Este trabalho foi financiado por uma doação RUI NSF MCB-0950372 Caracterização Molecular de direito Silks aranha viúva negra.

1. Anestesiar a aranha e isolamento do abdômen <ol><li> Transferência a aranha a partir de um frasco de vidro em uma caixa de papelão forrada com plástico (Figura 1A). Normalmente, coletamos as aranhas de woodpiles, garagens ou arbustos e abrigá-los no laboratório em frascos de vidro. Porque a aranha não pode subir o revestimento de plástico, ela fornece um método eficiente para transferir a aranha a partir de uma jarra de vidro ou lata de café em um pequeno frasco para fins de anestesia. Ao manusear a aranha, neste ponto, você deve estar usando dois pares de luvas de látex ou luvas de jardinagem para fins de segurança. </li><li> Enquanto a aranha está na caixa forrada com plástico, a abordagem da aranha a partir de sua parte traseira e deixar o slide aranha dentro do frasco de cultura de plástico. Após a aranha entra no frasco, coloque imediatamente a ficha sobre a parte superior (Figura 1B). Recomendamos o uso de um frasco que é de aproximadamente 101,6 milímetros x 31,75 milímetros (L x D). Isso minimiza a quantidade de gás dióxido de carbono necessário para a etapa de anestesiar. </li><li> Anestesiar a aranha com a introdução do gás dióxido de carbono em 5-10 libras por polegada quadrada de 10 min (Figura 1C). Esta quantidade de gás só vai bater o spider para fora por cerca de 5 min, então depois de anestesiados você deve imediatamente proceder a passos 1,4-1,5. </li><li> Coloque o spider anestesiados em um prato dissecção pequenas e utilize uma pinça para posicionar a aranha acima do lado dorsal (ampulheta vermelha virada para baixo). </li><li> O clipe (caule estreito que liga o cefalotórax e abdômen) pedicelo para liberar o abdômen do resto da aranha (Figura 1D). Armazenar o cefalotórax no freezer durante a noite em uma placa de Petri e descartar após congelados no dia seguinte. Tenha cuidado ao mover o cefalotórax como as presas da aranha estão presentes neste segmento. </li><li> Aperte o abdômen ao material Sylgard no prato dissecção pequena com um pino único inseto. Insira o pino de insetos através do buraco feito a partir do clipping pedicelo (Figura 1E). Isto pode ser facilmente identificado como o local onde o fluido está surgindo a partir do recorte da pedicelo. Verifique se o fieira (extremo oposto do pedicelo) é orientada em direção ao fundo (mais próximo de você). </li></ol> 2. Remoção do exoesqueleto <ol><li> Fazer a primeira incisão através do exoesqueleto usando um par de microtesoura, começando no buraco do clipping pedicelo. Cortar lateralmente até que o lado dorsal é alcançado em ambos os lados (Figura 1F). Usando um par de fórceps, descascar segmento exoesqueleto anterior e inserir um segundo pino neste local. Após a inserção do segundo pino, vire a bandeja de dissecação caudalmente (ângulo de 90 °) de os cortes iniciais lateral e continue até que a corte fiandeiras são atingidos (Figura 1G). Esta incisão será perpendicular ou vertical para o corte inicial lateral. Não cortar o fieiras quando a incisão vertical é feita (em relação posterior à ampulheta e ele tem uma aparência circular). Deixar de inserir o segundo pino resultará no abdômen girando quando as incisões verticais são realizadas. </li><li> Submergir o abdômen em dissecar solução tampão (0,1 M de cloreto de sódio, citrato de sódio 0,015 M, 0,1% dietílico Pyrocarbonate). </li><li> Descasque as restantes exoesqueleto de volta a partir da incisão inicial, lateral. Quando isso estiver concluído, o tecido adiposo deve ser claramente visível (Figura 1H). </li></ol> 3. Isolamento das glândulas produtoras de seda <ol><li> Forceps usando começam teasing afastado a camada de gordura (Figura 1H). A gordura vai ter um esbranquiçada à aparência amarelada. Continue até que a maioria da gordura é removida e as glândulas de seda são claramente visíveis. A glândula tubuliform consiste em três pares de muito tempo, os tubos cilíndricos que são abundantes na cavidade abdominal. O ampullate principais, que é encontrado em pares, é uma ampola grande crescente, em forma com uma cauda longa complicado distal e proximal de um duto que diminui de largura medida que se aproxima fiandeiras da aranha. O ampullate menores é muito semelhante na morfologia do ampullate grande, mas é significativamente menores. A glândula flagelliform, ocorrendo também em pares, é redondo e multilobular com uma pequena cilíndrica zig-zag duto que se estende em direção ao fiandeiras. A glândula agregado (encontrado em pares) é uma grande glândula, multilobular que tem um duto excretor muito grande que tem grandes lobos irregular nele. As glândulas aciniform ocorrem em grande número e se assemelham a curto, projeções semelhantes a dedos pequenos. A glândula piriforme é a menor da glândula no abdômen e tem muitas compactado, dutos cilíndricos que se assemelham a um ventilador com muitos pequenos ductos excretores que se estendem até o fiandeiras. </li><li> Recomendamos a remoção das glândulas, na seguinte ordem: tubuliform, ampullate principais, flagelliform, ampullate menor, agregado, aciniform, e então o piriforme (Figura 2A-B). </li><li> Começando com o tubuliform, provocar estas glândulas fora do resto do diae glândulas - que deveria estar sentado em cima da outras glândulas (Figura 2A). Há três pares de glândulas tubuliform em uma única aranha. Lhes permitem free float, mas permanecem ligados à sua fiandeiras por seus dutos. </li><li> Em seguida, provocar longe das glândulas ampullate principais. Existem duas glândulas ampullate principais presentes em uma aranha. Durante o procedimento de remoção, certifique-se os dutos permanecer solidários com as glândulas (Figura 2A). </li><li> Continuar a provocar o resto das glândulas longe um do outro, trabalhando