Agradeço às seguintes pessoas por sua ajuda no desenvolvimento deste protocolo: Chuck Kristensen, Greta Binford, Alex K. Lancaster, Konrad Zinsmaier e Mays Imad. Dados de espectrometria de massa e proteômica foram adquiridas pelo Consórcio Proteômica Arizona apoiada por NIEHS concessão ES06694 ao SWEHSC, NIH / NCI concessão CA023074 ao AZCC e pelo Instituto BIO5 da Universidade do Arizona. O financiamento para este trabalho foi fornecido a partir do National Institutes of Health (Instituto Nacional de Medicina Geral) de subvenções 1F32GM83661-01 e 1R15GM097714-01 para Jessica E. Garb.

1. Preparação da Electro-estimulador Aparelho <ol><li> Conecte o cabo de alimentação eletro-estimulador para a saída e anexar pedal externo para a entrada de sinal externo. Nota: Fios elétricos devem estar bem isolados e atual entregar metal exposto não deve ser tocado. Usar luvas de látex ou borracha nitrílica para proteção. Interruptor de alimentação eletro-estimulador deve estar na posição OFF quando anexar cabo de alimentação e ligar os fios. </li><li> Conecte eletrodo positivo para o terminal de saída vermelho em eletro-estimulador (quando a chave de polaridade está no modo normal) e conectar o eletrodo negativo para o terminal de saída de preto. Nota: Cada fio de eletrodo deve terminar em um jacaré. </li><li> Definir estimulador para as seguintes configurações iniciais recomendadas: Tensão = 7 V, frequência = 1 pulsos por segundo, atraso = 0 milissegundos, duração = 200 milissegundos, pulsos gêmeos mudar = regular, e interruptor mode = off. </li><li> A saída do teste de eletrodos, anexando as garras jacaré voltmeTer pontas de prova positivos e negativos. Ligue o interruptor estimulador e fornecer corrente com pedal. </li></ol> 2. Preparação de imobilizatórias Fórceps e Outros Materiais <ol><li> Mergulhe um pino de fórceps pluma em revestimento plástico líquido e esperar quatro horas para deixar o revestimento seco. Enrole firmemente 15 milímetros da ponta do dente adversária com uma única camada de linhas de costura de algodão, e garantir fio amarrando o fim em um nó. Nota: O fio é utilizado para absorver uma solução salina aplicada que promove a condutividade eléctrica, enquanto o revestimento de plástico proporciona isolamento para retardar a corrente. </li><li> Cortar ponta da agulha hipodérmica sem corte com uma tesoura afiada e suavizar a abertura com papel de areia. Coloque a agulha para uma armadilha resíduos de vácuo (por exemplo, balão de filtração a vácuo) através de tubos. Nota: A agulha vai aspirar a água e afastado regurgitar, e servirá para completar o circuito criado pelos eléctrodos do estimulador. A mu abertura agulhast ser pequeno o suficiente para não prejudicar a aranha, mas grande o suficiente para solução de vácuo sem obstruir (por exemplo, 25 G x 1 ½ no medidor, consulte Lista de Materiais). </li><li> Fórceps posição pluma horizontalmente em uma posição bem fechado com uma braçadeira dupla coberta de vinil preso a uma base magnética ou aparelho estande fixo sob campo de um microscópio de dissecação de vista, com revestimento de plástico pino de fórceps no topo e linha revestido pinos na parte inferior. Nota: A braçadeira de duas pontas é mantido numa posição estacionária para a base magnética por um suporte de fixação (ver Lista de Materiais). Uma banda de borracha pode ser firmemente fixado em torno pontas das pinças pluma, ao lado de suporte da braçadeira, para adicionar uma pressão adicional para manter a pinça pluma numa posição fechada em torno da aranha, uma vez introduzida. </li><li> Anexar positivo clipe jacaré eletrodo de ponta inferior &#39;fórceps a montante da linha e anexar jacaré negativo para diminuir agulha vácuo metal. </li&gt; <li> Circuito de teste atual com voltímetro, colocando liderança positiva sobre fórceps pino entre o fio ea garra jacaré e colocando liderança negativa na agulha vácuo sem corte. Pressione o pedal para garantir corrente suficiente é detectado e remover leads se corrente suficiente é detectado. </li><li> Prepare vários tubos microcapilares para coleta de veneno. Segurar um único tubo microcapilar em uma extremidade com uma mão enluvada e na outra extremidade com uma pinça de metal estéreis, colocando a extremidade fórceps mantidos horizontalmente ao longo de um queimador de chama de Bunsen. Puxe a microcapilar com a pinça de metal longe da chama para criar uma ponta alongada, enquanto segura a outra extremidade em uma posição estacionária. Nota: usar óculos de proteção como microcapilares pode facilmente fratura. </li><li> Descanse microcapilares preparados em uma tira de massa de montagem em uma placa de Petri. Examine microcapilar termina sob um microscópio de dissecação e criar uma abertura pequena, chanfrado na extremidade puxado com uma pinça de metal esterilizados. </li><li> Lanúmero variável de bel estéreis 0,5 ml tubos. Adicionar água estéril, desionizada estéril para tubos (por exemplo, 5 ul de água desionizada autoclavada). Fechar os tubos e colocar os tubos no gelo. </li><li> Preparar