Os autores gostariam de agradecer Jeffrey Farrell, James Gagnon, e Jennifer Bergmann para comentários sobre o manuscrito. KWR foi apoiado pelo Programa de Bolsas de Pós-Graduação National Science Foundation Research durante o desenvolvimento do ensaio FDAP. Este trabalho foi financiado por doações do NIH para AFS e por doações da Fundação Alemã de Pesquisa (Emmy Noether Programa), a Sociedade Max Planck, e do Programa Human Frontier Science (Prémio Carreira de Desenvolvimento) para PM.

1. Gerando um Photoconvertible construção de fusão e injetando dechorionated embriões Zebrafish <ol><li> Gerar uma construção funcional contendo a proteína de interesse fundida com uma proteína photoconvertible verde-a-vermelho (ver discussão), em seguida, utilizar a transcrição in vitro para gerar ARNm que codifica tapado a proteína de fusão como em Muller et al., 2012 19. </li><li> Use pronase para remover os córions de cerca de 30 embriões de peixe zebra na fase de uma célula. Alternativamente, dechorionate manualmente embriões usando uma pinça 28. Nota: Os embriões devem ser dechorionated para imagens subseqüente. Se desejado, os embriões podem ser injectados através do córion dechorionated e depois, imediatamente antes da imagiologia. <ol><li> Faça uma solução 5 mg / ml estoque de pronase de Streptomyces griseus em meio embrião de peixe-zebra padrão de 19. Rocha suavemente a solução à TA durante 10 min para permitir a protease para dissolver. Alíquota de 2 ml em tubos de microcentrífuga e congelamento a -20 ° C. </li><li> Transferência de embriões nos estágios de uma célula para um vidro 5 cm de diâmetro ou revestidos por placa de Petri de plástico de agarose contendo ~ 8 mL de meio de embrião. Adicionar 2 ml de solução de estoque descongelado pronase para o prato e incubar à temperatura ambiente durante 5 a 10 min. </li><li> Evite expor embriões para o ar ou plástico, como o contato com qualquer um fará com que embriões dechorionated à ruptura. Encha um copo de vidro de 200 ml com meio embrião. Transferir os embriões para o béquer através da inclinação da placa de Petri enquanto submergindo-o no meio. </li><li> Depois de os embriões terem assentado no fundo do copo, derramar a maior parte do meio de embrião, depois verter meio fresco embrião para o copo. A roda leve do meio de verter para o copo faz com embriões a perder seus córions enfraquecidos. </li><li> Repita o passo 1.2.4. </li></ol></li><li> Transferir os embriões dechorionated a uma injeção prato revestido de agarose 29 usando uma pipeta Pasteur de vidro com uma ponta flambado. Chamejantea ponta da pipeta impede bordas irregulares a partir de embriões mutilações. </li><li> Co-injetar o mRNA e a 3 kDa Alexa488-dextrano conjugado 29,30 (Figura 1B; veja a discussão para sugeriu mRNA e quantidades Alexa488-dextrano). Injectar directamente no centro da célula (não a gema) para assegurar uma distribuição de ARNm e corante fluorescente uma vez começa a clivagem. Nota: O sinal Alexa488 vai ser utilizado durante a análise dos dados para gerar máscaras compartimentados de modo a distinguir entre a fluorescência intracelular e extracelular. </li><li> Transferência de embriões injectados a uma revestidos por 1-2% de agarose poço de uma placa de seis poços de plástico cheio com meio de embrião. Incubar no escuro a 28 ° C até embriões ter atingido o estágio final de esfera 31 (cerca de 5 horas após a fertilização). Verifique embriões, cada um para 2 horas sob um microscópio estereoscópico e remover todos os detritos gerados por embriões que já morreram. </li></ol> 2. Montagem embriões Zebrafish para Photoconversion e imagem em um microscópio invertido confocal <ol><li> Use uma lupa para identificar 1-5 embriões saudáveis, e usar uma pipeta Pasteur de vidro com uma ponta flambado para removê-los do prato. </li><li> Suavemente ejectar os embriões para um tubo de microcentrífuga contendo ~ 1 ml de 1% derretido baixo ponto de fusão de agarose na forma de embrião 1x Danieau (ver Materiais Lista) (Figura 2A). Nota: Agarose deve ter uma temperatura