com cuidado para evitar qualquer punção das glândulas, especialmente agregado e glândulas flagelliform. Cada glândula deve ser livre flutuação todo o caminho até o seu ponto de saída no exoesqueleto ao fiandeiras. Estas glândulas são encontrados também em pares. Retire cada glândula apertando o duto com uma pinça e cuidadosamente puxando até que rompe com o ponto de saída. O ampullate principais, flagelliform, ampullate menor, e as glândulas agregados são encontrados em pares. As glândulas aciniform piriforme e ocorrem em muitos mais pares. </li><li> Retire cada glândula apertando o duto com uma pinça e cuidadosamente puxando até que rompe com o ponto de saída para baixo pela fieira. Nós normalmente armazenam as glândulas molhada, no entanto, nós não adicionamos buffer adicional. </li><li> Como as glândulas são removidas, coloque-os em estéreis pré-rotulados tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. Glândulas individuais são mostrados na Figura 3A-G. Manter essas glândulas no gelo e depois congelá-los de flash em nitrogênio líquido. Após o congelamento de flash em nitrogênio líquido, colocá-los a -80 ° C para armazenamento. </li></ol> 4. Resultados representante Ao remover as glândulas diferentes, extremo cuidado deve ser tomado durante o manuseio do flagelliform e glândulas agregado, uma vez que estas duas estruturas podem ser facilmente perfurado e danificados com a pinça. Além disso, é importante notar que morfologicamente as glândulas flagelliform e agregar muito parecidas antes da sua remoção e são frequentemente interligados uns com os outros. Para evitar a contaminação cruzada destes tecidos após a remoção, o dissector deve provocar cuidadosamente estas estruturas separadas. Além disso, após a exposição inicial das glândulas produtoras de seda, as glândulas aciniform piriforme e será o mais difícil de visualizar imediatamente devido ao seu menor tamanho e localização anatômica. Muitas vezes há a presença de muitos ovos. Além disso, cuidado adicional deve ser tomado durante a remoção da glândula piriforme, como este tecido é extremamente pegajoso e, muitas vezes, aderir ao seu fórceps. Quando este procedimento for feito corretamente, é possível obter todas as sete glândulas produtoras de seda a partir de uma única aranha em uma forma altamente purificada. Tipicamente, pode-se recuperar quantidades micrograma de RNA total e proteínas a partir de uma dissecção única aranha. Um exemplo do uso de RNA total de qPCR para examinar os níveis de mRNA de um gene tubuliform fibroína restrito, TuSp1, é mostrada (Figura 4). Experimentos que envolvem proteínas representante lisados ​​coletados das glândulas por exemplo, em solução de digestão tríptica seguido por MS análise (também poderia ser usado para MS / MS análise) ou uma análise da composição de aminoácidos é mostrada (Figura 5-6, respectivamente). <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1a.jpg" alt="Figura 1a" /><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig1e.jpg" alt="Figura 1e" /> Figura 1. Handling, anestesiando, e remoção do exoesqueleto do abdômen de uma aranha viúva negra do sexo feminino. A) Transferência da aranha em caixa de papelão forrada com plástico para facilitar a movimentação da aranha em um frasco pequeno de plástico. B) Spider colocado em um frasco de plástico com tampa. C) A anestesia do aranha com gás dióxido de carbono. D) Separação do cefalotórax do abdômen com microtesoura. E) Imobilização do abdômen na bandeja de dissecação utilizando os pinos de insetos. F) Ver depois de uma incisão lateral é feita com a tesoura e uma parte do exoesqueleto é pealed de volta com uma pinça. G) As incisões feitas perpendicular ao corte inicial lateral. H) Remoção do exoesqueleto e exposição da camada de gordura. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Visualização das sete diferentes glândulas produtoras de seda, enquanto intactas no abdômen da aranha, bem como os tecidos circundantes. A) As imagens do tubuliform, ampullate principais, flagelliform, agregar, tecidos ampullate menores com ampliação de 12X. B) Imagem das glândulas aciniform e piriforme com ampliação de 12X. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3a.jpg" alt="Figura 3a" /><img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig3e.jpg" alt="Figura 3e" /> Figura 3. Fotografias das sete glândulas produtoras de seda após a sua retirada do abdômen. Todas as imagens foram capturadas em 20X de ampliação com a exceção do aciniform e glândulas piriforme, que foram feitas em 40X. A major)ampullate glândula; B) ampullate maiores e menores (lado direito) para comparação de tamanho; C) tubuliform; D) flagelliform; E) agregado; F) aciniform; G) piriforme. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Os resultados representativos do padrão de expressão do gene de seda, TuSp1, após levantamento da TuSp1 níveis de mRNA em diferentes glândulas produtoras de seda (excepto a glândula piriforme), utilizando quantitativa PCR em tempo real de isolamento (qPCR), seguindo de RNA total de as glândulas. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Exemplo de MS a análise de extratos proteicos obtidos a partir da glândula piriforme seguir em solução de digestão tríptica. Nota: x2 representa duas vezes a ampliação da intensidade do espectro. Massas espectro de íons peptídeo que correspondem às regiões da fibroína PySp1 são mostrados com o símbolo #. <img src="/files/ftp_upload/2382/2382fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Resultado típico do perfil de composição de aminoácidos das proteínas extraídas da glândula tubuliform. Nota: ASX = Asp e Asn; GLX = Glu e Gln. Coloração azul reflete aminoácidos com grupos de cadeia lateral polar enquanto coloração vermelha representa resíduos de aminoácidos com grupos apolares cadeia lateral.

