença de solventes orgânicos no tampão (comum para alguns ligantes pequena molécula que pode precisar de metanol ou DMSO, a fim de ser solúvel) pode causar artefatos de sinal. Se solventes orgânicos são necessários para o ligante, então a solução macromolécula também deve conter a mesma concentração para evitar qualquer sinal decorrentes do calor de diluição do solvente orgânico. Pequenas diferenças na composição de amortecedor entre o ligante e macromolécula devido à cosolventes, sais ou pH são possíveis durante a preparação das amostras. É melhor para verificar a diluição do ligante para o buffer de amostras ou o tampão de amostra para a macromolécula para garantir que os sinais de calor resultantes de diferenças no conteúdo de buffer não causar dados decorrentes exclusivamente de artefatos. </li><li> Verificar a concentração da macromolécula e ligante cuidadosamente usando técnicas adequadas ao seu sistema (como as medidas de absorbância, HPLC, ensaios colorimétricos, ensaios BCA para proteínas, etc) para gravar as suas concentrações exatas. Diferenças na concentração real ea concentração usada para se ajustar à isoterma irá causar erros no estequiometria, entalpia e afinidade de ligação determinado a partir da experiência. É comum degas as amostras para evitar artefatos de sinal devido a bolhas de ar ou a liberação de gases dissolvidos durante a titulação, especialmente em altas temperaturas. </li></ol> 2. Configurando o Experimento <ol><li> Verifique se a célula de amostra e uma seringa de injeção são limpos de acordo com o protocolo do fabricante antes de carregar o macromolécula e ligante. Lavar a célula de amostra duas ou três vezes com 1,8 ml de água destilada utilizando a seringa Hamilton (use o cuidado com a seringa de Hamilton como o barril é facilmente quebrada ou a inclinação da agulha). Em seguida enxaguar a célula de amostra várias vezes com 1,8 ml de tampão. Carregar a célula de amostra com 1,8 ml de solução de macromolécula, tomando cuidado para evitar formação de bolhas. </li><li> Preencher a célula de referência com água destilada. Para a maioria dos buffers, água destilada é bom para usar como a solução de referência. No entanto, para buffers com particularmente elevada força iônica ou osmolaridade, é melhor usar o buffer como uma referência. </li><li> Remover bolhas de ar a partir das células de referência e de exemplo usando a seringa Hamilton. Suavemente move a agulha da seringa para cima e para baixo os lados da célula batendo as bolhas que podem estar no fundo da célula e anexado ao poço para o topo da célula. Remova qualquer excesso de volume da amostra e células de referência. </li><li> Anexar uma seringa de plástico para o porto de preenchimento da seringa utilizando tubos. Enxágüe a seringa com água destilada. Siga por um buffer de enxaguar. Certifique-se a seringa de injeção é completamente evacuado por ar através do desenho do sistema. Coloque a agulha da seringa na solução ligante e desenhar a solução ligante com a seringa de injeção até que a seringa inteira está cheia. Continuar a desenhar um pequeno volume em excesso (aproximadamente 50 mL ou mais) à porta e tubos em anexo. Imediatamente fechar a porta de preenchimento de a seringa e retire a seringa tubo e plástico. Purge e reabastecer a seringa de injeção mais duas vezes para remover as bolhas da seringa. Retire a seringa com a solução ligante e limpe o lado com uma kimwipe para remover todas as gotas, tomando cuidado para não tocar a ponta da seringa na kimwipe, pois isso pode remover o volume da seringa. Além disso, tenha cuidado para não bater ou jar a seringa como este também pode causar perda de volume da ponta da seringa. Coloque a seringa dentro da célula da amostra. </li><li> Configurar os parâmetros para a execução do ITC. Para os sistemas de ligação com sinais de calor forte, um grande número de injeções de baixo