entre 40 e 42 ° C; temperaturas mais elevadas podem danificar os embriões. </li><li> Desenhar os embriões para a pipeta, juntamente com alguns agarose. Gentilmente ejetar o agarose e embriões para a tampa de vidro de um prato fundo de vidro (Figura 2B). Assegure-se que a espessura do vidro de cobertura é compatível com o objectivo no microscópio confocal. <ol><li> Re-utilizar a pipeta de vidro, se desejar. Para limpar a agarose residual para fora da pipeta e evitar o entupimento, rapidamente médio pipeta embrião cima e para baixo.Coloque um tubo de 15 ml cheio com ~ 5 ml de meio ao lado do embrião estereomicroscópio para esta finalidade. </li></ol></li><li> Use uma sonda de metal para posicionar os embriões para que o polo animal (blastoderm) enfrenta a tampa de vidro. Trabalhe rapidamente desde a agarose vai solidificar em 20-30 seg. Use a lupa para monitorar as posições dos embriões e reajustar se necessário até que a agarose endurece. </li><li> Repita os passos 2,1-2,4 até que o número desejado de embriões tiver sido montado. Nota: Em uma experiência típica, quatro gotas de agarose contendo quatro ou cinco embriões cada um vai caber facilmente na tampa de vidro. Cerca de 16 embriões pode ser trabalhada durante um único ensaio ideal (Figura 2C). </li><li> Quando a agarose solidificou, encha o prato com fundo de vidro com meio embrião de 1x Danieau. </li></ol> 3. Photoconverting e medindo a diminuição do sinal Photoconverted Um objectivo 25X ou 40X de água ié adequado para o tamanho e índice de refracção de embriões de peixes-zebra. É melhor utilizar óleo de imersão com o mesmo índice de refracção de água em vez de água real, uma vez que a água irá evaporar-se durante o decurso da experiência de cinco horas. Assegure-se que o óleo de imersão é concebido para ser usado com um objectivo de água (não de petróleo). <ol><li> Coloque uma grande gota de óleo de imersão sobre o objetivo de garantir que a película de óleo entre o objetivo e tampa de vidro não vai quebrar como palco move-se para diferentes posições do embrião durante a geração de imagens. Firmemente colocar o prato com fundo de vidro para o palco para que o prato não vai mudar quando o estágio de movimentos. Se possível, utilizar uma fase aquecida a 28 ° C, a temperatura óptima para o desenvolvimento do peixe-zebra. </li><li> Definir a posição de cada embrião no pacote de software do microscópio confocal. Ajuste o z-depth para cada embrião, e tentar alvejar a menos no mesmo plano em cada embrião. Nota: Cerca de 30 mm a partir do pólo animal é um good profundidade desde a esta profundidade da camada envolvente do embrião pode ser evitada, a área de imagem é maximizada, e dispersão de luz é mínima. Uma fatia óptico único, com uma espessura de 3,3 mm ~ fornece dados suficientes; não há necessidade de adquirir uma pilha de z (ver item 5). </li><li> Recolhe dois sinais ao longo do experimento: o sinal &quot;verde&quot; do Alexa488-dextrano conjugado-que irá ser utilizado durante a análise de dados para isolar extracelular e intracelular de fluorescência e o sinal &quot;vermelho&quot; a partir da proteína de fusão após o que é photoconverted. <ol><li> Excitar Alexa488 usando um laser de 488 nm e a fluorescência emitida a recolher entre ~ 500 e 540 nm. Nota: Depois de fotoconversão, muitos verde-to-vermelho proteínas photoconvertible (eg, Dendra2) pode ser animado com um laser de 543 nm e emitem fluorescência entre ~ 550 e 650 nm. Ajuste conforme necessário, com base na proteína photoconvertible usado. </li></ol></li><li> Adquirir &quot;pré-fotoconversão&quot;Imagens, e configurar o software do microscópio confocal a imagem cada uma das posições previamente definidos (a partir do passo 3.2), com as condições de imagem apropriados a cada 10 ou 20 minutos para um curso de tempo de cinco horas (ver seção 5 e Discussão). </li><li> Para photoconvert a proteína de fusão, mudar para uma objectiva 10X e expor os grupos de embriões a luz UV proveniente de uma lâmpada de arco de mercúrio com um filtro de ~ 300-400 nm de excitação