Name: an isolated working heart system for large animal models
Uploaded: 2014-06-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
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1. Construção do Aparelho Langendorff (veja a Figura 1) <ol><li> Usando 3/8 tubagem &quot;, ligar o reservatório do coração para o reservatório de sangue. <ol><li> Certifique-se que esta tubulação passa por uma bomba de roletes. NOTA: Isto pode exigir o uso de dois 3/8 &quot;a 1/4&quot; conectores de tubos para criar uma peça de 1/4 &quot;tubulação para passar pela bomba de roletes. </li><li> Conecte o reservatório de sangue para aquecedor / oxigenador com 3/8 tubulação &quot;. </li><li> Use 3/8 tubos &quot;para ligar o aquecedor / oxigenador para um conector-Y. </li><li> Conecte um braço do Y-conector da bomba centrífuga, em seguida, ligue a bomba centrífuga para um segundo conector Y (todos com 3/8 &quot;tubulação). </li><li> Anexar uma peça de 3/8 &quot;da tubagem de fixação de uma válvula hemostática para o braço virada para cima, o que vai servir como uma armadilha de bolhas e através da inserção do transdutor de pressão. </li><li> Fixe um pedaço de 3/8 tubos &quot;para o braço para baixo. Esta parte irá anexar ao aor<html> tic cânula (isto é, a linha de pressão diastólica). </li><li> Conecte o outro braço do Y-conector para a entrada da câmara de pré-carga com 3/8 tubulação &quot;. Assegurar esta tubulação passa por uma segunda bomba de roletes. </li><li> Conecte o excesso de 3/8 tubos &quot;para a saída desta câmara. Esta parte irá anexar ao átrio esquerdo (ou seja, a linha de pré-carga). </li></ol></li><li> Ligar o tanque de oxigénio e um aparelho de aquecimento do aquecedor / oxigenador. </li><li> Prender a linha que vai desde o conector Y para a câmara de pré-carga, que esta linha não será utilizado até que o coração é colocado no modo de funcionamento. </li></ol> 2. Pressão-Volume Cateter Preparação <ol><li> Em um banho de água a 37 C °, aquecer uma garrafa de solução salina. </li><li> Embeber o transdutor de pressão PV e do cateter de condutância na solução salina quente durante pelo menos 30 min. </li><li> Ligue os sistemas de aquisição de dados, permitindo que ambos aquecer por pelo menos 30 min. </li></ol>tle &quot;&gt; 3. Preparando o aparelho Langendorff <ol><li> Ligue o tanque de oxigênio, aparelhos de aquecimento, bomba de roletes que liga os dois reservatórios e bomba centrífuga. O aparelho de aquecimento deve ser definido como a temperatura do corpo do animal (~ 36 ° C). </li><li> Lavar o sangue de acordo com as instruções do fabricante. Velocidades mais lentas de lavagem são recomendados para a remoção mais completa de produtos residuais do sangue (por exemplo, electrólitos em excesso, o material celular lisado). </li><li> Quando o sangue é lavado, verificar o nível de hematócrito antes da hemodiluição. </li><li> Reconstituir os glóbulos vermelhos foram lavados com uma solução salina normal para a concentração desejada do hematócrito (recomendado: 20-25%) e adicionar ao equipamento de Langendorff. </li><li> Ajuste as velocidades das duas bombas para iniciar o fluxo de sangue através do sistema (excluindo a câmara de pré-carga). </li><li> Verificar o pH e eletrólitos da mistura de sangue e ajuste até fisiológico para as espécies utilizadas. NOTA: Para evitar deletério emfluxo de cálcio após a reperfusão, os níveis de cálcio no aparelho de Langendorff deve, inicialmente, ser mantido baixo (0,3-0,5 mmol / L). <ol><li> Se há uma diminuição do hematócrito, com aumento concomitante de potássio, lactato desidrogenase e vá de hemoglobina no plasma livre para descartar a hemólise. </li><li> No caso de hemólise ocorre, garantir que todas as conexões estão firmes e não há áreas de sheering óbvio. </li></ol></li><li> Prenda o cateter Millar no slot pressão secundária do sistema PowerLab. </li><li> Calibra-se o transdutor de pressão de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol> 4. Preparando o coração para fixação do Aparelho Langendorff NOTA: Um coração devidamente preso deve ser usado para todas as grandes experiências em animais envolvendo um sistema de coração isolado. Falta de parada cardioplégica pode danificar o coração de tal forma que ele não vai produzir um trabalho mensurável. Celsior, ou de baixo potássio Univerversidade de Wisconsin é recomendado solução (UW), como não são apenas estas soluções semelhantes aos utilizados clinicamente, mas o baixo nível de potássio da solução ajuda a evitar hipercalemia enquanto no circuito. Volume de solução cardioplégica vai depender do tamanho do coração, com 1 litro suficiente para corações suínos. <ol><li> Remover rapidamente o coração do recipiente de armazenamento, derramar qualquer solução de armazenamento nos ventrículos, secar e pesar. </li><li> Para ajudar a manter a temperatura do miocárdio fria até que o coração está pronto para o Langendorff o coração regressar ao recipiente de armazenamento e orientá-lo de modo a que fique virado para cima da aorta. </li><li> Insira um 3/8 &quot;cânula na aorta e prenda com um zip-tie. </li></ol> 5. Colocação do coração ao Langendorff <ol><li> Diminuir a bomba centrífuga a um gotejamento lento. </li><li> Gotejamento do sangue para a aorta até que ela está cheia de sangue e completamente sem ar. </li><li> Anexar cuidadosamente o c aórticaannula ao tubo aórtico no Langendorff. Anote o tempo de fixação. </li><li> Insira o transdutor de pressão calibrada pela válvula hemostática [DS1] para a aorta nativa. </li><li> Comece medições de pressão e ajustar a velocidade da bomba centrífuga até que a pressão de reperfusão desejado seja alcançado. NOTA: A pressão pode mudar alterações de resistência como coronárias. Portanto, monitorar a pressão aórtica de perto, especialmente durante a reperfusão inicial. </li><li> Aumentar a temperatura na unidade de aquecimento de temperatura intramio é medido a 37 ° C. NOTA: Não haverá um atraso entre os ajustes feitos para unidade de aquecimento e as mudanças nas temperaturas intramiocárdicas. Por isso, as mudanças de temperatura deve ser feito de forma incremental. </li><li> Obter uma linha de base (T = 0) amostra do reservatório de sangue venoso para medir pH, eletrólitos e outras medidas bioquímicas. </li><li> Insira sonda de temperatura em septo e monitorar a temperatura do miocárdio. Diminuir a temperatura da unidade de aquecimentose a temperatura do miocárdio subir acima de 39 ° C. </li><li> Tome amostras de sangue a cada 15 minutos, ajustando os parâmetros fisiológicos, como desejado para o experimento. <ol><li> Adicionar cerca de 1 mmol de cálcio para a solução de sangue a cada 5 minutos, assegurando que o cálcio iónico é&gt; 0,8 mmol / L, antes da iniciação de modo a trabalhar. </li></ol></li></ol> 6. Colocar o coração no Modo de Trabalho <ol><li> Inserir uma cânula de tamanho apropriado para o átrio / veia pulmonar esquerda. Isso pode ser feito com qualquer um sutura em bolsa ou zip-tie, conforme apropriado. </li><li> Feche todos os furos no átrio esquerdo que podem vazar, como outras origens da veia pulmonar com sutura ou grampos, conforme necessário. </li><li> Ajustar a altura da câmara de pré-carga de tal modo que a altura da coluna de pressão dá a pré-carga desejada. NOTA: Supondo que a densidade da mistura de sangue / cristalóide é igual à densidade da água, 1 mmHg = 1.36 cm de distância da válvula aórtica para a parte superior dao nível de sangue no reservatório de pré-carga (p.ex., 15 mm Hg = 20,4 centímetros). </li><li> Soltar o tubo vai para a câmara de pré-carga e começar lentamente a bomba de roletes de pré-carga, permitindo que a câmara de pré-carga e pré-carga da tubulação para encher completamente de sangue. </li><li> Uma vez que o tubo de pré-carga é completamente sem ar, lentamente encher o átrio esquerdo e cânula com sangue. </li><li> Sem permitir que o ar entre no sistema, ligar o tubo de pré-carga para a cânula da auricula esquerda. </li></ol> 7. Obtenção Ventricular pressão-volume (PV) Gravações <ol><li> Siga as instruções do fabricante para a pressão e Rho calibração tina para os sistemas de aquisição de dados. </li><li> Coloque uma sutura em bolsa com uma sutura de polipropileno 3-0 no ventrículo esquerdo (VE) ápice. </li><li> Usando uma agulha 16 G, fazer uma incisão dentro do cordão da bolsa. </li><li> Insira a condutância cateter PV na incisão apical. NOTA: a colocação do cateter Ideal vai depacabam por ter todos os eletrodos de detecção dentro do LV e dois eletrodos de excitação fora do LV. Certifique-se de que um animal de tamanho adequado e cateter foram selecionados (ver Discussão). </li><li> Pressione o botão &quot;Iniciar&quot; no canto superior direito para começar a gravação de dados e determinar quantos segmentos de volume estão ativos. <ol><li> Se todos os segmentos não estão ativos, ajuste a posição do cateter até que todos os segmentos estão ativos. NOTA: torção leve do cateter pode ser necessário para otimizar morfologia laço </li><li> Se não for possível obter sinais em todos os segmentos, ajustar a localização dos eletrodos de excitação e eletrodos de sensoriamento por instruções do fabricante. </li></ol></li><li> Uma vez que a configuração desejada seja obtida, siga as instruções do fabricante para o volume e de calibração alfa. </li><li> Utilizando um cateter devidamente calibrado, se obter, pelo menos, 30 segundos de dados de pressão e volume da linha de base. NOTA: Estes laços pressão-volume irá fornecer volume de dependênciadent medidas da função cardíaca (por exemplo, o débito cardíaco, volume sistólico). <ol><li> Uma vez laços suficientes são obtidos, continuar para o próximo passo, sem parar a gravação de dados, de modo a obter dados de pressão e volume de oclusão. </li></ol></li><li> Ocluir o tubo de pré-carga lentamente com uma braçadeira tubulação. NOTA: Os loops pressão-volume deve começar a tornar-se menor e deslocar para baixo e para a esquerda. Isso é chamado de &quot;descer&quot;. <ol><li> Obter 10-15 seg da caminhada para baixo, em seguida, solte a braçadeira de tubulação para permitir a pré-carga para reinserir o átrio esquerdo. NOTA: Estes laços pressão-volume irá fornecer volume de medições independentes da função cardíaca (por exemplo, pré-carga de trabalho sistólico recrutável, sistólica relação pressão-volume final). </li><li> Pare de dados de gravação, pressionando o botão &quot;Stop&quot; no canto superior direito da tela. </li><li> Espere pelo menos 5 minutos antes de repetir ooclusão. </li></ol></li><li> Repita os passos 7.7 e 7.8 para obter medições repetidas. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