volume vai dar mais pontos de dados para a montagem (por exemplo, 75 injeções de 3 mL). Para sistemas que têm sinais de calor fraco, um pequeno número de injeções de grande volume são preferíveis (por exemplo, 33 injeções de 8 mL). Mais comumente, menos injeções com maiores volumes de injeção são utilizados. Pode levar várias titulações para otimizar as condições que são melhores para seu sistema. É importante notar que a entalpia de ligação pode ser exotérmico ou endotérmico, dependendo do sistema que está sendo estudado. Infelizmente, alguns sistemas têm sinais de fogo baixo, fazendo com que o calor de reação difícil de determinar. Problemas com tais sistemas podem potencialmente ser superado pelo aumento da concentração da macromolécula, alterar a temperatura do experimento (dependendo da capacidade de calor do sistema de ligação), e / ou alterar o pH ou força iônica do buffer. </li><li> Considere também o espaçamento de tempo entre cada injeção. É imperativo que após cada injecção de ligante, o sistema é dado tempo para o equilíbrio e o sinal de calor retorna à linha de base antes da próxima injeção ocorre. Para a maioria dos sistemas, 3-5 minutos deve ser adequada. O tempo entre as injeções deve ser aumentada para sistemas onde o equilíbrio não ocorre em cinco minutos. </li><li> Porque haverá alguma mistura entre a macromolécula e soluções de ligante na seringa de injeção, uma vez que é inserido na célula de amostra, a primeira injecção dará resultados espúrios. É melhor usar pequenos volumes (eg 2 mL) para o primeiro ou duas injeções (para que eles possam mais tarde ser descartado) e manter as injeções subseqüentes os valores desejados. </li><li> Escolha a temperatura do experimento (com 25 ° C sendo o mais comum, embora as temperaturas entre 2 e 80 ° C pode ser usada). O melhor é escolher uma temperatura que corresponde outros experimentos (ligação, cinética, etc) realizadas no sistema ligante macromolécula. O ITC pode ser configurado para equilibrar a uma temperatura diferente da temperatura do experimento. Se a experiência vai ser realizada a uma temperatura superior a 10 ° C, longe de temperatura ambiente, então é melhor para definir a temperatura de equilíbrio para o instrumento no prazo de 5 ° C da temperatura experimental. Isto irá diminuir o tempo que o instrumento vai demorar para atingir a temperatura do experimento. A velocidade de agitação da seringa também precisa ser considerado. Agitação é necessária para a mistura adequada do ligante e macromoléculas durante a titulação, mas algumas proteínas são desestabilizadas por meio de agitadores rápidos. Para esses casos, a velocidade de agitação deve ser fixado em uma taxa relativamente baixa. Depois que todos os parâmetros experimentais foram criados, em seguida, o experimento pode ser iniciado. </li><li> Uma vez que o experimento tenha terminado, a ITC podem ser limpos de acordo com o protocolo do fabricante. A solução na célula de amostra no final do experimento pode ser mantida se experimentos adicionais sobre a mistura macromolécula-ligante complexos são desejados. </li><li> Repita a titulação, pelo menos, uma ou duas vezes mais para obter dados reprodutíveis. Executar um controle onde o ligante é titulada no buffer na célula de amostra para determinar o calor de diluição para o ligante. Para alguns sistemas onde há cooperativas de informação, de ligação adicionais sobre o processo de ligação pode ser obtida através da injeção da macromolécula no ligante. As orientações de injecção diferentes pode dar informações adicionais, que podem ser úteis para a montagem global. 