a solução salina numa proveta e preencher um segundo copo com água autoclavada. </li></ol> 3. Imobilização de Aranha em Fórceps <ol><li> Ligue CO 2 tanque e transferir aranha de plástico recolhendo frasco fechado (veja a lista de materiais) em CO 2 câmara usando uma pinça de metal longos. Nota: aranhas viúva-negra tem veneno perigoso; sempre usar luvas durante este protocolo. </li><li> Mantenha aranha na câmara de 5-10 min ou até anestesiado e não se mover quando gentilmente cutucou com uma pinça longa. Use pipeta de transferência para molhar rosca na pinça com solução salina. Nota: Para obter diretrizes sobre CO 2 parâmetros de anestesia para viúvas negras, consulte Spagna e Moore 19. </li><li> Recuperar aranha anestesiado de CO 2câmara por pegá-la pelas suas pernas anteriores usando uma pinça de dissecação contundentes e as mãos enluvadas. Mova aranha anestesiados a pluma aparelho fórceps. Dentes separados de fórceps pluma fechadas e coloque cefalotórax da aranha entre os dentes e permitir que os dentes para fechar fechada para garantir a aranha é mantido firmemente no lugar, mas não está sendo esmagado. Certifique-se de que a aranha é colocado lado carapaça dorso para baixo (ver Foelix 20 para guia de anatomia aranha), descansando em fio revestido pinos, e no lado ventral da carapaça de frente para o revestimento de plástico, enquanto o eletrodo positivo permanece ligado ao pino de fundo. Trabalhe rapidamente ao manusear aranha. </li><li> Ajuste dissecando ampliação do microscópio, foco e fonte de luz até quelíceras de aranha e as presas são claramente visíveis. </li></ol> 4. Venom coleção <ol><li> Ligue vácuo e spray quelíceras aranha com solução de água usando um segundo sem corte da seringa needle. Sucção fora a água com agulha de vácuo para remover as impurezas. </li><li> Toque na agulha de vácuo com eletrodo negativo ligado à tribuna aranha e entregar pulso com pedal uma ou mais vezes. Vacuum longe regurgitar, se necessário. Nota: tribuna aranha é dentro da boca para posterior quelíceras na superfície dorsal entre quelíceras e endites (ver Foelix 20 para anatomia aranha detalhada). Nota: A cada pulso, pernas contrato de aranha, e veneno será visível como gotículas claras emergentes de presas. </li><li> Colete veneno gotas com ponta microcapilar e transferência de ponta capilar em tubo 0,5 ml com água ou solução tampão (solução será sugado para capilar). Nota: evitar a perfuração de aranha com capilar que pode levar à contaminação hemolinfa e morte. Também evitar a contaminação do capilar com seda e cola das fiandeiras. </li><li> Anexar transferência seringa com adaptador tubo para microcapilar (pelo lado oposto à ponta coleção) e dsolução de veneno ispense de volta para dentro do tubo. Colocar o tubo em gelo. Nota: Descarte de capilares de resíduos em um recipiente para objectos cortantes nas proximidades. </li><li> Coloque aberto plástico coleta frasco, juntamente com a sua tampa, perto da aranha. Segure cuidadosamente as pernas de aranha com uma pinça de dissecação sem corte realizado em uma das mãos e dos penas cuidadosamente aberto forceps dentes com a outra mão, deslizando aranha em recolher frasco com uma pinça sem corte e fechar rapidamente cap. Continue com a próxima aranha e armazenar contendo veneno de tubos em freezer -80 ° C quando terminar. Nota: continuar a exercer cuidado ao mover a aranha das pinças para dentro do frasco. Certifique-se o frasco de coleta e boné é perto para a aranha para a sua transferência rápida e usar luvas. </li></ol> 5. Venom Gland dissecções <ol><li> Dois a três dias após a colheita veneno, anestesiar aranha em CO 2 câmara (veja o passo 3.1). Preencha transportador de nitrogênio líquido e coloque ao lado do microscópio de dissecação. Nota: when trabalhar com nitrogênio líquido, proteção ocular e uso luvas criogênicas. </li><li> Área de dissecção limpo e dissecando fórceps com uma solução que elimina RNase e DNA contaminação. Encha uma pequena placa de Petri sob microscópio de dissecação com dissecando tampão (por exemplo, citrato de sódio salino-1x (SSC) buffer). </li><li> Transferência de aranha a partir de CO 2 câmara a placa de petri e utilize uma pinça para separar rapidamente o cefalotórax do abdômen. </li><li> Segure o cefalotórax sob o microscópio de dissecação com uma pinça e posicionar o quelíceras em campo de visão. Use as pontas afiadas de um segundo par de pinças para cortar cutícula juntar a carapaça para os aspectos laterais do quelíceras. Lateralmente apreender o quelíceras usando o segundo par de fórceps, e gentilmente puxar para trás e para frente até glândulas de veneno são puxados para fora. </li><li> Glândulas separado do quelíceras (ou deixe ligados a quelíceras se desejado) e transferir para um tubo cyrosafe 0,5 ml. Coloque clostubo ed em nitrogênio líquido. Nota: cada dissecção não deve demorar mais do que 15 min. </li><li> Repita dissecção com aranhas adicionais até terminar. Tubos de transferência de nitrogênio líquido em freezer -80 ° C. </li></ol>