O isolado de Langerdorff perfusão do coração aparelhos e modelo de coração levaram a algumas das descobertas mais fundamentais da fisiologia cardíaca, patologia e farmacologia. Versatilidade deste modelo permite a sua utilização com uma grande variedade de espécies, sob uma variedade de condições normais e patológicas 1-18. No entanto, o modelo de coração isolado não é comumente usado para grandes mamíferos, especialmente os corações humanos, em parte devido ao aumento da complexidade do projeto, tanto aparelhos e coleta de dados. Portanto, o protocolo aqui apresentado demonstra uma tentativa de melhorar essas complexidades, que resulta em um meio relativamente reprodutíveis de estudar corações suínos isoladas. Um componente crucial da nossa configuração é a substituição da câmara de complacência arterial / pós-carga com uma bomba centrífuga. Esta troca permite maior controle da pressão de perfusão coronária e pós-carga em Langendorff e modos de trabalho, coração respectivamente, permite que este set-up para ser facilmente adaptado aos corações de diferentes tamanhos e espécies. Por exemplo, neste projeto, corações suínos são reperfundido a 40-45 mmHg, enquanto que os corações humanos são reperfundido em 60-65 mmHg. Esta mudança de pressão é alcançado simplesmente ajustando as configurações da bomba centrífuga; nenhum componente do sistema tem de ser ajustado fisicamente. Além disso, a colocação de um transdutor de pressão dentro da raiz aórtica para monitorar as pressões de raiz permite fácil transição entre o fluxo e pressão constante durante o modo de Langendorff. Embora esta mudança remove a câmara de amortecimento clássico, a bomba centrífuga, permitindo que o fluxo bidireccional ocorre com base no gradiente de pressão, pode servir como uma câmara de amortecimento. Com o volume de ejeção sístole e ejetado, fluxo retrógrado através da bomba serve para diminuir a pressão pós-carga, replicando a elasticidade da aorta. O design aberto deste aparelho também é importante. Tendo o coração pendurado em um um abertorea, em vez de uma câmara ou funil semi-fechado, permite a instrumentação mais fácil para as medições de pressão e volume. O design aberto permite o uso de uma incisão transapical para a colocação do cateter LV, evitando a abordagem transvalvar. A abordagem transvalvar é tecnicamente mais difícil, e geralmente requer fluoroscopia para a colocação correta. Além disso, esta abordagem também pode induzir a insuficiência valvular. Utilizando a abordagem transapical, que de forma segura e facilmente colocar o cateter no interior do ventrículo esquerdo, enquanto eliminando os custos e inconvenientes de fluoroscopia extra. O design aberto também oferece fácil acesso para a ecocardiografia e coleta de efluentes, ampliando ainda mais os parâmetros funcionais e bioquímicas que podem ser avaliados, enquanto no sistema. O design aberto, facilitando a coleta de dados, faz a regulação da temperatura do miocárdio mais difícil. A manutenção da temperatura fisiológica é um dos problemas conhecidos com um Langendorffou trabalhando sistema coração 1,3,11,13. O sistema de Langendorff tipicamente contém uma câmara térmica que ajuda a manter uma temperatura adequada, mas esta câmara também torna a inserção de um cateter de pressão-volume ventricular mais difícil. Para resolver a regulamentação do projeto aberto temperatura inferior, um trocador de oxigenador / calor foi colocado após o reservatório. O espaço mínimo entre o permutador de calor e a cânula aórtica reduz a perda de calor, e a sonda de temperatura do miocárdio assegura normotermia. A utilização de tubos com camisa de aquecimento ou de fontes externas, também podem ser usadas para ajudar a controlar a temperatura. Outro elemento único deste protocolo é lavar o sangue autólogo do porco em estudo e reconstituindo-lo com soro fisiológico. Embora, a utilização quer de perfusato de sangue completo ou glóbulos vermelhos do sangue aumentada com tampões cristalóides não é raro, se manifesta com problemas. O primeiro geralmente requer um animal doador, o que acrescenta substcustos antial para o experimento, enquanto o último pode ter problemas de imunogenicidade, uma vez que geralmente é derivado 1,11-13 sangue bovino. Ao lavar o sangue do próprio porco original, o protocolo requer apenas um único animal e as questões de imunogenicidade são ablated. Além disso, o processo de lavagem remove a maior parte dos electrólitos, o que significa que pode ser facilmente manipulado por os parâmetros experimentais. Finalmente, utilizando-se uma unidade de conservação do sangue elimina a maioria das proteínas no sangue, o que é uma vantagem e desvantagem deste processo. A vantagem é que toda a coagulação e proteínas infecciosas / imunológicos são removidos, diminuindo a probabilidade de formação de coágulos ou contaminação. A desvantagem é que esta mistura tem uma baixa pressão oncótica, o que pode conduzir a um edema do miocárdio e, possivelmente, perda da função cardíaca ao longo do tempo. Esta questão pode ser abordada, contudo, por meio da adição de albumina ou de outra colóide. Garantir que um tamanho adequado de umaimal e cateter ter sido seleccionada é tão importante como a utilização do aparelho de coração de funcionamento. Idealmente, o cateter irá ser colocado com todos os eléctrodos de detecção dentro do espaço ventricular, com dois eléctrodos de excitação (ou seja, os eléctrodos mais proximal) fora do espaço ventricular. Se cavidade ventricular do animal é muito pequena, ou o espaçamento entre os eléctrodos é muito grande, então todos os segmentos não vai encaixar dentro do espaço de LV. Embora a localização dos eléctrodos de excitação pode ser ajustada, de uma pequena cavidade LV também pode fazer com que o cateter dobre ou curva, tornando difícil a recolha de dados. Portanto, para análise funcional de corações de animais grandes, um tamanho de animais de pelo menos 60 kg é recomendada. Com um animal deste tamanho, espaçamento de eléctrodo de 7 milímetros geralmente permite a completa inserção do cateter. Em conclusão, este manuscrito descreve um sistema isolado trabalhando coração que simplifica a regulação da pressão de perfusão, col dadoslição, e design em geral, ao mesmo tempo que o controle apenas um pouco mais difícil de temperatura. Essas modificações no coração isolado venha permitir a sua maior utilização com grandes corações de mamíferos, incluindo seres humanos, promovendo a nossa compreensão da patologia cardíaca e permitindo que as opções de tratamento mais clinicamente relevantes a serem descobertos.