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	<li>Vollrath, F., Knight, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).</li><li>Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Exp. Biol. 202, 3295-3295 (1999).</li><li>Gosline, J. M., DeMont, M. E., Denny, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Endeavour. 10, 31-31 (1986).</li><li>Hinman, M. B., Jones, J. A., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Trends Biotechnol. 18 (9), 374-374 (2000).</li><li>Lewis, R. V., Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).</li><li>Colgin, M. A., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).</li><li>Tian, M., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Appl. Phys. A-Mater. 82, 265-265 (2006).</li><li>Hu, X., Lawrence, B., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. 44 (30), 10020-10020 (2005).</li><li>Vasanthavada, K., Hu, X., Falick, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Biol Chem. 282 (48), 35088-35088 (2007).</li><li>Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mol. Biol. Evol.. 21 (10), 1950-1950 (2004).</li><li>Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Biol Chem. 284 (42), 29097-29097 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nossa metodologia para a microdissecção das glândulas produtoras de seda da aranha viúva-negra oferece um meio eficaz para obter altamente purificada de seda glândulas produtoras. Dissecções podem ser concluídas em 1,5 a 3 horas, resultando em um conjunto completo de sete distintas seda glândulas produtoras de cobweavers. Obtenção altamente purificada de seda glândula-amostras permite os investigadores a capacidade de executar uma ampla gama de estudos bioquímicos, incluindo a identificação de seda novo o...