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O autor não tem nada a divulgar e sem interesses financeiros concorrentes.

Venenos representam uma fonte importante de proteínas fisiologicamente reactivos, peptídeos e outras moléculas com aplicações para a descoberta de medicamentos, bem como para a pesquisa de aspectos fundamentais celular e ecológico 1-3. No entanto, a coleta de veneno, principalmente de animais perigosos ou pequenos, é uma tarefa desafiadora. Este protocolo demonstra como veneno e veneno de glândulas podem ser coletadas de aranhas viúva-negra, e confirma o sucesso desta abordagem através de uma combinação de análise mudpit do veneno e um banco de dados de proteínas derivadas de cDNAs clonados a partir de veneno de glândulas 21. Embora este protocolo funciona bem para as viúvas negras e médio porte, as aranhas têm sido empregadas outras técnicas de coleta de veneno para maior migalomorfas aranhas (tarântula-like), como a aspiração direta do veneno das presas em vidro pipetas por exemplo, 24. Esta última abordagem, no entanto , não vai funcionar bem para as aranhas de menor porte que não são aggressive. Um aspecto especialmente crítico do protocolo de coleta de veneno aqui descrito é a fase inicial de preparação e otimização do processo de coleta para que se torne mais rotineira, consistente e mais rápido. O protocolo é inicialmente difícil de dominar, mas com tentativas repetidas, torna-se mais fácil e mais rápido. Atenção também é impelida em todas as fases críticas que envolvem a manipulação de aranhas perigosas, a utilização de corrente eléctrica, de ponta fina de vidro micro-capilares, e agulhas de seringa. É importante usar equipamentos de proteção individual apropriado, como luvas de borracha nitrílica, um jaleco, calças compridas e sapatos fechados, assim como óculos de moldar micro capilares. Outro aspecto desafiante para recolha de veneno é a pequena quantidade de veneno produzido por qualquer uma aranha, particularmente espécies Latrodectus, a partir do qual as quantidades recolhidas podem ser liMITED para 1-2 microlitros por indivíduo na melhor das hipóteses. A obtenção de veneno suficiente para aplicações a jusante, tais como géis de proteína ou ensaios funcionais podem exigir a combinação de veneno de várias pessoas em um tubo. Nesses casos, o veneno só deve ser combinada de indivíduos do mesmo sexo, estágio ontogenético e população dado o reconhecimento da variabilidade intersexual, desenvolvimento e geográfica em alguns venenos de 25, 26. Aranhas também podem apresentar uma variação considerável na quantidade de veneno produzido entre os indivíduos, onde poucas quantidades podem refletir a recente destruição da glândula. Assim, pode ser conveniente proceder à recolha de veneno de vários dias após a sua última alimentação. Se pouco veneno é libertado, corrente excessiva não devem aplicado à aranha, o que pode causar a ruptura da cutícula, que conduz à contaminação do veneno com hemolinfa ou morte. A contaminação das amostras de veneno com si aranhalk ou humanos fontes também devem ser evitados através da utilização de material estéril ou limpo. Apesar destes desafios, coleção de puro veneno, deixando a aranha viva, é preferível a métodos que obtêm veneno de homogeneizados glândula (que não se separam componentes do veneno de outras proteínas celulares) e matar a aranha. É também crítico para assegurar que as amostras são rapidamente congeladas para prevenir a degradação de proteína. A extração de veneno promove a produção de veneno posterior, estimulando a expressão de genes de veneno na glândula de veneno. Assim, porque este protocolo permite aranhas para sobreviver depleção veneno, suas glândulas podem ser dissecados vários dias mais tarde (matando a aranha) num ponto em que a expressão do gene veneno se espera que seja suficiente para estudos genéticos, tais como clonagem de transcrição 10,11. Várias precauções importantes também devem ser levados em dissecções de glândulas de veneno. A ênfase deve ser colocada sobre o uso do laboratório de equipament e reagentes que são livres de RNases que degradam RNA. Assim, recomenda-se limpe fórceps e outro equipamento não descartável e superfícies com soluções que eliminam RNase e contaminação de ADN. As dissecções deve ser realizado tão rapidamente quanto possível e directamente congeladas para garantir ainda mais a integridade de ARN do tecido. Finalmente, dissecções só deve ser realizado em aranhas anestesiados, após a sua cefalotórax e abdômen são separadas rapidamente. Em conclusão, este artigo fornece um protocolo verificado para obter veneno de aranha e veneno de glândulas. Venom e glândulas de veneno para permitir o isolamento e caracterização de proteínas e de péptidos seus componentes, utilizando abordagens de proteómica e transcriptomic. Além disso, as amostras de veneno pode representar o ponto de ensaios funcionais, os quais determinam o potencial farmacológico biomédica e das suas moléculas constituintes de partida. Quase todas as aranhas produzem veneno, ea grande mergulhadorsidade de componentes do veneno sintetizados por espécies individuais sugere uma vasta diversidade de moléculas de veneno estão ainda a ser descoberto 13. Assim, este protocolo fornece ferramentas para investigar a rica fonte de moléculas biologicamente ativos presentes em venenos de aranha.