Muito do nosso entendimento da biologia básica e fisiologia cardíaca veio de experimentos que utilizaram o, coração Langendorff retrógrada-perfusão isolada e os sistemas isolados coração de trabalho. Estes sistemas experimentais ainda são amplamente utilizados hoje para estender o nosso conhecimento cardiovascular de tópicos importantes, incluindo a lesão de isquemia-reperfusão 2, 4 pré-condicionamento, a célula base de terapia para miocárdio danificado 5,7, os efeitos cardíacos de drogas 6,9 e preservação do enxerto cardíaco técnicas 8,15-18. Embora ambos os sistemas de coração isolado pode ser usado para todas as espécies de mamíferos, eles são utilizados principalmente em pequenos mamíferos, tais como cobaia, rato, ou coelho 3,12,13. Modelos animais maiores, como porcos e humanos, fornecer dados mais clinicamente relevantes, mas são menos frequentemente utilizado devido ao custo mais elevado, maior variabilidade biológica, maiores volumes de soluções para perfusão de sangue, e cevadaer equipamentos 1,12-15. Além disso, a coleta de dados é mais difícil, especialmente para os corações isolados de trabalho 1,3,12-15. Como resultado dessas complexidades, modelos de coração isolado clinicamente relevantes são raramente usados, prejudicando severamente o progresso da investigação de translação cardiovascular. Numa tentativa para resolver estas dificuldades, a preparação do coração isolado de trabalho foi modificado para criar um sistema que pode ser facilmente adaptado para corações de diferentes espécies, incluindo humanos, tanto sob pressão constante ou condições de Langendorff o fluxo constante. A câmara de pós-carga conformidade foi substituído com uma bomba centrífuga para simplificar o processo de ajuste da pressão de perfusão no modo de Langendorff e pós-carga no modo de funcionamento. Em vez de um fechado, revestido reservatório para conter o coração, este sistema utiliza uma câmara aberta para fazer a coleta de dados mais fácil, permitindo o uso da abordagem transapical para condutância cateterismo. Moreover, este projeto aberto permite o acesso para a avaliação ecocardiográfica do coração, ampliando ainda mais os parâmetros fisiológicos que podem ser medidos durante estes experimentos. Estas melhorias, esperamos incentivar outras pessoas a utilizar este sistema para a grande investigação translacional animal.