6 </li></ol> 3. Analisando os dados <ol><li> Ajuste dos dados pode ser facilmente realizada utilizando macros em qualquer programa de ajuste de dados (normalmente fornecido pelo fabricante juntamente com o instrumento). Carregar o arquivo de dados em primeiro lugar. Verifique o termograma-prima para todos os sinais de bolhas de ar ou outros artefatos no sinal. Se houver qualquer tipo de artefato (como picos na linha de base ou picos, quando não havia injeção naquele ponto do tempo), em seguida, observe esses pontos dados como eles devem ser removidos. Em seguida, carregar o ligante dados de controle de diluição, e subtrair os dados ligante de diluição a partir da isoterma de ligação. Neste momento, remova todos os pontos de dados espúrios, incluindo o primeiro de um ou dois pontos de dados da titulação, onde artefatos de diluição ocorrer (consulte a etapa 7). </li><li> Selecione o modelo de dados apropriado (um sítio de ligação, dois / múltiplos sítios de ligação, ligação cooperativa, etc) a ser utilizado para ajustar os dados. Os dados podem ser inseridos com estimativas iniciais dos parâmetros de ajuste, estequiometria (n), entalpia (DH) e afinidade de ligação (K a). Se o conhecimento prévio da afinidade de ligação, ou outros parâmetros, é conhecida a partir de experimentos ortogonal, então estes valores podem ser inseridos. Isso ajuda a evitar o ajuste de ficar preso em mínimos locais durante a montagem. Depois que os dados estejam em boa forma para a primeira titulação, repita os passos 15 e 16 para o resto das isotermas. Alternativamente, os dados podem estar em forma globalmente usando programas como o SEDPHAT 6. SEDPHAT pode ser particularmente útil na montagem global de conjuntos de dados complexos binários (isto é, moléculas de A + B) em combinação com conjuntos de dados complexos ternários (moléculas de A + B + C). Por exemplo, na ligação da molécula de C a um complexo AB, nem sempre é claro se pode haver qualquer sinal devido à ligação de C para A ou de B para A (se A não é totalmente saturado). </li><li> Para garantir que os dados não são artifactual ITC, a afinidade de ligação e estequiometrias obtidas ITC deve ser comparado com um método ortogonal. 7,8 Além disso, o valor de entalpia ITC pode ser comparada com a entalpia a partir de uma trama van&#39;t Hoff 9. Também pode ser útil usar diferentes concentrações do ligante ou macromolécula como o valor absoluto do sinal de calor deve aumentar com o aumento da concentração de macromoléculas. Artefatos são mais susceptíveis de ocorrer se o buffers na célula e seringa não são correspondidos. Outra possibilidade para artefatos surge a partir de amostras impuras. </li><li> Recomendamos que o usuário começar com simples binário titulações complexo para o qual há informações anteriores disponíveis no K d e stoichiometry. Então, se ligantes adicionais de ligação, o usuário pode tentar titulações complexo ternário mais complicado, variando as concentrações de ligante, e talvez mudar a seringa e componentes celulares. A comparação das entalpias de ambos os caminhos para a formação de complexos ternários devem ser aditivo como entalpia é uma função de estado. 10 Novamente, SEDPHAT 6 é provável que seja muito útil aqui. </li></ol> 4. Resultados representativos: <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2796/2796fig1.jpg" /> Figura 1. Um exemplo representativo de uma titulação bem-comportado para a ligação do cofator NADPH para E. coli cromossômicas diidrofolato redutase (ecDHFR). Painel (A) mostra o termograma-primas; (B), a isoterma de ligação entre as pessoas aptas thermogram integrada utilizando o modelo de um local no software Origin, e (C) o ajuste da isoterma usando o modelo de um sítio de ligação a partir SEDPHAT junto com resíduos em forma. A partir do software Origin, utilizando o modelo de site de uma ligação, n = 1,09 ± 0,02, K d = 0,194 ± 0,001 mM, DH = -22,7 ± 0,4 kcal / mol, TΔS = -13,1 ± 0,4 kcal / mol, e ÄG = - 9,16 ± 0,01 kcal / mol. Acessos de dados usando Sedphat pagar um n de 0,94 ± 0,01, um K d de 0,195 ± 0,013 ΔM, a DH de -22,5 ± 0,2 kcal / mol, TΔS de -13,39 kcal / mol e ÄG de -9,15 kcal / mol.