Venenos são secreções animais predominantemente injetadas em outro animal para efeitos de predação ou defesa, e também tem aplicações biológicas importantes com relevância biomédica 1-3. Apenas certos animais sintetizar veneno, mas sua produção é taxonomicamente difundida através invertebrados (por exemplo, cnidários, caracóis cone, escorpiões e aranhas) e vertebrados (eg, cobras, alguns peixes e mamíferos), porque ela evoluiu independentemente várias vezes 1,4 . A caracterização bioquímica de venenos tipicamente mostram que eles são constituídos por uma grande variedade de proteínas e péptidos, que em grande parte actuar sobre os sistemas circulatório e nervoso de animais injectados para entregar rapidamente toxinas constituintes 1. Uma pequena fração dos animais peçonhentos podem representar uma ameaça para os seres humanos, em particular as espécies com distribuições sinantrópicos 5. O estudo da composição do veneno e atividades funcionais tem desempenhado um papel importante naa caracterização funcional dos componentes celulares de vertebrados (especialmente canais iônicos neuronais) 6 e na elucidação dos processos celulares fundamentais (por exemplo neurosecreção) 7. Além disso, selecione peptídeos do veneno ter propriedades úteis em contextos biomédicos, incluindo seus usos como tratamentos para o câncer e dor 8,9, e são minados para candidatos leads de drogas e desenvolvimento antiveneno. Venenos também desempenham papéis importantes na ecológico e evolutivo pesquisa 1,4,10,11, assim, a coleta dessas secreções perigosos tem muitas utilidades. Há&gt; 40.000 espécies descritas de aranha (Araneae da ordem), e todos, mas uma das mais de 100 famílias de aranhas possuem glândulas de veneno emparelhados que terminam em presas 12. A alta diversidade de espécies de aranhas sugere que eles representam o maior clade de organismos peçonhentos. No entanto, a caracterização bioquímica de venenos de aranha tem largely concentrada num pequeno número de espécies mais frequentemente associados com o envenenamento humano. Estudos de proteômica e transcriptomic recentes de venenos de aranha indicam que eles normalmente contêm muitas proteínas e peptídeos únicos 2,13,14. Advances in high-throughput sequenciação de ADNc e de espectrometria de massa dos péptidos fingerprinting facilitou enormemente a descoberta destas proteínas do veneno 15. No entanto, esse trabalho começa com a coleta de veneno suficiente e / ou glândulas de veneno das aranhas e documentação detalhada para tais técnicas são poucos 16. Este trabalho apresenta um protocolo para a recolha de veneno e veneno de glândulas de aranhas viúva-negra, que pode ser aplicado às aranhas de tamanho similar. A recolha de veneno separadamente a partir das glândulas permite a identificação de proteínas que são segregadas para o veneno em oposição às proteínas que executam outras funções celulares. As viúvas negras e outra Lespécies atrodectus são amplamente reconhecidos como estando entre as aranhas mais perigosas devido ao seu veneno altamente neurotóxico, o que provoca dor severa em humanos, o que às vezes é acompanhada de sudorese profusa, contrações musculares, hipertensão arterial, dificuldade respiratória e paralisia desigual 5. O protocolo de coleta de veneno aqui apresentada utiliza electro-estimulação de fornecer corrente elétrica para aranhas anestesiados para provocar contrações musculares e liberação de veneno. Gotas de veneno são rapidamente recolhidos com micro-capilares e em tubos para armazenamento congelador. Como o protocolo envolve procedimentos perigosos, que só deve ser realizado por indivíduos bem treinados e cautela é instado a passos fundamentais. O veneno coletado tem inúmeras utilizações, como a caracterização e isolamento de moléculas constituintes 2, para experimentos fisiológicos ou ensaios funcionais 18, e estimular a expressão do gene veneno 11. O protocolo termina com uma description de dissecção glândula de veneno e preservação útil para a clonagem de genes específicos de veneno, a expressão de que foi demonstrado que ocorrem 2-3 dias seguintes depleção veneno em diferentes aranhas 10,11.