<table><tbody><tr><td>PowerLab 16/35 with LabChart Pro</td><td>ADInstruments</td><td>PL3516/P</td><td></td></tr><tr><td>MPVS Ultra Pressure-Volume Unit</td><td>ADInstruments</td><td>880-0168</td><td></td></tr><tr><td>Ventri-Cath Catheter (5F, 12E, 7 mm, DField, Straight, 122 cm)</td><td>Millar</td><td>VENTRI-CATH-507s</td><td></td></tr><tr><td>Pressure Catheter (3.5F, Single, Straight, 100 cm, Ny, Non Repairable)</td><td>Millar</td><td>SPR-524</td><td></td></tr><tr><td>PV Extension Cable (10 ft)</td><td>ADInstruments</td><td>CEC-10PV</td><td></td></tr><tr><td>Catheter Interface Cable (10 ft)</td><td>ADInstruments</td><td>PEC-10D</td><td></td></tr><tr><td>Rho Calibration Cuvette</td><td>ADInstruments</td><td>910-1060</td><td></td></tr><tr><td>MPVS Ultra BNC Cable Pack</td><td>ADInstruments</td><td>880-0172</td><td></td></tr><tr><td>Autotransfusion system</td><td>Sorin</td><td>7320000</td><td></td></tr><tr><td>Bowl Set with Low Volume (135 ml) Centrifuge Bowl</td><td>Sorin</td><td>7135100</td><td></td></tr><tr><td>Oxygenator/Heat Exchanger</td><td>Terumo</td><td>3CXSX18RX</td><td></td></tr><tr><td>Perivascular flow probe</td><td>Transonic Systems</td><td>PAU Series</td><td>Size of flow probe will depend on animal size; for 60 kg pig, recommend 20 or 24 mm probe</td></tr><tr><td>Perivascular flowmeter module</td><td>Transonic Systems</td><td>TS420</td><td></td></tr><tr><td>Myocardial temerpature sensor</td><td>Smiths Medical</td><td>MTS-40015</td><td></td></tr><tr><td>16 G 1&quot; Regular needle</td><td>BD Inc.</td><td>305197</td><td></td></tr><tr><td>4-0 polypropylene suture (double-arm)</td><td>Ethicon</td><td>8526H</td><td>For purse-string stitches</td></tr><tr><td>2-0 polypropylene suture (single-arm)</td><td>Ethicon</td><td>8833H</td><td></td></tr><tr><td>Cable ties</td><td>ULINE</td><td>S-1021</td><td></td></tr><tr><td>Cable tie gun</td><td>ULINE</td><td>H-241</td><td></td></tr><tr><td>Clear, Flexible PVC Tubing</td><td>VWR International</td><td>89068</td><td>Inner diameter depends on cannulas, pumps and other equipment used; most commonly use 1/4&quot;, 3/8&quot; tubing&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Straight Tubing Connectors</td><td>VWR International</td><td>46600</td><td></td></tr><tr><td>Y-Shaped Tubing Connectors</td><td>Thermo Scientific</td><td>6152</td><td></td></tr><tr><td>Jacketed Bubble Trap</td><td>Radnoti</td><td>14040</td><td>For preload chamber</td></tr><tr><td>Centrifugal pump</td><td>Maquet</td><td>70105</td><td>The centrifugal pump and roller pumps were obtained used from perfusion department after clinical use.</td></tr><tr><td>Roller pumps</td><td>Maquet</td><td>HL-20</td><td></td></tr><tr><td>Hemostasis Valve</td><td>Merit Medical</td><td>MAP150</td><td></td></tr><tr><td>Blood gas analyzer</td><td>Instrumentation Laboratory</td><td>570001000</td><td></td></tr></tbody></table>