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	<li>Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+measurement+of+binding+constants+and+heats+of+binding+using+a+new+titration+calorimeter.">Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter.</a> Anal. Biochem. 179, 131-137 (1989).</li><li>Jelesarov, I., Bosshard, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+and+differential+scanning+calorimetry+as+complementary+tools+to+investigate+the+energetics+of+biomolecular+recognition.">Isothermal titration calorimetry and differential scanning calorimetry as complementary tools to investigate the energetics of biomolecular recognition.</a> J. Mol. Recognit. 12, 3-18 (1999).</li><li>Velazquez-Campoy, A., Leavitt, S. A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+protein-protein+interactions+by+isothermal+titration+calorimetry.">Characterization of protein-protein interactions by isothermal titration calorimetry.</a> Methods Mol. Biol. 261, 35-54 (2004).</li><li>Turnbull, W. B., Daranas, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+value+of+c:+can+low+affinity+systems+be+studied+by+isothermal+titration+calorimetry.">On the value of c: can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 14859-14866 (2003).</li><li>Fukada, H., Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enthalpy+and+heat+capacity+changes+for+the+proton+dissociation+of+various+buffer+components+in+0.1+M+potassium+chloride.">Enthalpy and heat capacity changes for the proton dissociation of various buffer components in 0.1 M potassium chloride.</a> Proteins. 33, 159-166 (1998).</li><li>Houtman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+multisite+binary+and+ternary+protein+interactions+by+global+analysis+of+isothermal+titration+calorimetry+data+in+SEDPHAT:+application+to+adaptor+protein+complexes+in+cell+signaling.">Studying multisite binary and ternary protein interactions by global analysis of isothermal titration calorimetry data in SEDPHAT: application to adaptor protein complexes in cell signaling.</a> Protein Sci. 16, 30-42 (2007).</li><li>Bradrick, T. D., Beechem, J. M., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+binding+stoichiometries+and+cooperativity+are+observed+during+binary+and+ternary+complex+formation+in+the+single+active+pore+of+R67+dihydrofolate+reductase,+a+D2+symmetric+protein.">Unusual binding stoichiometries and cooperativity are observed during binary and ternary complex formation in the single active pore of R67 dihydrofolate reductase, a D2 symmetric protein.</a> Biochemistry. 35, 11414-11424 (1996).</li><li>Shenoy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisite+and+multivalent+binding+between+cyanovirin-N+and+branched+oligomannosides:+calorimetric+and+NMR+characterization.">Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: calorimetric and NMR characterization.</a> Chem. Biol. 9, 1109-1118 (2002).</li><li>Chopra, S., Lynch, R., Kim, S. H., Jackson, M., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+and+viscosity+on+R67+dihydrofolate+reductase+catalysis.">Effects of temperature and viscosity on R67 dihydrofolate reductase catalysis.</a> Biochemistry. 45, 6596-6605 (2006).</li><li>Norris, A. L., Serpersu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Coenzyme+A+with+the+Aminoglycoside+Acetyltransferase+(3)-IIIb+and+Thermodynamics+of+a+Ternary+System.">Interactions of Coenzyme A with the Aminoglycoside Acetyltransferase (3)-IIIb and Thermodynamics of a Ternary System.</a> Biochemistry. 49, 4036-4042 (2010).</li><li>Falconer, R. J., Penkova, A., Jelesarov, I., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+the+year+2008:+applications+of+isothermal+titration+calorimetry.">Survey of the year 2008: applications of isothermal titration calorimetry.</a> J. Mol. Recognit. 23, 395-413 (2010).</li><li>Ababou, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+the+year+2005:+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry.">Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> J. Mol. Recognit. 20, 4-14 (2007).</li><li>Buurma, N. J., Haq, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+analysis+of+isothermal+titration+calorimetry+data+for+ligand-DNA+interactions.">Advances in the analysis of isothermal titration calorimetry data for ligand-DNA interactions.</a> Methods. 42, 162-172 (2007).</li><li>Salim, N. N., Feig, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+of+RNA.">Isothermal titration calorimetry of RNA.</a> Methods. 47, 198-205 (2009).</li><li>De, M., You, C. C., Srivastava, S., Rotello, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+interactions+of+proteins+with+functionalized+nanoparticles:+a+thermodynamic+study.">Biomimetic interactions of proteins with functionalized nanoparticles: a thermodynamic study.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 10747-10753 (2007).</li><li>Velazquez-Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry+to+determine+association+constants+for+high-affinity+ligands.">Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands.</a> Nat. Protoc. 1, 186-191 (2006).</li><li>Velazquez Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ITC+in+the+post-genomic+era...?+Priceless.">ITC in the post-genomic era...? Priceless.</a> Biophys. Chem. 115, 115-124 (2005).</li><li>Harries, D., Rau, D. C., Parsegian, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solutes+probe+hydration+in+specific+association+of+cyclodextrin+and+adamantane.">Solutes probe hydration in specific association of cyclodextrin and adamantane.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 2184-2190 (2005).</li><li>Chervenak, M. C., Toone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+measure+of+the+contribution+of+solvent+reorganization+to+the+enthalpy+of+binding.">A direct measure of the contribution of solvent reorganization to the enthalpy of binding.</a> J. Am. Chem. Soc. 116, 10533-10539 (1994).</li><li>Taneva, S. G., Moro, F., Velazquez-Campoy, A., Muga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+of+nucleotide-induced+DnaK+conformational+states.">Energetics of nucleotide-induced DnaK conformational states.</a> Biochemistry. 49, 1338-1345 (2010).</li><li>Jelesarov, I., Bosshard, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+ferredoxin+binding+to+ferredoxin:NADP++reductase+and+the+role+of+water+at+the+complex+interface.">Thermodynamics of ferredoxin binding to ferredoxin:NADP+ reductase and the role of water at the complex interface.</a> Biochemistry. 33, 13321-13328 (1994).</li><li>Burrows, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+monomer-dimer+equilibrium+of+interleukin-8+reveals+it+is+a+monomer+at+physiological+concentration.">Determination of the monomer-dimer equilibrium of interleukin-8 reveals it is a monomer at physiological concentration.</a> Biochemistry. 33, 12741-12745 (1994).</li><li>Baker, B. M., Murphy, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+linked+protonation+effects+in+protein+binding+reactions+using+isothermal+titration+calorimetry.">Evaluation of linked protonation effects in protein binding reactions using isothermal titration calorimetry.</a> Biophys. J. 71, 2049-2055 (1996).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