<table><tbody><tr><td>Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator)&amp;nbsp;</td><td>Grass Technologies</td><td>SD9</td><td>http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html</td></tr><tr><td>Voltmeter</td><td>RadioShack</td><td>22-223</td><td>any generic voltmeter/multimeter can be substituted</td></tr><tr><td>Pointed Featherweight Forceps</td><td>Bioquip</td><td>4748</td><td></td></tr><tr><td>Plasti Dip</td><td>Performix</td><td></td><td>Available at Ace Hardware</td></tr><tr><td>25 G x 1&amp;#189; in Precision Glide hypodermic syringe needle</td><td>BD Medical</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum filter flask 1 L</td><td>Nalgene</td><td>DS4101-1000</td><td>smaller flask sizes may also work</td></tr><tr><td>Buchner Two Piece funnel, 90 mm</td><td>Nalgene</td><td>4280-0900</td><td></td></tr><tr><td>5 &amp;#956;l Capillary Bores (Micro capillaries)</td><td>VWR</td><td>53508-375</td><td></td></tr><tr><td>Mounting putty strip&amp;nbsp;</td><td>Loctite</td><td></td><td>Available at Ace Hardware</td></tr><tr><td>Fisherbrand General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in.</td><td>Fisher</td><td>10-316C</td><td></td></tr><tr><td>SSC Buffer, 20x (pH 7.0), Molecular Grade</td><td>Promega</td><td>V4261</td><td>can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate)</td></tr><tr><td>Eppendorf safe-lock tubes 0.5 ml tubes (cryogenic safe)</td><td>Eppendorf</td><td>22363611</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Dewar, 1 L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask</td><td>Thermo Scientific</td><td>4150-1000</td><td></td></tr><tr><td>Rnase Away</td><td>VWR</td><td>53225-514</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps)</td><td>EMS</td><td>78310-0</td><td>similar high-quality fine point forceps can be substituted</td></tr><tr><td>Foot switch/pedal</td><td>Linemaster Switch Corp.</td><td>491-S</td><td></td></tr><tr><td>Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches</td><td>VWR</td><td>21570-007</td><td>similar models could be substituted</td></tr><tr><td>Clamp Holder</td><td>VWR</td><td>89084-746</td><td>similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod</td></tr><tr><td>Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder)</td><td>VWR</td><td>300042-270</td><td>similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted</td></tr><tr><td>Plastic Collecting Vials (large/40 dram)</td><td>Bioquip</td><td>8940</td><td></td></tr><tr><td>Cotton sewing thread</td><td>Joann fabric and craft store</td><td>7245855</td><td>similar product could be substituted</td></tr></tbody></table>

extraction of venom and venom gland microdissections from spiders for proteomic and transcriptomic analyses

Venenos de secreções são quimicamente complexas que compreendem tipicamente numerosas proteínas e péptidos com as actividades fisiológicas variadas. Caracterização funcional de proteínas do veneno tem aplicações biomédicas importantes, incluindo a identificação de leads de drogas ou sondas para receptores celulares. As aranhas são os mais ricos em espécies do clado organismos venenosos, mas os venenos de apenas algumas espécies são bem-entendido, em parte devido à dificuldade associada com a coleta de pequenas quantidades de veneno de animais de pequeno porte. Este trabalho apresenta um protocolo para a coleta de veneno de aranhas, usando estimulação elétrica, o que demonstra o procedimento no viúva negra ocidental (hesperus Latrodectus). O veneno coletado é útil para análises jusante variadas, incluindo a identificação direta proteína através de espectrometria de massa, testes funcionais, e estimulação da expressão do gene veneno para estudos transcriptomic. Esta técnica tem a vantagem sobre os protocolos que isoveneno tarde a partir de homogenatos de glândulas integrais, que não se separam componentes do veneno genuínos de proteínas celulares que não são secretadas como parte do veneno. Os resultados representativos demonstrar a detecção de peptídeos do veneno conhecido da amostra coletada, utilizando espectrometria de massa. O procedimento de recolha de veneno é seguido por um protocolo para dissecar glândula de veneno de aranha, com resultados demonstrando que isto conduz à caracterização de proteínas e péptidos expressos-venom ao nível da sequência.