an isolated working heart system for large animal models

Desde a sua introdução no final do século 19, a perfusão isolada coração aparelho Langendorff, eo subsequente desenvolvimento do modelo de coração, têm sido ferramentas inestimáveis ​​para estudar a função cardiovascular e doença 1-15. Embora a preparação do coração Langendorff pode ser usado para qualquer coração de mamíferos, a maioria dos estudos envolvendo o aparelho usar modelos animais pequenos (por exemplo, rato, rato, coelho) e devido ao aumento da complexidade dos sistemas de mamíferos maiores 1,3,11. Uma das maiores dificuldades é garantir uma pressão de perfusão coronária constante sobre uma gama de diferentes tamanhos de coração - um componente chave de qualquer experiência com a utilização deste dispositivo 1,11. Ao substituir o clássico coluna pós-carga hidrostática com uma bomba centrífuga, o aparelho coração trabalhando Langendorff descrito abaixo permite fácil ajuste e regulação apertada de pressões de perfusão, ou seja, o mesmo set-up pode ser usado para várias espécies ou tamanhos do coração. Além disso, essa configuração também pode alternar facilmente entre a pressão constante ou fluxo constante durante a reperfusão, dependendo das preferências do usuário. A natureza aberta dessa configuração, apesar de fazer a regulação da temperatura mais difícil do que outros projetos, permite a fácil coleta de dados de pressão e volume de efluentes e ventriculares.

A Figura 1 é um desenho esquemático do circuito, incluindo a colocação do cateter sugerido. Os elementos importantes deste aparelho incluem o seguinte: a utilização de uma bomba centrífuga para controlar a pós; colocação de um cateter de pressão (linha azul escura) na raiz da aorta para monitorar a pressão de perfusão; ea colocação da pressão-volume (PV) cateter (linha azul clara) transapical. Embora as conexões na figura parecem ser as conexões retas, conectores &quot;Y&quot; são recomendadas, especialmente para a linha de pré-carga. A Figura 2 mostra os dados obtidos a partir do transdutor de pressão que está colocado na raiz aórtica de um porcino, durante a reperfusão do coração no circuito, o que é consistente entre 40-42 mmHg durante mais de 20 min. As alterações na resistência coronária pode provocar flutuações na pressão de perfusão (Figura 3). Essas variações podem ser menores e gradual, corrigi-los<html> eus ao longo do tempo (Figura 3a). No entanto, em alguns casos, estas variações podem ser abrupta e exigem um ajuste do fluxo através da bomba centrífuga para manter a pressão desejada reperfusão (Figura 3b). Como as mudanças podem ocorrer, é necessário o monitoramento da pressão da raiz da aorta durante a reperfusão. Através da utilização da incisão transapical, os dados de pressão e volume podem ser facilmente obtidos no sistema de coração isolado. Nesta experiência, um coração de porcino, que tinham sido armazenadas em frio (4 ° C) solução de conservação de 2 horas foi usado. Após a introdução inicial do cateter PV, as laçadas foram de baixa qualidade (figura 4a), com múltiplas áreas de cruzamento e não há componentes do ciclo cardíaco discerníveis. No entanto, com o mínimo de manipulação do cateter no interior do ventrículo, a morfologia circuito melhorado dramaticamente (Figura 4b), o que permite que as medições sejam obtidos. ve_content &quot;&gt; Apesar optimização da posição do cateter, as laçadas adquiridos no circuito de ex vivo (Figura 5, linha superior) pode ter uma morfologia diferente das laçadas em vivo (Figura 5, linha inferior). Estas alterações morfológicas laço são provavelmente devido a diferente orientação do coração no circuito em comparação com um animal em decúbito dorsal, bem como a falta dos anexos anatómicas encontradas dentro de um animal vivo (como pericárdio). Além disso, o uso de fios de estimulação para ajudar a regular o ritmo cardíaco ( local de ligação recomendada: septo interventricular) introduz uma corrente elétrica externa, levando aos picos observados na parte inferior direita do ex vivo laços No entanto, desde que estes laços ainda apresentam os componentes do ciclo cardíaco, podem ainda produzir dados interpretáveis.. A Tabela 1 apresenta os vários parâmetros funcionais obtidos com estes laços pressão-volume usando o cateter PV. A<html> estática de armazenagem a frio provavelmente causado algum dano intrínseco ao coração, o que ajuda a explicar algumas das alterações nos valores obtidos no circuito, em comparação com as medições in vivo. Algumas das variações dentro das variáveis ​​dependentes de carga também é devido aos prováveis ​​diferenças na pré-carga entre o circuito eo animal vivo. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51671/51671fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Diagrama do aparelho. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51671/51671fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Medições de pressão da raiz da aorta Representante durante a reperfusão. <html> &quot;width =&quot; 500 g3highres.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Exemplos de alterações a pressão da raiz da aorta, que pode ocorrer durante a reperfusão. Estas mudanças podem ser gradual e de auto-correção (A), ou abrupta e exigir mudanças nas configurações da bomba centrífuga (B). <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51671/51671fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Laços de pressão-volume obtidos após a inserção inicial do cateter transapical (A) e depois da manipulação do cateter menor (B). Nota a melhoria da morfologia circular, pelo que a passagem do laço é eliminado e os elementos do ciclo cardíaco são reconhecíveis . Os picos na porção inferior direita de ambos os conjuntos de alças estão, devido à utilização de uma lebre, o que introduz um sinal eléctrico extrínseca. <img alt="&lt;/ Html">&quot;Figura 5&quot; fo: Content-width = &quot;5 polegadas&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51671/51671fig5highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 5. Medições de pressão de volume representativo tomado no circuito vivo ex (top de linha), com medições in vivo (linha inferior) para comparação. Novamente, picos de marcapasso pode ser visto no canto inferior direito de ambos os conjuntos de ex vivo loops. <img alt="Tabela 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51671/51671table1.jpg" width="500" /> Tabela 1 Parâmetros funcionais obtidos para um coração de porcino in vivo (coluna da esquerda) e no aparelho de funcionamento do coração após 2 horas de armazenamento a frio (coluna da direita) de CO:.. Débito cardíaco; E um: elastância arterial; EDPVR: End diastólica relação pressão-volume; EDV: volume diastólico final; ESPVR: End sistólica relação pressão-volume; PRSW: trabalho sistólico pré-recrutável; PVA:zona de pressão-volume; SV: volume sistólico; SW: trabalho derrame.