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>Sodium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EM Science</td>
<td>SX0420-1</td>
<td>0.1 M in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Diethyl pyrocarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D-5758 - 5 ml</td>
<td>0.1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium citrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S1804 - 1 kg</td>
<td>0.015 M in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica Microsystems</td>
<td>Leica MZ16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digital microscope camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica Microsystems</td>
<td>DFC320</td>
<td>Software - Leica Application Suite v2.8.1</td>
</tr>
<tr>
<td>Vannas scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>500260</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless steel forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>501764</td>
<td>Mini Dumont #M5S</td>
</tr>
<tr>
<td>Insect pins</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Indigo Instruments</td>
<td>33414-2</td>
<td>Insect pins #2</td>
</tr>
<tr>
<td>Small or large dissection dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Living Systems Instrumentation</td>
<td>DD-50-S or DD-90-S</td>
<td>52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Drosophila culture vials</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carolina Biological Supply Company</td>
<td>FR-17-3076</td>
<td>Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

microdissection of black widow spider silk-producing glands

Aranhas modernas produzir fibras de alta performance de seda com uma ampla gama de funções biológicas, incluindo locomoção captura de presas e de proteção de desenvolver 1,2 filhos. Aranhas realizar essas tarefas, girando várias tipos de fibras distintas, que têm diferentes propriedades mecânicas. Tal especialização de tipos de fibras ocorreu através da evolução de diferentes glândulas produtoras de seda, que funcionam como biofábricas de pequeno porte. Estes fabricação biofábricas e armazenar grandes quantidades de proteínas da seda para a produção de fibra. Através de uma série complexa de eventos bioquímicos, essas proteínas da seda são convertidos de um líquido em um material sólido em cima de extrusão. Estudos têm demonstrado que a mecânica sedas de aranha são mais fortes que aço de alta resistência 3. Análises para entender a relação entre a estrutura ea função dos fios de seda de aranha têm revelado que a seda da aranha é constituída principalmente de proteínas, ou fibroins, que repete bloco dentro suas seqüências de proteínas 4. Comum assinaturas moleculares que contribuem para a resistência à tração incrível e extensibilidade de sedas de aranha estão sendo desvendados através da análise de cDNAs de seda traduzido. Dadas as propriedades do material extraordinário de aranha sedas, laboratórios de pesquisa em todo o mundo estão correndo para compreender e imitar o processo de fiação para produzir fibras de seda sintética para aplicações comerciais, militares e industriais. Um dos principais desafios a fiação de seda de aranha artificial em laboratório de pesquisa envolve um completo entendimento dos processos bioquímicos que ocorrem durante a extrusão das fibras das glândulas produtoras de seda. Aqui apresentamos um método para o isolamento de sete de produção de seda diferentes glândulas da aranha viúva-negra cobweaving, que inclui as glândulas ampullate maiores e menores [fabrica dragline e andaimes de seda] 5,6, tubuliform [sintetiza seda caso do ovo] 7 , 8, flagelliform [função desconhecida em cob-tecelões], agregada [faz seda cola], aciniform [embrulho presa sintetiza e tópicos caso do ovo] 9 e piriforme [produz apego seda disco] 10. Esta abordagem baseia-se anestesiar a aranha com gás de dióxido de carbono, a separação posterior do cefalotórax do abdômen, e microdissecção do abdômen para obter as glândulas produtoras de seda. Após a separação dos diferentes glândulas produtoras de seda, estes tecidos podem ser usados ​​para recuperar macromoléculas diferentes para distintas análises bioquímicas, incluindo quantitativos PCR em tempo real, no norte e oeste blotting, espectrometria de massa (MS ou MS / MS) analisa a identificar seqüências de seda novas proteínas, pesquisa de proteínas que participam na via montagem de seda, ou usar o tecido para cultura de células intactas ou experiências histológica.