com a intensidade de 100% durante 2 minutos. Mudar o foco ao longo do eixo z para promover fotoconversão uniforme (ver item 5). Certifique-se que o óleo de imersão não escorrer para a objetiva de 10x durante fotoconversão. Nota: O deslocamento do foco durante fotoconversão pode ser automatizada, a fim de evitar a variabilidade entre os experimentadores. </li><li> Volte para o objectivo 25X ou 40X imediatamente após fotoconversão. Certifique-se de que as posições previamente definidos a partir do passo 3.2 ainda são precisos. Se o prato deslocado durante photoconversion, re-definir as posições dos embriões. <ol><li> Inicie o programa criado no passo 3.4 e permitir imaging para continuar por 5 horas. Registar o tempo decorrido entre o início e fotoconversão de formação de imagens para cada embrião. </li></ol></li><li> Verifique ocasionalmente no experimento. Monitorar o nível de meio de Danieau e adicionar mais, se necessário. Reinicie o software se estagnou. </li><li> A fim de determinar os valores da fluorescência de fundo que serão utilizadas durante a análise dos dados para estimar a assíntota de um modelo exponencial decrescente, incluem alguns embriões que foram injectados com Alexa488-dextrano, mas não ARNm no experimento. Para determinar o ruído do instrumento, a qual também irá ser utilizado durante a análise de dados subsequente, adquirir uma imagem na ausência de uma amostra. </li></ol> 4. Analisando os dados usando PyFDAP <ol><li> Inspecione visualmente o tempo de conjuntos de dados de curso de cada embrião. Descartar conjuntos de dados a partir de embriões que morreram durante imaging, que mudou significativamente, que têm níveis muito baixos de sinal photoconverted, ou que contêm regiões de células que se parecem incomum e pararam de se mover e dividindo (típico de embriões feridos ou doentes). Nota: Ocasionalmente, bolhas no óleo de imersão ou outros artefatos aparece em uma ou duas imagens em um conjunto de dados de outra forma utilizável. Anote todas as imagens que contêm artefatos; eles serão descartados mais tarde, e os restantes pontos de tempo de tal conjunto de dados ainda podem ser analisados. </li><li> Use a PyFDAP pacote de software baseado em Python para analisar os dados FDAP. PyFDAP calcula meias-vidas por determinação da intensidade média de fluorescência vermelha intracelular e extracelular em cada imagem e ajuste dos dados com uma função exponencialmente decrescente 56 (Figura 3). <ol><li> Baixe PyFDAP (veja Lista de Materiais). </li><li> Uso PyFDAP para separar sinal intracelular e extracelular photoconverted (Figura 3A, B). NósÊ O sinal Alexa488, que é estritamente intracelular, para criar uma máscara de intracelular. Aplique esta máscara para a imagem do canal vermelho correspondente para evitar pixels intracelulares de ser considerado para o cálculo da intensidade média extracelular. Para medir a intensidade intracelular média, inverter a máscara. </li><li> Em PyFDAP, exibir as imagens mascarados gerados na etapa 4.2.2. Inspecione visualmente essas imagens e descartar conjuntos de dados em que as máscaras não distinguir com precisão intracelular do espaço extracelular (este deve ser rara, note que as membranas celulares estão incluídas nas imagens em que o espaço extracelular tem sido mascarado, mas eles poderiam ser removidos através da alteração do limiar algoritmo ou através da introdução de uma máscara de membrana (por exemplo, utilizando uma membrana-PCP)). Também descartar quaisquer imagens individuais contendo artefatos (por exemplo, bolhas no óleo de imersão) identificados na etapa 4.1. </li><li> Use PyFDAP para calcular médias intensidades de fluorescência intra e extracelulares para each imagem. PyFDAP calcula estas médias pela soma das intensidades de pixels que caem fora da máscara e dividindo pelo número total de pixels somados. </li><li> Coloque os dados de fluorescência (Figura 3C), com a seguinte função exponencial: <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52266/52266eq1.jpg" width="159" /> onde t é o tempo de