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An Isolated Working Heart System for Large Animal Models

Most studies involving the Langendorff apparatus use small animal models due to the increased complexity of systems for larger mammals. We describe a Langendorff system for large animal models that allows for use across a range of species, including humans, and relatively easy data acquisition.

Um Sistema de coração isolado para Grandes Modelos Animais

Since its introduction in the late 19th century, the Langendorff isolated heart perfusion apparatus, and the subsequent development of the working heart ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

30.6K visualizações.  Duke University Medical Center. Most studies involving the Langendorff apparatus use small animal models due to the increased complexity of systems for larger mammals. We describe a Langendorff system for large animal models that allows for use across a range of species, including humans, and relatively easy data acquisition.

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NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

Since its inception by Langendorff1, the isolated perfused heart remains a prominent tool for studying cardiac physiology2. However, it is not well-suited for studies of cardiac metabolism, which require the heart to perform work within the context of physiologic preload and afterload pressures. Neely introduced modifications to the Langendorff technique to establish appropriate left ventricular (LV) preload and afterload pressures3. The model is known as the isolated LV working heart model and has been used extensively to study LV performance and metabolism4-6. This model, however, does not provide a properly loaded right ventricle (RV). Demmy et al. first reported a biventricular model as a modification of the LV working heart model7, 8. They found that stroke volume, cardiac output, and pressure development improved in hearts converted from working LV mode to biventricular working mode8. A properly loaded RV also diminishes abnormal pressure gradients across the septum to improve septal function. Biventricular working hearts have been shown to maintain aortic output, pulmonary flow, mean aortic pressure, heart rate, and myocardial ATP levels for up to 3 hours8.
When studying the metabolic effects of myocardial injury, such as ischemia, it is often necessary to identify the location of the affected tissue. This can be done by imaging the fluorescence of NADH (the reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide)9-11, a coenzyme found in large quantities in the mitochondria. NADH fluorescence (fNADH) displays a near linearly inverse relationship with local oxygen concentration12 and provides a measure of mitochondrial redox state13. fNADH imaging during hypoxic and ischemic conditions has been used as a dye-free method to identify hypoxic regions14, 15 and to monitor the progression of hypoxic conditions over time10.
The objective of the method is to monitor the mitochondrial redox state of biventricular working hearts during protocols that alter the rate of myocyte metabolism or induce hypoxia or create a combination of the two. Hearts from New Zealand white rabbits were connected to a biventricular working heart system (Hugo Sachs Elektronik) and perfused with modified Krebs-Henseleit solution16 at 37 &deg;C. Aortic, LV, pulmonary artery, and left &amp; right atrial pressures were recorded. Electrical activity was measured using a monophasic action potential electrode. To image fNADH, light from a mercury lamp was filtered (350&plusmn;25 nm) and used to illuminate the epicardium. Emitted light was filtered (460&plusmn;20 nm) and imaged using a CCD camera. Changes in the epicardial fNADH of biventricular working hearts during different pacing rates are presented. The combination of the heart model and fNADH imaging provides a new and valuable experimental tool for studying acute cardiac pathologies within the context of realistic physiological conditions.

The objective is to monitor the mitochondrial redox state of isolated hearts within the context of physiologic preload and afterload pressures. A biventricular working rabbit heart model is presented. High spatiotemporal resolution fluorescence imaging of NADH is used to monitor the mitochondrial redox state of epicardial tissue.

NADH Fluorescência de Imagem biventricular isolado de coelho

Since its inception by Langendorff1, the isolated perfused heart remains a prominent tool for studying cardiac physiology2. However, it is not well-suited ...

Medicina

The Inverted Heart Model for Interstitial Transudate Collection from the Isolated Rat Heart

The present protocol describes a unique approach that enables the collection of cardiac transudate (CT) from the isolated, saline-perfused rat heart. After isolation and retrograde perfusion of the heart according to the Langendorff technique, the heart is inverted into an upside-down position and is mechanically stabilized by a balloon catheter inserted into the left ventricle. Then, a thin latex cap &#8211; previously cast to match the average size of the rat heart &#8211; is placed over the epicardial surface. The outlet of the latex cap is connected to silicon tubing, with the distal opening 10 cm below the base level of the heart, creating slight suction. CT continuously produced on the epicardial surface is collected in ice-cooled vials for further analysis. The rate of CT formation ranged from 17 to 147 &#181;L/min (n = 14) in control and infarcted hearts, which represents 0.1-1% of the coronary venous effluent perfusate. Proteomic analysis and high performance liquid chromatography (HPLC) revealed that the collected CT contains a wide spectrum of proteins and purinergic metabolites.