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Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

Aqui nós descrevemos uma estratégia eficiente para remover as glândulas produtoras de seda do abdômen da fêmea aranha viúva negra. Este procedimento permite o isolamento rápido da produção de seda sete diferentes glândulas de uma forma altamente purificada, um processo importante para os investigadores a estudar a produção de seda de aranha e montagem de fibra.

Microdissecção de Black Widow Aranha Silk glândulas produtoras de

Modern spiders spin high-performance silk fibers with a broad range of biological functions, including locomotion, prey capture and protection of ...

microdissection-of-black-widow-spider-silk-producing-glands

Research

JoVE Journal

Biology

15.7K visualizações.  University of the Pacific. Aqui nós descrevemos uma estratégia eficiente para remover as glândulas produtoras de seda do abdômen da fêmea aranha viúva negra. Este procedimento permite o isolamento rápido da produção de seda sete diferentes glândulas de uma forma altamente purificada, um processo importante para os investigadores a estudar a produção de seda de aranha e montagem de fibra.

Vídeo: Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

Dissecção das glândulas salivares e intestino médio de Ae. aegypti mosquitos

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Biologia

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

Laser Microdissecção Captura de tecidos de mamíferos

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Microdissecção de tecidos oculares Zebrafish embrionárias

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. These structures are almost always localized on plant surfaces. Among them are nectaries or glandular trichomes. The secreted compounds are often employed in interactions with the biotic environment, for example as attractants for pollinators or deterrents against herbivores.
Glands that are unique in several aspects can be found in carnivorous plants. In so-called pitcher plants of the genus Nepenthes, bifunctional glands inside the pitfall-trap on the one hand secrete the digestive fluid, including all enzymes necessary for prey digestion, and on the other hand take-up the released nutrients. Thus, these glands represent an ideal, specialized tissue predestinated to study the underlying molecular, biochemical, and physiological mechanisms of protein secretion and nutrient uptake in plants. Moreover, generally the biosynthesis of secondary compounds produced by many plants equipped with glandular structures could be investigated directly in glands.
In order to work on such specialized structures, they need to be isolated efficiently, fast, metabolically active, and without contamination with other tissues. Therefore, a mechanical micropreparation technique was developed and applied for studies on Nepenthes digestion fluid. Here, a protocol is presented that was used to successfully prepare single bifunctional glands from Nepenthes traps, based on a mechanized microsampling platform. The glands could be isolated and directly used further for gene expression analysis by PCR techniques after preparation of RNA.

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Plants glands are specialized structures responsible for the biosynthesis and secretion of many compounds involved in interactions with the biotic environment. To enable studies on their molecular and biochemical features, a mechanical micropreparation technique was established in order to isolate single metabolically active glands, here from the carnivorous plant Nepenthes.

