O uso de enzimas como catalisadores nas reações pode reduzir a quantidade de energia necessária para a reação, e reduzir subprodutos tóxicos. No entanto, o uso de enzimas na indústria é limitado, pois as enzimas não são estáveis e podem ser caras. Este protocolo poderia reduzir o tempo necessário para determinar se as condições são deletérios para a atividade enzimante, ou se as modificações na enzima aumentaram sua estabilidade.
A principal vantagem desta técnica é que ela requer menos horas de homem do que os ensaios tradicionais de estabilidade das enzimas. Além disso, este protocolo pode ser usado com uma ampla gama de enzimas porque pode ser usado com qualquer reação que libere ou absorva calor. Para começar, prepare 0,1 tampão de acetato de sódio molar.
Meça 800 mililitros de água destilada em um béquer graduado de 1.000 mililitros. Em seguida, pese 8,2 gramas de acetato de sódio anidro, e adicione-o ao béquer. Coloque o béquer em um prato de agitação.
Coloque uma haste de mexida no béquer e ligue a placa de mexida para mexê-la até dissolver completamente. Quando o acetato de sódio anidro estiver completamente dissolvido, use um medidor de pH calibrado para medir o pH da solução. Use uma pipeta para adicionar 1 ácido clorídrico molar ou hidróxido de sódio em conformidade para obter o pH desejado em 4,6.
Adicione água destilada no béquer até que o volume total atinja 1.000 mililitros. Para preparar a solução enzimática, em um cilindro graduado de 15 mililitros, meça 8 mililitros do tampão de acetato de sódio molar 0,1. Em seguida, adicione a solução tampão em um tubo cônico de 15 mililitros com enzima, e agite vigorosamente até que a enzima se dissolva.
Adicione mais solução tampão até que o volume total atinja 10 mililitros. Armazene a solução enzimápica a 4 graus Celsius até o uso. Para preparar a solução do substrato, pese o substrato e coloque-o em um copo de vidro de 100 mililitros.
Use um cilindro graduado para medir 20 mililitros da solução tampão e, em seguida, adicione-o ao béquer de vidro. Coloque o béquer em uma placa de mexida e coloque uma haste de agitação magnética no béquer. Ligue o fogo e ajuste a velocidade de agitação em conformidade.
Deixe a agitação continuar até que o substrato tenha dissolvido. Despeje a solução de substrato em um tubo cônico de 15 mililitros e adicione o tampão de acetato de sódio previamente preparado, até que o volume total seja de 45 mililitros. Agite o tubo para misturar.
Armazene a solução do substrato à temperatura ambiente até usar. No computador, abra ITC Run e clique na configuração. Clique na taxa de agitação e defina para 350 rpm.
Verifique se o tamanho da seringa está em 50 microliters. Defina a temperatura para 55 graus Celsius e pressione a atualização. Aguarde pelo menos uma hora antes de prosseguir, para dar tempo suficiente para o instrumento ITC aquecer ou esfriar conforme necessário.
Antes de carregar a enzima, certifique-se de que a célula de referência esteja carregada com 350 microliters de água destilada. Para limpar a célula amostral, encha a seringa de carregamento com 500 microliters de 2% de solução de limpeza. Insira cuidadosamente a agulha na célula da amostra, encha a célula e remova lentamente o líquido usando a mesma seringa.
Descarte o líquido em um béquer. Repita esta etapa duas vezes com 2% de solução de limpeza, três vezes com 70% de etanol, e depois lave dez vezes com água destilada. Depois que a célula amostral for limpa, encha a seringa de carregamento com 450 microliters de solução enzimática.
Insira cuidadosamente a agulha até a parte inferior da célula amostral, e pressione lentamente o êmbolo até a linha de 100 microliter para evitar a formação de bolhas de ar. Em seguida, lave a seringa de 50 microliter com água destilada três vezes colocando a ponta da agulha na água para lentamente levar a água para dentro da seringa, em seguida, distribuindo a água em um recipiente de lixo. Enxágüe com a solução do substrato três vezes para remover água residual.
Depois disso, encha a seringa de titulação com solução de substrato, desenhando a solução até que a seringa esteja cheia sem bolhas de ar. Com a seringa ainda na solução do substrato, remova o êmbolo e permita que aproximadamente 2 microliters de ar entrem na parte superior da seringa e reinseram o êmbolo. Retire a alça do burete do ITC, coloque a seringa dentro da alça do burete e parafuso até ficar apertado.
Limpe a ponta da seringa de titulação com um tecido sem fiapos e, em seguida, coloque cuidadosamente a alça do burete no instrumento ITC e bloqueie-a no lugar. Para a configuração do experimento, selecione a titulação incremental. Clique em inserir para configurar as injeções.
Ajuste o intervalo de injeção para 5.400 segundos, o volume de injeção para 4 microliters e o número de injeções para quatro. Pressione OK para confirmar as configurações. Na caixa de equilíbrio, selecione o equilíbrio automático e os grandes calores esperados.
Defina a linha de base inicial para 300 segundos. Para iniciar a execução, clique no símbolo iniciar ao lado da taxa de agitação e clique em iniciar, que está localizado ao lado do símbolo da chave. Salve o arquivo e permita que o instrumento seja executado.
Para analisar os dados, abra o arquivo em Nano Analyze. Clique em dados e selecione colunas de dados. Selecione todos os dados, copie e cole os dados no Microsoft Excel.
Ajuste 0 linha de base adicionando o valor necessário em 300 segundos para torná-lo 0. Aplique esta correção em toda a coluna de valores da taxa de calor. Em seguida, gráficos de gráficos do valor mínimo ou máximo em relação ao momento em que o valor ocorreu durante a titulação.
Neste protocolo, os traços de dados itc de atividade lactase são mostrados com quatro injeções sequenciais de lactose em uma solução de lactase em pH 4.6 tampão a 55 graus Celsius, 45 graus Celsius, 35 graus Celsius e 25 graus Celsius. Um controle sem enzimas foi realizado a 55 graus Celsius para o calor da mistura. Para cada injeção de enzima, há um calor extermático inicial de mistura e, posteriormente, a hidrólise endotérmica catatada de lactase da lactose ocorre até que a reação seja concluída, e a taxa de calor retorne à linha de base.
O pico endotérmico mínimo após cada injeção, é um pouco menor do que a injeção anterior devido à diminuição da atividade enzimática. Como esperado, a estabilidade da enzima para cada injeção diminui com o aumento da temperatura. O experimento de controle mostra que a atividade de lactase a 25 graus Celsius teve uma redução de 8% na atividade enzimática, devido à diluição após quatro injeções.
Considerando que a quarta injeção mostra uma redução de 73% no ensaio, a perda real da atividade enzimápica foi, portanto, de 65%. Assim, a diluição da lactase resultante de cada injeção, teve um efeito relativamente pequeno de 11% na atividade enzimática. É importante que o buffer usado para fazer as soluções enzimáculas e substratos sejam correspondidos o mais de perto possível.
Incompatibilidade de pH ou concentração pode resultar em um calor maior de mistura que pode mascarar o calor da reação. Você pode aplicar este protocolo para estudar enzimas e determinar sua estabilidade medindo a taxa de calor liberada ou absorvida durante o curso de uma reação.