This protocol describes a method to collect cardiac interstitial fluid from the isolated, perfused rat heart. To physically separate interstitial transudate from coronary venous effluent perfusate, the Langendorff perfused heart is inverted, and the transudate (interstitial fluid) formed on the cardiac surface is collected using a soft latex cap.

O modelo do coração invertido para a coleta de transudados intersticiais do coração de rato isolado

The present protocol describes a unique approach that enables the collection of cardiac transudate (CT) from the isolated, saline-perfused rat heart. ...

A Pre-Clinical Porcine Model of Orthotopic Heart Transplantation

Fifty-years following the first successful report, cardiac transplantation remains the gold-standard treatment for eligible patients with advanced heart failure. Multiple small-animal models of heart transplantation have been used to study the acute and long-term effects of novel therapies. However, few are tested and demonstrated success in clinical trials. It is of critical importance to evaluate new therapies in a clinically relevant large-animal model for efficient and reliable translation of basic studies&#39;&#160;findings. Here, we describe a pre-clinical large-animal (porcine) model of orthotopic heart transplantation that has been firmly established and previously used to investigate novel cardioprotective strategies. This procedure focuses on acute ischemia-reperfusion injury and is a reliable method to investigate novel interventions which have been tested and validated in smaller experimental models, such as the murine model. We demonstrate its usefulness in assessing cardiac performance during the early post-transplantation period and other potential possibilities enabled by the model.

Here, we describe a pre-clinical large-animal (porcine) model of orthotopic heart transplantation that has been firmly established and utilized to investigate novel cardioprotective strategies.

Um modelo pré-clínico porcino de transplante cardíaco ortotópico

Fifty-years following the first successful report, cardiac transplantation remains the gold-standard treatment for eligible patients with advanced heart ...

Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after circulatory death (DCD) is a solution to address this limited availability, but due to a period of prolonged warm ischemia and the risk of tissue injury, its routine use in cardiac transplantation is seldom seen. In this manuscript we provide a detailed protocol closely mimicking current clinical practices in the context of DCD with continuous monitoring of heart function, allowing for the evaluation of novel cardioprotective strategies and interventions to decrease ischemia-reperfusion injury.
In this model, the DCD protocol is initiated in anesthetized Lewis rats by stopping ventilation to induce circulatory death. When systolic blood pressure drops below 30 mmHg, the warm ischemic time is initiated. After a pre-set warm ischemic period, hearts are flushed with a normothermic cardioplegic solution, procured, and mounted onto a Langendorff ex vivo heart perfusion system. Following 10 min of initial reperfusion and stabilization, cardiac reconditioning is continuously evaluated for 60 min using intraventricular pressure monitoring. A heart injury is assessed by measuring cardiac troponin T and the infarct size is quantified by histological staining. The warm ischemic time can be modulated and tailored to develop the desired amount of structural and functional damage. This simple protocol allows for the evaluation of different cardioprotective conditioning strategies introduced at the moment of cardioplegia, initial reperfusion and/or during ex vivo perfusion. Findings obtained from this protocol can be reproduced in large models, facilitating clinical translation.

This protocol shows a simple and flexible approach for the evaluation of new conditioning agents or strategies to increase the feasibility of cardiac donation after circulatory death.

Modelo pré-clínico de doação cardíaca após a morte circulatória

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to larger animals. Yet, larger mammals are better suited for translational research questions related to normal cardiac physiology, pathophysiology, and preclinical testing of therapeutic agents. To overcome the technical barriers associated with employing a larger animal model in cardiac research, we describe an approach to measure physiological parameters in an isolated, Langendorff-perfused piglet heart. This approach combines two powerful experimental tools to evaluate the state of the heart: electrophysiology (EP) study and simultaneous optical mapping of transmembrane voltage and intracellular calcium using parameter sensitive dyes (RH237, Rhod2-AM). The described methodologies are well suited for translational studies investigating the cardiac conduction system, alterations in action potential morphology, calcium handling, excitation-contraction coupling and the incidence of cardiac alternans or arrhythmias.

The objective of this study was to establish a method for investigating cardiac dynamics using a translational animal model. The described experimental approach incorporates dual-emission optocardiography in conjunction with an electrophysiological study to assess electrical activity in an isolated, intact porcine heart model.

Estudos de Optocardiografia e Eletrofisiologia de Ex Vivo Langendorff-perfundido Corações

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Semi-Minimal Invasive Method to Induce Myocardial Infarction in Rats and the Assessment of Cardiac Function by an Isolated Working Heart System

Myocardial infarction (MI) remains the main contributor to morbidity and mortality worldwide. Therefore, research on this topic is mandatory. An easily and highly reproducible MI induction procedure is required to obtain further insight and better understanding of the underlying pathological changes. This procedure can also be used to evaluate the effects or potency of new and promising treatments (as drugs or interventions) in acute MI, subsequent remodeling and heart failure (HF). After intubation and pre-operative preparation of the animal, an anesthetic protocol with isoflurane was performed, and the surgical procedure was conducted&#160;quickly. Using a minimally invasive approach, the left anterior descending artery (LAD) was located and occluded by a ligature. The occlusion can be performed acutely for subsequent reperfusion (ischemia/reperfusion injury). Alternatively, the vessel can be ligated permanently to investigate the development of chronic MI, remodeling or HF. Despite common pitfalls, the drop-out rates are minimal. Various treatments such as remote ischemic conditioning can be examined for their cardioprotective potential pre-, peri- and post-operatively. The post-operative recovery was quick as the anesthesia was precisely controlled and the duration of the operation was short. Post-operative analgesia was administered for three days. The minimally invasive procedure reduces the risk of infection and inflammation. Furthermore, it facilitates rapid recovery. The &#8220;working heart&#8221; measurements were performed ex vivo and enabled precise control of preload, afterload and flow. This procedure requires specific equipment and training for adequate performance. This manuscript provides a detailed step-by-step introduction for conducting these measurements.

