Agradecemos a Dick Foley e Leigh Kimball para seus papéis-chave na filmagem e produção de vídeo.

1. Do sangue periférico mononuclear cela de isolamento (PBMC) <ol><li> Obter uma amostra de sangue - sangue deve ser coletado em seringas ou tubos de sangue e anti-coagulado com heparina (1:50 ratio) para prevenir a coagulação. Esperar um rendimento de cerca de 1 × 10 6 PBMC por mL de sangue - cerca de 40% dos quais serão CD4 positivos (CD4 +) células T. </li><li> Alíquota do sangue em tubos cônicos de 50 mL, 25 mL por tubo. Se o sangue tem separado, misture suavemente antes de alíquotas para distribuir o plasma </li><li> Adicionar PBS, elevando o volume total de 40 mL e underlay através da elaboração de 11 mL de Ficoll, inserindo no tubo de sangue, e com cuidado retirar a ajuda da pipeta pipeta. O Ficoll irá drenar lentamente para o fundo do tubo. Uma vez que o nível tem empatou, lentamente, remova a pipeta do tubo de sangue e descartar. </li><li> Cap os tubos de sangue e passar para as latas Aerosolve. Feche as vasilhas e centrifugar a 900 × g por 20 minutos - sem freio. É fundamental que nenhum freio é aplicado no final desta rodada como a força de travagem vai perturbar a camada de células. </li><li> Após a rodada, os PBMCs devem formar uma camada distinta em branco entre o plasma amarelo (acima) e Ficoll transparente (abaixo). Suavemente escumar camada de células brancas do sangue usando uma pipeta e transferir para novo tubo. Alguns plasma e Ficoll pode ser elaborado com a PBMCs, mas evitar a elaboração de qualquer um dos camada de células vermelhas. Normalmente, dois tubos de sangue podem ser combinados em um tubo de células nesta etapa para aumentar o tamanho da pelota. </li><li> Adicionar PBS, elevando o volume total de 50 mL e centrifugar a 500 × g por 15 minutos - de freio baixo em vasilhas aerosolve. </li><li> Aspirar líquido utilizando uma pipeta Pasteur, tomando cuidado para não perturbar o pellet </li><li> Tratar com tampão hemolítica adicionando 5-6 mL de cada tubo e misturar delicadamente para remover coágulos. Incubar por não mais que 5 minutos. </li><li> Adicionar PBS, elevando o volume total de 50 mL e centrifugar a 230 × g por 10 minutos - de freio baixo. Vasilhas Aerosolve não são mais necessários para esses spins mais lento. </li><li> Lave duas vezes: Aspirar líquido utilizando uma pipeta Pasteur, preencha tubo com PBS e centrifugar a 230 × g por 10 minutos. </li><li> Antes da etapa de lavagem final, retire uma alíquota de re-suspensão de células, diluir com azul de tripano, e contar com um hemocitômetro. Esta contagem de células vai ditar os volumes de reagentes utilizados na etapa de separação de células T. </li></ol> 2. CD4 + T * separação de células <ol><li> Aspirar líquidos e adicionar tampão de corrida para trazer o volume total de até 40 uL por 10 milhões de células. Normalmente, isso requer 30 uL de tampão mais o volume de pelotas residual. </li><li> Transferir este volume para um tubo cônico de 15 mL. </li><li> Adicionar cocktail anticorpo do kit de isolamento CD4 - 10 uL por 10 milhões de células, tubo de tampa, e colocar no gelo por 10 minutos </li><li> Retire o tubo do gelo, retire a tampa e adicionar 30 uL de tampão de corrida por 10 milhões de células </li><li> Adicionar esferas magnéticas do kit de isolamento CD4 - 20 uL por 10 milhões de células, tubo de tampa, e colocar no gelo por 15 minutos </li><li> Adicionar dez volumes de tampão de corrida para lavar e centrifugar a 230 × g por 10 minutos. </li><li> Durante a rodada, configurar o ímã e 5 mL em tubo de polipropileno seu espaço de trabalho </li><li> Aspirar líquido de pellet celular, adicione 2 mL de tampão execução e remover pedaços usando uma pipeta </li><li> Usando a mesma pipeta de transferência, a transferência de células dentro do tubo de 5 mL e incubar no ímã para 15 minutos </li><li> Decantar com precaução o CD4 + fração de células em um tubo de 15 mL marcada pelo ímã