Isolamento de Viável multicelular Glândulas de tecido da planta carnívora, Nepenthes</i

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can also be used to investigate and validate novel techniques and algorithms in volumetric medical imaging and therapies. Creating 3D high-resolution atlases of different organs1,2,3 is another application of histology volume reconstruction. This provides a resource for investigating tissue structures and the spatial relationship between various cellular features. We present an image registration approach for histology volume reconstruction, which uses a set of optical blockface images. The reconstructed histology volume represents a reliable shape of the processed specimen with no propagated post-processing registration error. The Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections of two mouse mammary glands were registered to their corresponding blockface images using boundary points extracted from the edges of the specimen in histology and blockface images. The accuracy of the registration was visually evaluated. The alignment of the macrostructures of the mammary glands was also visually assessed at high resolution.
This study delineates the different steps of this image registration pipeline, ranging from excision of the mammary gland through to 3D histology volume reconstruction. While 2D histology images reveal the structural differences between pairs of sections, 3D histology volume provides the ability to visualize the differences in shape and volume of the mammary glands.

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

Reconstrução de 3-Dimensional Volume Histologia e sua Aplicação para o Estudo de Rato glândulas mamárias

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Método cryosectioning para Microdissection de Murino Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

Roedor Trabalho Modelo do coração para o estudo do desempenho do miocárdio eo consumo de oxigênio

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Isolamento de glândulas mamárias de Mouse intacto, todo para a análise da expressão de matriz extracelular e morfologia da glândula

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are thick-walled dispersal agents. Teliospores can remain dormant for decades. The dormancy is characterized by low metabolic rates, paused macromolecular biosynthesis and greatly reduced levels of respiration. Upon receiving required environmental signals, teliospores germinate to produce haploid cells, which can initiate new rounds of infection. Teliospore germination is characterized by the resumption of macromolecular biosynthesis, increased respiration and dramatic morphological changes. In order to precisely measure changes in cellular respiration during the early stages of germination, we have developed a simple protocol employing a Clark-type respirometer. The later stages of germination are distinguished by specific morphological changes, but germination is asynchronous. We developed a microdissection technique that enables us to collect teliospores at distinct germination stages.

Smut fungi cause many devastating agricultural diseases. They are dispersed as dormant teliospores that germinate in response to environmental cues. We outline two methods to investigate molecular changes during germination: measuring respiration increase to detect metabolic activation and assessing changing molecular events by isolating teliospores at distinct morphological stages.

Investigando a germinação de Teliospore usando a análise de Microrespiration e Microdissection

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are ...

Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ductal epithelial, and myoepithelial cells (MECs). MECs express alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) and have a contractile function. They are found in multiple glandular organs and are of ectodermal origin. In addition, the LG contains SMA+ vascular smooth muscle cells of endodermal origin called pericytes: contractile cells that envelop the surface of vascular tubes. A new protocol allows us to isolate both MECs and pericytes from adult murine LGs and submandibular glands (SMGs). The protocol is based on the genetic labeling of MECs and pericytes using the SMACreErt2/+:Rosa26-TdTomatofl/fl mouse strain, followed by preparation of the LG single-cell suspension for fluorescence activated cell sorting (FACS). The protocol allows for the separation of these two cell populations of different origins based on the expression of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) by MECs, whereas pericytes do not express EpCAM. Isolated cells could be used for cell cultivation or gene expression analysis.

The lacrimal gland (LG) has two cell types expressing &#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA): myoepithelial cells (MECs) and pericytes. MECs are of ectodermal origin, found in many glandular tissues, while pericytes are vascular smooth muscle cells of endodermal origin. This protocol isolates MECs and pericytes from murine LGs.

Isolamento de células mioepiteliais das glândulas lacrimal e submandibular de Murina adulta

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...