ITC tem sido amplamente utilizado no estudo de interações ligante macromolécula, 11 com estudos olhando para proteína-ligante, 12 DNA ligante-13 e RNA-macromolécula 14 estudos. ITC pode até mesmo ser executado com materiais sólidos, tais como nanopartículas, que formam suspensões uniforme. 15 Além disso, sistemas ternários, onde um ligante já está ligado à macromolécula e um ligante segundo é titulada, pode ser usado para determinar a termodinâmica, por exemplo, a ligação do substrato a um sistema de enzima cofator. 7 Estudos também pode ser realizada por moléculas com alta afinidade de ligação que, normalmente, exceder o limite de detecção do ITC através da realização de ensaios de competição de ligação com ligantes mais fracos de ligação. 16 Informações sobre a fraca ligação ligantes também podem ser obtidas através dos ensaios de competição. 17 O papel da água na ligação pode ser explorado pela ITC, 18, ​​juntamente com a dependência da entalpia na reorganização do solvente. 19 Recentemente, a termodinâmica de mudança conformacional de variantes DNAK foram medidos sobre ligação de ADP e ATP. 20 associação proteína-proteína pode ser estudada pelo ITC, gerando informações sobre complexos hetero 21, bem como sobre homo-associação. 22 Os efeitos da temperatura na entalpia de ligação dará a capacidade térmica do evento vinculativo. 2 O número de prótons absorvidos ou liberados mediante ligação também pode ser determinada a partir de experimentos realizados em buffers com diferentes entalpias de ionização. 5 Se ITC estudos adicionais são feitas em diferentes valores de pH, em seguida, o pKa do grupo envolvido pode, potencialmente, ser determinada. 23 Para resumir, medidas precisas da concentração da macromolécula e ligante são imperativos para uma experiência boa ITC. Concentrações das amostras também precisa estar dentro de um intervalo adequado para obter dados confiáveis. Cuidados devem ser tomados com a reserva como impurezas pequenas moléculas e inadequações pH causará artefatos no termograma.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> 1,7 mL tubos de microcentrífuga </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-282 </td></tr><tr><td> 15 mL falcon tubos </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-49b </td></tr><tr><td> 2,5 mL seringa Hamilton </td><td> MicroCal </td><td> SYN161714 </td></tr></tbody></table>

isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity

Calorimetria de titulação isotérmica (ITC) é uma ferramenta útil para a compreensão da imagem termodinâmico completo de uma reação de ligação. Em ciências biológicas, as interações macromoleculares são essenciais para a compreensão da maquinaria da célula. Condições experimentais, como tampão e temperatura, pode ser adaptado para o sistema particular de ligação em estudo. No entanto, um planejamento cuidadoso é necessária uma vez que certas ligante e faixas de concentração macromolécula são necessários para obter dados úteis. Concentrações das macromoléculas e ligante necessidade de ser determinado com precisão para resultados confiáveis. Cuidado também deve ser tomado ao preparar as amostras como impurezas podem afetar significativamente a experiência. Quando experimentos ITC, juntamente com os controles, são realizados de forma adequada, informações úteis de ligação, tais como a estequiometria de afinidade, e entalpia, são obtidos. Executando experimentos adicionais com tampão ou condições diferentes de temperatura, informações mais detalhadas podem ser obtidas sobre o sistema. Um protocolo para a configuração básica de um experimento ITC é dado.

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Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Um protocolo geral para o uso da calorimetria de titulação isotérmica para monitorar a termodinâmica obrigatório para os sistemas biológicos com moderada afinidade de ligação é apresentado.

Calorimetria isotérmica de titulação para medição de Macromoléculas-Ligand Affinity

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction.  In biological ...

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52.5K visualizações.  University of Tennessee. Um protocolo geral para o uso da calorimetria de titulação isotérmica para monitorar a termodinâmica obrigatório para os sistemas biológicos com moderada afinidade de ligação é apresentado.

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Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for prototype strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). Therefore, an alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) was developed for the detection and titration of these viruses and is described herein. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of virus-containing samples in a 96-well plate format. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as 'Tissue Culture Infectious Dose 50 percent' (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain infectious replicating virus. This technique provides a reliable method for the titration of HCoV-229E and HCoV-OC43 in biological samples such as cells, tissues and fluids. This article is based on work first reported in Methods in Molecular Biology (2008) volume 454, pages 93-102.

In this video, we demonstrate an alternative method for detection and titering of viruses using an enzymatic antigen detection technique known as an immunoperoxidase assay. Here, we will show you how to collect your viral samples, prepare the cells for testing, and finally the immunoperoxidase assay using serial dilutions to determine the viral titer.

Titulação de coronavírus humanos Usando um ensaio de imunoperoxidase

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

Biologia

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host macromolecule. ITC has some advantages over common spectroscopic approaches for studying host/ligand interactions. For example, the heat released or absorbed when the two components interact is directly measured and does not require any exogenous reporters. Thus the binding enthalpy and the association constant (Ka) are directly obtained from ITC data, and can be used to compute the entropic contribution. Moreover, the shape of the isotherm is dependent on the c-value and the mechanistic model involved. The c-value is defined as c = n[P]tKa, where [P]t is the protein concentration, and n is the number of ligand binding sites within the host. In many cases, multiple binding sites for a given ligand are non-equivalent and ITC allows the characterization of the thermodynamic binding parameters for each individual binding site. This however requires that the correct binding model be used. This choice can be problematic if different models can fit the same experimental data. We have previously shown that this problem can be circumvented by performing experiments at several c-values. The multiple isotherms obtained at different c-values are fit simultaneously to separate models. The correct model is next identified based on the goodness of fit across the entire variable-c dataset. This process is applied here to the aminoglycoside resistance-causing enzyme aminoglycoside N-6'-acetyltransferase-Ii (AAC(6')-Ii). Although our methodology is applicable to any system, the necessity of this strategy is better demonstrated with a macromolecule-ligand system showing allostery or cooperativity, and when different binding models provide essentially identical fits to the same data. To our knowledge, there are no such systems commercially available. AAC(6')-Ii, is a homo-dimer containing two active sites, showing cooperativity between the two subunits. However ITC data obtained at a single c-value can be fit equally well to at least two different models a two-sets-of-sites independent model and a two-site sequential (cooperative) model. Through varying the c-value as explained above, it was established that the correct binding model for AAC(6')-Ii is a two-site sequential binding model. Herein, we describe the steps that must be taken when performing ITC experiments in order to obtain datasets suitable for variable-c analyses.

ITC is a powerful tool for studying the binding of a ligand to its host. In complex systems however, several models may fit the data equally well. The method described here provides a means to elucidate the appropriate binding model for complex systems and extract the corresponding thermodynamic parameters.