pós-fotoconversão, c (t) é a intensidade de um dado valor de t, c 0 é a intensidade em t = 0, k é a constante de velocidade de eliminação, e y é 0 a assíntota que se aproxima a função como fluorescência diminui (Figura 1D). y 0 pode ser restringida com base nas medições em 19 passo 3.8. </li><li> Use PyFDAP para calcular a proteína extracelular e intracelular de semi-vida (τ) a partir das constantes de velocidade de depuração (k) utilizando a seguinte relação: <img fo:content-width = src &quot;1em&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 52266 / 52266eq2.jpg&quot; width = &quot;153&quot; /&gt; </li></ol></li></ol> 5. Experimentos controlo para avaliar Fotodegradação, inadvertida Fotoconversão e Fotoconversão Uniformidade <ol><li> Avaliando fotodegradação Nota: A fotodegradação pode causar uma diminuição na intensidade de fluorescência artefacto que reflecte as propriedades de branqueamento de proteína fluorescente para além da eliminação da proteína de interesse. <ol><li> Para avaliar a possível fotodegradação, execute uma série de experimentos FDAP com intervalos de 10 min entre imagem e um segundo conjunto, com 20 minutos de intervalo entre as imagens (Figura 4). Analisar os dados de ambos os conjuntos de experimentos usando PyFDAP conforme descrito na Seção 4. </li><li> Compare as meias-vidas dos experimentos de 10 e 20 min de intervalo. Meia-vida de 20 min de intervalo experimentos indicam fotodegradação significativa. Se as semividas de ambas as experiências são idênticos, fotobleaching não é uma preocupação significativa. </li><li> Alternativamente, avaliar a fotodegradação através da aquisição de uma série de ~ 30 imagens imediatamente após fotoconversão. Uma diminuição significativa na intensidade de fluorescência indica fotodegradação significativa. </li><li> Se fotodegradação é detectado, usar o poder do laser inferior, diminuir o tempo de criação de imagens, ou considerar o uso de uma proteína photoconvertible mais fotoestável 32. </li></ol></li><li> Avaliando fotoconversão inadvertida. Nota: pode ser Dendra2 photoconverted usando iluminação de 488 nm 27. Quando excitante Alexa488 com o laser de 488 nm, tal como descrito no passo 3.3.1, fotoconversão inadvertido e, por conseguinte, um aumento artefactual na semi-vida aparente da proteína de interesse é possível. No entanto, nós e os outros 33 descobriram que 488 nm iluminação é um método ineficiente de fotoconversão em embriões de peixe-zebra. <ol><li> Use a experiência de controlo descrito na etapa 5.1.1 para detectar fotoconversão inadvertida. Compare as meias-vidas dos experimentos de 10 e 20 min de intervalo. Shorter meias-vidas de 20 min de intervalo experimentos indicam fotoconversão inadvertida significativo. Se as meias-vidas de ambas as experiências são idênticos, fotoconversão inadvertida não é uma preocupação significativa. </li><li> Se fotoconversão inadvertida for detectado, use uma menor potência do laser de 488 nm e os tempos de imagem mais curtos para evitar inadvertidamente photoconverting Dendra2. </li></ol></li><li> Avaliando uniformidade fotoconversão. Nota: Se fotoconversão está inclinado para o polo animal do embrião, a diminuição na fluorescência será influenciada pela difusão da proteína ou do movimento das células em planos mais profundas (Figura 5A). <ol><li> Para determinar se fotoconversão é uniforme, expressar uma proteína secretada photoconvertible (para as experiências com as proteínas de fusão extracelulares) ou uma proteína citoplasmática photoconvertible (para as experiências com as proteínas de fusão intracelulares). Photoconvert como de costume, tgalinha adquirir uma pilha z engloba a maior parte da blastoderme a cada 20 min durante 80 min. </li><li> Se fotoconversão é tendencioso em direção ao pólo animal, a intensidade de fluorescência em planos mais profundos irá aumentar ao longo do tempo devido à difusão ou movimento celular (Figura 5B). Se não uniforme fotoconversão é detectado, o foco mais profundo nos embriões durante fotoconversão. </li></ol></li></ol>