A coleção de veneno e glândula de veneno dissecções são realizados com freqüência para caracterizar proteínas do veneno e peptídeos no nível seqüência 10,11,15. Recolhidas veneno também podem ser utilizados em ensaios fisiológicos para determinar as suas actividades funcionais 18. A recolha de veneno irá estimular a expressão do gene glândula de veneno, facilitando, assim, a clonagem de transcritos específicos de toxina através de RT-PCR 10,11. Identificação de proteínas do veneno também pode ser conseguida de uma maneira de alto rendimento, integrando técnicas de espectrometria de massa padrão com bases de dados de sequências geradas a partir de bibliotecas de cDNA da glândula de veneno 15,21. Um exemplo deste tipo de trabalho, a partir de veneno de glândulas e recolhidos utilizando o protocolo detalhado acima, demonstrando a sua eficácia, é ilustrada na Figura 1. Venom coletadas de L. fêmeas adultas hesperus foi digerida com tripsina e sujeita a uma solução deAnálise mudpit, que liga HPLC (cromatografia líquida de alto desempenho) a espectrometria de massa em tandem (MS / MS). Aqui, a análise mudpit foi realizada pela Universidade do Arizona Proteomics Consortium. Massas de peptídeos detectados e seus fragmentos dissociados (íons filha, inferidas a partir de espectros) foram comparadas com sequências de peptídeos teoricamente previstos a partir de traduções de seqüências de DNA obtidos a partir de uma biblioteca de expressão de genes construídos a partir de L. hesperus glândulas de veneno (glândulas foram adquiridos pelo protocolo de dissecação descrito acima) 21. Nesta experiência, 36 proteínas foram detectadas a partir de todos os espectros recolhidos, no limiar de probabilidade de 99,9%, e continha pelo menos um péptido detectado. Uma das proteínas detectadas é suportado por 43 espectros total (espectros exemplar mostrada na Figura 1A), correspondente a três peptídeos exclusivos, cobrindo 35% da sequência da proteína (Figura 1B). A proteína detectada (traduzido a partir de um collecte<html> d cDNA) tem um hit BLASTp cima para latrodectin de L. tredecimguttatus (número de acesso GenBank P49125.1), com uma pontuação de e-2e-46, e partes de 80% de identidade ao nível da sequência de aminoácidos com a proteína detectado nesta experiência. Latrodectin, que é também conhecida como proteína de baixo peso molecular, alfa-latrotoxina, é um componente do veneno reconhecido de viúva negra aranhas 22, 23, a verificação da eficácia do protocolo apresentado. Algumas proteínas identificadas a partir do veneno correspondem a sequências para as quais não hit BLAST é encontrado. Não está claro se tal resultado é devido aos recursos limitados disponíveis para genômicas aranhas, bem como a informação funcional limitada de suas proteínas, ou porque a proteína desconhecida representa um contaminante veneno. No entanto, a expressão do gene ou proteína analisa examinando a abundância de uma nova proteína, tais glândulas de veneno em relação a outros tecidos deveria revelar se se trata de um componente do veneno genuína. ent &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="A Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51618/51618fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1: peptídeo Latrodectin identificados a partir de veneno de viúva negra usando espectrometria de massa (A) espectros Representante (um de 43) detectado via MS / MS porção de análise mudpit de L.. hesperus veneno que foi atribuído a tradução predita de uma sequência de cDNA mostrada na parte recolhido B. Spectra mostra razão massa por carga (m / z) de iões filha detectados no eixo horizontal produzido por fragmentação de péptido progenitor (CGEEDFGEEIVK), com as letras no topo indicando a sequência de péptido com base em massas de iões filha. (B) Sequência de proteína para a qual os espectros na parte A foi atribuído, mostrando em vermelho, negrito e sublinhado texto correspondente sequência de espectros a mostrada na parte A, texto vermelho adicional (não negrito) representa um outro péptido nesta proteína detectada com outro sp recolhidoectra. A sequência proteica é traduzido a partir de uma sequência de cDNA obtido a partir de glândulas de veneno dissecados.