Coleta variável concentração Datasets Calorimetria Isotérmica de Titulação a fim de determinar mecanismos de ligação

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

De alto rendimento de purificação de afinidade com tag Proteínas Recombinantes

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

Titulação Bioquímica de glicogênio<em&gt; In vitro</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Um protocolo para exibição Fago e Affinity Seleção Usando Iscas proteína recombinante

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

Isolamento à base de Afinidade de Tagged Núcleos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos para Análise de Expressão Gênica

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

De alta capacidade de Titulação de luciferase expressando recombinantes Vírus

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree of compositional heterogeneity of a complex do not usually impede progress in conducting such studies. In contrast, a complex intended for structural characterization should be purified in a state that is both compositionally and structurally homogeneous as well as at a higher concentration than required for proteomics. Recently, there have been significant advances in the application of electron microscopy for structure determination of large macromolecular complexes. This has heightened interest in approaches to purify native complexes of sufficient quality and quantity for structural determination by electron microscopy. The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been optimized to extract and purify an 18-subunit, ~ 0.8 MDa ribonucleoprotein assembly from budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) suitable for negative stain and electron cryo microscopy. Herein is detailed the modifications made to the TAP method, the rationale for making these changes, and the approaches taken to assay for a compositionally and structurally homogeneous complex.

The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.

Purificação de Native Complexos de estudo estrutural usando um método Tag Tandem Affinity

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between cells, the extracellular matrix, and soluble and non-soluble chemical factors (e.g., chemoattractants). Standard methods for measuring the migration of cells, such as the Boyden chamber assay, work by counting cells on either side of a divider. These techniques are easy to use; however, they offer little geometric modification for different applications. In contrast, microfluidic devices can be used to observe cell migration with customizable concentration gradients of soluble factors1,2. However, methods for making microfluidics based assays can be difficult to learn.
Here, we describe an easy method for creating cell culture chambers to measure cell migration in response to chemical concentration gradients. Our cell migration chamber method can create different linear concentration gradients in order to study cell migration for a variety of applications. This method is relatively easy to use and is typically performed by undergraduate students.
The microchannel chamber was created by placing an acrylic insert in the shape of the final microchannel chamber well into a Petri dish. After this, poly(dimethylsiloxane) (PDMS) was poured on top of the insert. The PDMS was allowed to harden and then the insert was removed. This allowed for the creation of wells in any desired shape or size. Cells may be subsequently added to the microchannel chamber, and soluble agents can be added to one of the wells by soaking an agarose block in the desired agent. The agarose block is added to one of the wells, and time-lapse images can be taken of the microchannel chamber in order to quantify cell migration. Variations to this method can be made for a given application, making this method highly customizable.

This protocol details a customizable method to measure cell migration in response to chemoattractants that may also be used to determine the diffusion rate of a drug out of a polymer matrix.

A Câmara customizáveis ​​para a migração celular de medição

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...

Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into protein function. Despite the importance of multi-PTM enrichment studies, few studies investigate more than one PTM at a time, due partially to the expenses, time, and large protein quantities required to perform multiple global proteomic analysis of PTMs. The &#34;one-pot&#34; affinity enrichment detailed in this protocol overcomes these barriers by permitting the simultaneous identification and quantification of peptides with lysine residues containing acetylation and succinylation PTMs with low amounts of sample input. The protocol involves preparation of protein lysate from mouse livers of SIRT5 knockout mice, performance of trypsin digestion, enrichment for PTMs, and performance of mass spectrometric analysis using a data-independent acquisition (DIA) workflow. Because this workflow allows for the enrichment of two PTMs from the same sample simultaneously, it provides a practical tool to study PTM crosstalk without requiring large amounts of samples, and it greatly reduces the time required for sample preparation, data acquisition, and analysis. The DIA component of the workflow provides comprehensive PTM-specific information. This is particularly important when studying PTM site localization, as DIA provides comprehensive sets of fragment ions that can be computationally deciphered to differentiate between different PTM localization isoforms.

This workflow describes the performance of time- and cost-efficient enrichment of multiple protein post-translational modifications (PTMs) simultaneously for quantitative global proteomic analysis. The protocol utilizes peptide-level PTM enrichment with multiple conjugated antibodies, followed by data-independent acquisition mass spectrometry analysis to gain biological insights into PTM crosstalk.

Enriquecimento de afinidade simultânea de duas modificações pós-translacionais para quantificação e localização do site

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into ...