Os autores não têm conflitos de divulgar.

O sucesso de uma experiência FDAP baseia-se na geração de uma proteína de fusão photoconvertible funcional. Marcação de uma proteína pode afectar a sua actividade biológica e / ou propriedades biofísicas, incluindo a sua localização, a solubilidade, a estabilidade e 36-41. Ser preparados para testar a actividade de várias construções de fusão diferentes, a fim de encontrar um que seja activo. Verificou-se que a mudança da posição da proteína photoconvertible em relação à proteína de in...

Os níveis de proteínas em células e organismos são determinados através das suas taxas de produção e de depuração. Proteína de semi-vida pode variar de minutos a dias 1-4. Em muitos sistemas biológicos, a estabilização ou limpeza de proteínas-chave tem efeitos importantes sobre a atividade celular. Modulação da estabilidade da proteína intracelular é necessário para a progressão do ciclo celular 5,6, sinalização de desenvolvimento 7-9, apoptose 10, e a função normal e manutenção de neurónios 11,12. A estabilidade da proteína extracelular afecta a distribuição e disponibilidade de proteínas segregadas, tais como morfogénios 13,14, dentro de um tecido. Ao longo das últimas décadas, a estabilidade da proteína foi avaliado principalmente em cultura de células usando radioativo pulso de rotulagem ou experiências de perseguição cicloheximida 15. Nesses experimentos pulse-chase, as células são transitoriamente ou expostos a um &quot;pulso&quot; de amino radioativoprecursores de ácidos que são incorporados em proteínas sintetizadas de novo, ou eles são expostos a ciclo-heximida, a qual inibe a síntese proteica. As células em cultura são então recolhidos em diferentes pontos de tempo, e, ou imunoprecipitação seguido por autorradiografia (em experiências de pulse-chase radioactivos) ou imunodetecção (em experiências de cicloheximida) é utilizada para quantificar a depuração de proteína ao longo do tempo. Ensaios de estabilidade proteína convencionais têm várias deficiências. Primeiro, as proteínas nestes ensaios frequentemente não são expressos nos seus ambientes endógenos, mas sim em cultura de tecidos e por vezes em células a partir de espécies diferentes. Para proteínas cuja estabilidade é dependente do contexto, esta abordagem é problemática. Em segundo lugar, não é possível seguir a depuração de proteínas em células individuais ou organismos ao longo do tempo, e os dados obtidos nestes ensaios reflecte uma média de diferentes populações de células em diferentes pontos de tempo. Como as células individuais podem ter começadocom diferentes quantidades de proteína, pode ter retomado o marcador radioactivo ou cycloheximide em momentos diferentes, ou podem ter diferentes cinética de depuração, tais dados agregados pode ser enganador. Finalmente, no caso das experiências de perseguição cicloheximida, adição do inibidor da síntese de proteína pode ter efeitos fisiológicos não desejadas que podem alterar a estabilidade da proteína 16-18 artificialmente. Estas deficiências podem ser evitadas através do uso de fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP), uma técnica que utiliza proteínas photoconvertible para medir folga proteína dinamicamente nos organismos vivos 19-25 (ver discussão para limitações da técnica FDAP). Photoconvertible proteínas são proteínas fluorescentes cuja excitação e emissão propriedades mudam após exposição a determinados comprimentos de onda de luz 26. Uma variante comumente usado é Dendra2, uma proteína photoconvertible &quot;verde-to-vermelho&quot;, que tem inicialmente excitação de emissão e propriedades semelhantes às proteínas fluorescentes verdes, mas após a exposição à radiação UV luz- &quot;fotoconversão&quot; -sua excitação / emissão de propriedades tornam-se semelhantes às das proteínas fluorescentes vermelhas 23,27. Importante, nova proteína produzida após fotoconversão não têm as mesmas propriedades de excitação / emissão como a proteína photoconverted, permitindo a dissociação da produção de depuração e em cima fotoconversão e observação de apenas um conjunto de proteínas photoconverted. Marcação de proteínas de interesse com proteínas photoconvertible, portanto, fornece uma maneira conveniente de pulso de rótulo proteínas intactas, organismos vivos opticamente acessíveis. Em ensaios FDAP (Figura 1A), uma proteína de interesse é marcado com uma proteína photoconvertible e expressa num organismo vivo (Figura 1B). A proteína de fusão é photoconverted, e a diminuição do sinal de photoconverted ao longo do tempo é monitorizado por fluorescenmicroscopia ce (Figura 1C). Os dados são então montados com um modelo apropriado para determinar a meia-vida da proteína de fusão (Figura 1D). O ensaio aqui descrito FDAP foi desenhado para determinar as semividas extracelulares de proteínas de sinalização segregadas em embriões de peixe-zebra durante a embriogénese precoce 19. No entanto, esta abordagem pode ser adaptada para qualquer organismo modelo transparente que tolera imagens ao vivo, e pode ser utilizado para monitorar a depuração de qualquer proteína intracelular ou extracelular taggable. As variações da técnica aqui descrita não tem sido realizada em células em cultura e 20,23 Drosophila 22 e 21 embriões de ratinho.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To generate capped mRNA for injection into embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plastic dish (BD Falcon)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 cm diameter glass petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injecting and mounting embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Danieau&#39;s medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau&#39;s medium: add 200 mg to 20 ml Danieau&#39;s medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 &#176;C, re-melted at 70 &#176;C, and cooled to 40 - 42 &#176;C when ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For positioning embryos during mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated stage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To maintain embryos at the optimal temperature of 28 &#176;C during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal software capable of time-lapse imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25x or 40x water objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Objective for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x air objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Objective for photoconversion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Immersion oil with the same refractive index as water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (fdap)

