Este protocolo visa a questão limitada do fornecimento de órgãos de transplante, facilitando a avaliação de diferentes estratégias de condicionamento cardioprotetor para permitir o uso de corações doados após a morte circulatória. Coloque o animal em uma almofada de aquecimento definida para médio. Depois de confirmar a falta de resposta ao aperto do dedo do dedo em um rato adulto anestesiado, insira uma sonda de temperatura retal.
Conecte um sensor de oxímetro de pulso transdérmico a uma pata traseira, e cubra o rato com uma almofada absorvente para manter a temperatura corporal. Faça uma incisão de pele média de três a quatro centímetros no pescoço, e use uma tesoura curvada de ponta cega para dissecar o tecido subcutâneo, para expor o músculo esternoide direito. Usando fórceps não traumáticos, mova o músculo lateralmente até que a artéria carótida direita, a veia jugular e o nervo vago sejam identificados.
Use uma tesoura para separar cuidadosamente o nervo vago da artéria carótida. Injete 2.000 unidades internacionais por quilograma de heparina na veia jugular direita, aplicando pressão no local da injeção após a retração da agulha para evitar vazamento de sangue. Use fórceps curvos para passar duas suturas de seda 5-0 ao redor da artéria carótida.
Conecte firmemente a sutura distal para ocluir a artéria carótida no aspecto superior da artéria exposta, mantendo a sutura proximal desamava, e coloque o rato sob um microscópio estéreo. Em seguida, use uma tesoura de microcirurgia para fazer cuidadosamente uma incisão de um milímetro sobre a parede anterior da artéria carótida, e inserir um cateter intravenoso fechado de 22 polegadas em direção ao arco aórtico. O uso de ferramentas de ampliação e microdisseção é altamente recomendável para essas etapas.
Um campo limpo pode ser alcançado tensionando a sutura proximal para evitar sangramento. A doação cardíaca é necessária para montar o aparelho de cardioplegia ex vivo. Para iniciar o protocolo DCD, primeiro extubar o animal, depois usar fórceps de mosquito para prender a traqueia, iniciando a fase agonal.
Comece a contar a SAG funcional quando o pico da pressão arterial sistólica cair abaixo de 30 milímetros de mercúrio ou asstole ou fibrilação ventricular aparecer, o que vier primeiro. No final da WIT, realize uma esternotomia medial, mantendo o tórax aberto com um retraído de Alm, se necessário. Separe o coração das veias pulmonares e outras estruturas torácicas para completar a cardiectomia.
Submerse imediatamente o coração em uma solução krebs gelada para um transporte rápido para o sistema ex vivo. Use uma sutura de seda 2-0 para fixar firmemente a aorta no aparelho Langendorff, e depois abra a torneira. Agora abra totalmente o fluxo para a cânula, e inicie o tempo inicial de reperfusão e estabilização.
Gire o coração para que a ária esteja voltada para o sensor de pressão, e disseca as veias pulmonares para ampliar a abertura do arrio ventricular esquerdo, se necessário. Em seguida, insira um balão de látex conectado a um sensor de pressão, certificando-se de que o balão está totalmente posicionado dentro do ventrículo. Encha lentamente o balão com soro fisiológico até que a pressão diastólica final atinja 15 milímetros de mercúrio.
Insira o eletrodo de ritmo na face anterior do coração sem perfurar os vasos coronários. Uma vez observada a batida espontânea, defina o ritmo para 300 batidas por minuto. Após 10 minutos de estabilização, inicie o registro contínuo de medição de pressão intraventricular para iniciar a fase de recondicionamento e avaliação.
Após uma hora, remova o coração do aparelho Langendorff e use uma lâmina de aço de alto carbono para remover a atria. Com o ventrículo direito virado para baixo, corte fatias ventriculares transversais de um a dois milímetros de espessura. Extirpar o ventrículo direito da terceira fatia de tecido, e estocarar o ventrículo esquerdo para análises bioquímicas a jusante.
Submergir as seções restantes em solução de 5%TTC recém-preparada na PBS por 10 minutos a 37 graus Celsius. Na manhã seguinte, lave as amostras duas vezes em PBS fresco e submerse as amostras em PBS fresco para imagem. Tecidos viáveis aparecerão em cor vermelho-tijolo.
Após a extubação, a pressão arterial cai rapidamente em um padrão previsível e o tempo esperado para a morte é de menos de cinco minutos. Aqui, são mostradas curvas médias de pressão versus tempo no início do recondicionamento após zero, 10 e 15 minutos de SAG. A função contratil melhorará com o tempo, o uso de curtos períodos de SAG permitirá que a contratação volte ao normal, e os danos morfológicos não serão detectáveis.
O uso de um agente de condicionamento adicionado com a cardioplegia e na fase de estabilização mostrou que os danos gerados por 15 minutos de SAGI neste modelo são favoráveis à modulação por agentes cardioprotetores. Esta técnica permite o controle total de todas as variáveis relevantes e testes de intervenção farmacológica e não farmacológica e pode ser reproduzida em modelos maiores, facilitando a tradução clínica.