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Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Este artigo fornece um protocolo para a extração de veneno de aranhas, usando estimulação elétrica, a fim de 1) realizar a caracterização proteômica, 2) estimular a expressão de genes da glândula de veneno, e 3) realizar estudos funcionais de venenos. Isto é seguido por uma descrição de microdissecações glândula de veneno para estudos de expressão gênica.

Extração de Venom e Venom Gland microdissecações de Aranhas para proteômica e análise do transcriptoma

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

extraction-venom-venom-gland-microdissections-from-spiders-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

33.3K visualizações.  University of Massachusetts Lowell.  Este artigo fornece um protocolo para a extração de veneno de aranhas, usando estimulação elétrica, a fim de 1) realizar a caracterização proteômica, 2) estimular a expressão de genes da glândula de veneno, e 3) realizar estudos funcionais de venenos. Isto é seguido por uma descrição de microdissecações glândula de veneno para estudos de expressão gênica. 

Vídeo: Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Separação eletroforética de proteínas

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Biologia

Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, and the majority of extant heteropterans retain this trophic strategy. Some heteropterans have transitioned to feeding on vertebrate blood (such as the kissing bugs, Triatominae; and bed bugs, Cimicidae) while others have reverted to feeding on plants (most Pentatomomorpha). However, with the exception of saliva used by kissing bugs to facilitate blood-feeding, little is known about heteropteran venoms compared to the venoms of spiders, scorpions and snakes.
One obstacle to the characterization of heteropteran venom toxins is the structure and function of the venom/labial glands, which are both morphologically complex and perform multiple biological roles (defense, prey capture, and extra-oral digestion). In this article, we describe three methods we have successfully used to collect heteropteran venoms. First, we present electrostimulation as a convenient way to collect venom that is often lethal when injected into prey animals, and which obviates contamination by glandular tissue. Second, we show that gentle harassment of animals is sufficient to produce venom extrusion from the proboscis and/or venom spitting in some groups of heteropterans. Third, we describe methods to harvest venom toxins by dissection of anaesthetized animals to obtain the venom glands. This method is complementary to other methods, as it may allow harvesting of toxins from taxa in which electrostimulation and harassment are ineffective. These protocols will enable researchers to harvest toxins from heteropteran insects for structure-function characterization and possible applications in medicine and agriculture.

Although many insects in the suborder Heteroptera (Insecta: Hemiptera) are venomous, their venom composition and the functions of their venom toxins are mostly unknown. This protocol describes methods to harvest heteropteran venoms for further characterization, using electrostimulation, harassment, and gland dissection.

Colheita de toxinas de veneno de barbeiros e outros insetos Heteropteran

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, ...

Ambiente

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

A microfluídica digital para processamento automatizado Proteômica

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

Indução toxina e Extração de Proteínas de Fusarium Spp. Culturas de Estudos Proteômica

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential for designing new molecular tools. Sea anemone venom locates in glandular cells from ectoderm and sub-cellular structures called nematocysts, both of which are distributed throughout the sea anemone body. This characteristic implies challenges because the cells and nematocyst must be lysed to release the venom components with other non-toxic molecules. Therefore, first, the venom is derived from a crude extract (mixture of different and diverse molecules and tissue debris). The next step is to detect polypeptides with specific bioactivities. Here, we describe an efficient strategy to obtain the sea anemone crude extract and bioassay to identify the presence of cytolysins. The first step involves inexpensive and straightforward techniques (stirred and freeze-thaw cycle) to release cytolysins. We obtained the highest cytolytic activity and protein (~500 mg of protein from 20 g of dry weight). Next, the polypeptide complexity of the extract was analyzed by SDS-PAGE gel detecting proteins with molecular weights between 10 kDa and 250 kDa. In the hemolytic assay, we used sheep red blood cells and determined HU50 (11.1 &plusmn; 0.3 &#181;g/mL). In contrast, the presence of phospholipases in the crude extract was determined using egg yolk as a substrate in a solid medium with agarose. Overall, this study uses an efficient and inexpensive protocol to prepare the crude extract and applies replicable bioassays to identify cytolysins, molecules with biotechnological and biomedical interests.

Here, we describe a protocol to obtain crude venom extract from sea anemone and detect its hemolytic and phospholipase activity.

Identificação da Atividade Hemolítica e Fosfolipase em Extratos Brutos de Anêmonas do Mar por Bioensaões Simples

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential ...