A estabilidade da proteína influencia muitos aspectos da biologia, e medir a cinética limpeza de proteínas pode fornecer importantes insights sobre sistemas biológicos. Em experiências FDAP, o apuramento das proteínas nos organismos vivos podem ser medidos. Uma proteína de interesse é marcado com uma proteína fluorescente photoconvertible, expressa in vivo e photoconverted, e a diminuição do sinal photoconverted ao longo do tempo é monitorizada. Os dados são então equipado com um modelo de depuração adequada para determinar a meia-vida da proteína. Importante, a cinética de depuração de populações de proteína em diferentes compartimentos do organismo pode ser examinado separadamente aplicando máscaras compartimentais. Esta abordagem tem sido utilizada para determinar os intra- e extracelulares meias-vidas de proteínas de sinalização segregadas durante o desenvolvimento do peixe-zebra. Aqui, descrevemos um protocolo para experimentos FDAP em embriões de peixe-zebra. Deve ser possível usar FDAP para determinar a cinética de depuração dequalquer proteína de qualquer organismo taggable opticamente acessíveis.

FDAP tem sido usado para determinar a meia-vida de proteínas de sinalização extracelular em embriões de peixe-zebra 19. Uma destas proteínas, estrabismo, induz a expressão de genes durante o desenvolvimento embrionário mesendodermal 34. Estrabismo-Dendra2 activa a expressão de genes mesendodermal em níveis semelhantes aos estrabismo não marcado, como demonstrado por qRT-PCR e hibridização in situ em 19 ensaios. Os embriões foram co-injectados com Alexa488-dextrano e...

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Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Os níveis de proteína em células e tecidos são muitas vezes fortemente regulada pelo equilíbrio da produção de proteínas e de apuramento. Usando Fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP), a cinética de apuramento de proteínas pode ser medida experimentalmente in vivo.

Medir a estabilidade da proteína em Viver embriões Zebrafish Usando Fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

measuring-protein-stability-living-zebrafish-embryos-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

11.1K visualizações.  Harvard University.  Os níveis de proteína em células e tecidos são muitas vezes fortemente regulada pelo equilíbrio da produção de proteínas e de apuramento. Usando Fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP), a cinética de apuramento de proteínas pode ser medida experimentalmente in vivo. 

Vídeo: Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Lesão Vessel Mecânica em embriões Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Biologia do Desenvolvimento

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analisando<em&gt; In Vivo</em&gt; Migração celular usando transplantes de células e de imagem Time-lapse em embriões Zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

Luz Folha com base em microscopia de fluorescência de Vida ou fixados e corados<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Os embriões

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

Indução de hipóxia em sapos vivos e embriões de peixe-zebra

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Photoconversion de célula única no Zebrafish intacta vida

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

Seguindo os movimentos de tecido endocárdico através de célula Photoconversion no embrião Zebrafish

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Imunohistoquímica do Monte Inteiro em Embriões e Larvas de Zebrafish

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Visualizando o cérebro em desenvolvimento em zebrafish vivo usando Brainbow e Imagem Confocal de lapso de tempo

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...