This article presents an efficient method to perform myocardial ischemia and subsequent chronic reperfusion in rats using a minimally invasive approach. In addition, left ventricular hemodynamic function of rats is assessed by echocardiography and isolated working heart methods.&#160;

Método invasivo semi-mínimo para induzir infarto do miocárdio em ratos e a avaliação da função cardíaca por um sistema cardíaco de trabalho isolado

Myocardial infarction (MI) remains the main contributor to morbidity and mortality worldwide. Therefore, research on this topic is mandatory. An easily ...

Large Animal Model for Evaluating the Efficacy of the Gene Therapy in Ischemic Heart

Coronary artery disease is one of the significant causes of mortality and morbidity worldwide. Despite the progression of current therapeutics, a considerable proportion of coronary artery disease patients remain symptomatic. Gene therapy-mediated therapeutic angiogenesis offers a novel therapeutic method for improving myocardial perfusion and relieving symptoms. Gene therapy with different angiogenic factors has been studied in few clinical trials. Due to the novelty of the method, the progress of myocardial gene therapy is a continuous path from bench to bedside. Therefore, large animal models are needed for evaluating the safety and efficacy. The more the large animal model identifies the original disease and the endpoints used in clinics, the more predictable outcomes are from clinical trials. Here, we introduce a large animal model for evaluating the efficacy of the gene therapy in the ischemic porcine heart. We use clinically relevant imaging methods such as ultrasound imaging and 15H2O-PET. For targeting the gene transfers into the desired area, electroanatomical mapping is used. The aim of this method is: (1) to mimic chronic coronary artery disease, (2) to induce therapeutic angiogenesis at hypoxic areas of the heart, and (3) to evaluate the safety and efficacy of the gene therapy by using relevant endpoints.

Myocardial gene therapy for ischemic heart disease holds great promise for future therapeutics. Here, we introduce a large animal model for evaluating the efficacy of gene therapy in the ischemic heart.

Modelo animal de grande porte para avaliação da eficácia da terapia gênica em coração isquêmico

Coronary artery disease is one of the significant causes of mortality and morbidity worldwide. Despite the progression of current therapeutics, a ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

Roedor Trabalho Modelo do coração para o estudo do desempenho do miocárdio eo consumo de oxigênio

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Biologia

Dissection Techniques and Histological Sampling of the Heart in Large Animal Models for Cardiovascular Diseases

The standard gross examination and sampling are key elements in the reproducibility and success of experimental studies of cardiovascular diseases carried out in large animals. Considering the complex anatomy of the heart, interspecies differences, and the types of compensatory and pathological reactions, consistent protocols are challenging to implement. The utilization of multiple dissection protocols is usually adapted to suit the prosector's experience, and personal preference continues to be a source of experimental and interobserver variability. Here, the aim is to present the main anatomical features and landmarks, dissection protocols, and histological sampling standards of the heart in some commonly used species (including dogs, pigs, ruminants, and cats) as models of cardiovascular diseases.
Two standard gross examination protocols are presented here. First, the inflow-outflow method, which follows the physiological blood flow direction through the heart and large vessels (frequently used in dogs, ruminants, and pigs), and second, the four-chamber dissection technique (exemplified in cats). Both techniques can be adapted to any species in certain experimental circumstances. The sampling protocols include all the areas of interest (sinoatrial node, ventricles, interventricular septum, atria, valves, and aorta), and if properly carried out, improve both the reproducibility and reliability of experimental studies.

Due to the complex anatomy, a consistently reproducible dissection and harvesting protocol for cardiac samples can be challenging to implement. This manuscript presents the key elements of some standard cardiac dissection protocols, highlighting both the gross examination approaches and the sampling sites commonly used for histopathologic examination.

Técnicas de Dissecção e Amostragem Histológica do Coração em Modelos de Grandes Animais para Doenças Cardiovasculares

The standard gross examination and sampling are key elements in the reproducibility and success of experimental studies of cardiovascular diseases carried ...

Large-Animal Model of Donation after Circulatory Death and Normothermic Regional Perfusion for Cardiac Assessment

The increase in demand for cardiac transplantation throughout the years has fueled interest in donation after circulatory death (DCD) to expand the organ donor pool. However, the DCD process is associated with the risk of cardiac tissue injury due to the inevitable period of warm ischemia. Normothermic regional perfusion (NRP) allows for an in situ organ assessment, allowing the procurement of hearts determined to be viable. Here, we describe a clinically relevant large-animal model of DCD followed by NRP. Circulatory death is established in anesthetized pigs by stopping mechanical ventilation. After a preset warm ischemia period, an extracorporeal membrane oxygenator (ECMO) is used for a NRP period lasting at least 30 min. During this reperfusion period, the model allows the collection of various myocardial biopsies and blood samples for initial cardiac evaluation. Once NRP is weaned, biochemical, hemodynamic, and echocardiographic assessments of cardiac function and metabolism can be performed before organ procurement. This protocol closely simulates the clinical scenario previously described for DCD and NRP in heart transplantation and has the potential to facilitate studies aimed at decreasing ischemia-reperfusion injury and enhance cardiac functional preservation and recovery.

The protocol describes a large-animal (porcine) model of donation after circulatory death, followed by thoracoabdominal normothermic regional perfusion that closely simulates the clinical scenario in heart transplantation, and has the potential to facilitate therapeutic studies and strategies.

Modelo de Doação em Animais de Grande Porte após Morte Circulatória e Perfusão Regional Normotérmica para Avaliação Cardíaca

The increase in demand for cardiac transplantation throughout the years has fueled interest in donation after circulatory death (DCD) to expand the organ ...