Bioquímica

Parasitização artificial do hospedeiro por Trichogramma dendrolimi e extração de veneno

Extracting Venom from the Parasitoid Wasp Trichogramma dendrolimi Using an Artificial Host

Parasitoid wasps are a diverse group of hymenopteran insects that serve as invaluable resources for pest biocontrol. To ensure successful parasitism, parasitoid wasps inject venom into their hosts to suppress their hosts&#39; immunity, modulate hosts&#39; development, metabolism, and even behavior. With over 600,000 estimated species, the diversity of parasitoid wasps surpasses that of other venomous animals, such as snakes, cone snails, and spiders. Parasitoid wasp venom is an underexplored source of bioactive molecules with potential applications in pest control and medicine. However, collecting parasitoid venom is challenging due to the inability to use direct or electrical stimulation and the difficulty in dissection because of their small size. Trichogramma is a genus of tiny (~0.5 mm) egg parasitoid wasps that are widely used for the biological control of lepidopteran pests in both agriculture and forests. Here, we report a method for extracting venom from T. dendrolimi using artificial hosts. These artificial hosts are created with polyethylene film and amino acid solutions and then inoculated with Trichogramma wasps for parasitism. The venom was subsequently collected and concentrated. This method enables the extraction of large amounts of Trichogramma venom while avoiding contamination from other tissues caused by dissection, a common issue in venom reservoir dissection protocols. This innovative approach facilitates the study of Trichogramma venom, paving the way for new research and potential applications.

Autor em destaque: Método eficiente de extração de veneno de vespas parasitóides Trichogramma 

Here, we present a protocol for extracting venom from Trichogramma dendrolimi using an artificial host created with polyethylene film and amino acid solution.

Extração de veneno da vespa parasitoide Trichogramma dendrolimi usando um hospedeiro artificial

Parasitoid wasps are a diverse group of hymenopteran insects that serve as invaluable resources for pest biocontrol. To ensure successful parasitism, ...

Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

Modern spiders spin high-performance silk fibers with a broad range of biological functions, including locomotion, prey capture and protection of developing offspring 1,2. Spiders accomplish these tasks by spinning several distinct fiber types that have diverse mechanical properties. Such specialization of fiber types has occurred through the evolution of different silk-producing glands, which function as small biofactories. These biofactories manufacture and store large quantities of silk proteins for fiber production. Through a complex series of biochemical events, these silk proteins are converted from a liquid into a solid material upon extrusion.
Mechanical studies have demonstrated that spider silks are stronger than high-tensile steel 3. Analyses to understand the relationship between the structure and function of spider silk threads have revealed that spider silk consists largely of proteins, or fibroins, that have block repeats within their protein sequences 4. Common molecular signatures that contribute to the incredible tensile strength and extensibility of spider silks are being unraveled through the analyses of translated silk cDNAs. Given the extraordinary material properties of spider silks, research labs across the globe are racing to understand and mimic the spinning process to produce synthetic silk fibers for commercial, military and industrial applications. One of the main challenges to spinning artificial spider silk in the research lab involves a complete understanding of the biochemical processes that occur during extrusion of the fibers from the silk-producing glands.
Here we present a method for the isolation of the seven different silk-producing glands from the cobweaving black widow spider, which includes the major and minor ampullate glands [manufactures dragline and scaffolding silk] 5,6, tubuliform [synthesizes egg case silk] 7,8, flagelliform [unknown function in cob-weavers], aggregate [makes glue silk], aciniform [synthesizes prey wrapping and egg case threads] 9 and pyriform [produces attachment disc silk] 10. This approach is based upon anesthetizing the spider with carbon dioxide gas, subsequent separation of the cephalothorax from the abdomen, and microdissection of the abdomen to obtain the silk-producing glands. Following the separation of the different silk-producing glands, these tissues can be used to retrieve different macromolecules for distinct biochemical analyses, including quantitative real-time PCR, northern- and western blotting, mass spectrometry (MS or MS/MS) analyses to identify new silk protein sequences, search for proteins that participate in the silk assembly pathway, or use the intact tissue for cell culture or histological experiments.

Here we describe an efficient strategy to remove the silk-producing glands from the abdomen of female black widow spiders. This procedure allows the rapid isolation of the seven distinct silk-producing glands in a highly purified fashion, an important process for investigators studying spider silk production and fiber assembly.

Microdissecção de Black Widow Aranha Silk glândulas produtoras de

Modern spiders spin high-performance silk fibers with a broad range of biological functions, including locomotion, prey capture and protection of ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

High Throughput Screening expressão quantitativa e Purificação Aplicada à recombinante Dissulfeto ricos em proteínas veneno produzido em<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Extração de Venom e Venom Gland microdissecações de Aranhas para proteômica e análise do transcriptoma

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Extração de veneno da vespa parasitoide Trichogramma dendrolimi usando um hospedeiro artificial

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