invertendo o esvaziamento e todos, mas a última gota </li><li> Acrescentar ainda 2 ml de tampão de corrida para o tubo de 5 mL e retire do ímã </li><li> Gentilmente lavar o CD4-células fora dos lados do tubo e transferir para um tubo de 15 mL marcada </li><li> Adicionar 2 mL médio de células T a cada tubo, remova alíquotas para contagem de células e centrifugar a 230 × g por 10 minutos. </li><li> Diluir alíquotas celular com azul de tripano e contar com um hemocitômetro. Estas contagens de células vai ditar o número de poços utilizados para a etapa de expansão da cultura. </li></ol> * Alternativamente, MACS colunas e contas (Miltenyi Biotec), o separador de células AutoMACS (Miltenyi Biotec), ou Robosep separador de células (Cell Stem Technologies) pode ser usado de acordo com instruções fabrica no lugar de passos 2,2-2,11. 3. Cultivo in vitro de Expansão <ol><li> Aspirar o líquido do CD4 + e de células CD4 e pellets, com base na contagem de células, adicionar meios de cultura (tipicamente 3 milhões CD4 + células por mL e 10 milhões de CD4-células por mL funciona bem para criar a cultura). A cultura de expansão requer 3-5000000 CD4-células por poço e 2-3000000 CD4 + células por poço em um volume total de 1 mL da cultura em media uma placa de cultura de 48 também. Normalmente, células CD4 + estão limitando a população </li><li> Se desejar, irradiar os CD4-células (5000 Rad<html> s). Alíquota CD4-células para o número apropriado de poços em um prato bem, adicionando 48 mL a cada 300-500. Coloque a placa em uma incubadora de 37 ° C por 1 hora. O aderente CD4-células servirão como células apresentadoras de antígenos na cultura de expansão. </li><li> Remova a placa da incubadora. </li><li> Lavar os poços por adição de 500 uL de mídia fresco e cuidado pipetando para cima e para baixo 12-20 vezes usando uma pipeta de transferência e remoção de todo o líquido. Esta lavagem vai deixar para trás uma camada de células aderentes antígeno apresentando. </li><li> Quando a lavagem estiver completa, adicione mídia apenas o suficiente para molhar a parte inferior de cada bem (cerca de 100 uL) - caso contrário, as células aderentes vai secar </li><li> Adicionar 2-3000000 células CD4 + a cada poço. Se necessário, adicione mídia adicional para trazer o volume total em cada poço até 1 mL. </li><li> Adicione o peptídeo desejado para cada poço. A concentração típica para a estimulação é de 10 ug / mL final. </li><li> Colocar a placa em uma incubadora de 37 ° C por 7 dias. </li><li> Após 7 dias, adicionar 50 uL de Hemogen IL-2 (ou equivalente, como recombinante IL-2, 10 IU / mL) a cada poço. </li><li> Em cada dia subseqüente, monitorar o crescimento de células usando um microscópio. Alimentar poços que ainda não são confluentes, removendo metade dos media, acrescentando novas mídias e 50 uL de IL-2. Dividir poços confluentes pela ressuspensão das células, movendo-se metade das células para um poço vazio, agregando novas mídias e 50 uL de IL-2. Retorno células a incubadora. </li><li> As células expansão estará pronto para tetrâmero após 13-15 dias de cultura. </li></ol> 4. Visualizando células T através da coloração tetrâmero <ol><li> Comprar ou montar tetrâmeros para combinar com as combinações de peptídeo / MHC que correspondem à CD4 + estimulou as células T (veja a discussão de fontes de reagentes tetrâmero). Tetrâmeros devem ser ~ 0,5 mg / mL. </li><li> Retire a placa da incubadora </li><li> Cuidadosamente a tirar metade dos meios de comunicação de cada poço </li><li> Transferir uma alíquota de células de cada poço - geralmente 75 mL ou cerca de 50 mil células - em um tubo de poliestireno 5 mL FACS </li><li> Adicionar tetrâmero - tipicamente mL 1 por 50 volume de mL total - e colocar em 37 ° C incubadora de 1-2 horas. Também é aconselhável a manchar uma alíquota de segundo de células de cada poço com um tetrâmero incompatíveis como controle negativo. </li><li> Células etiqueta com anti-CD3, anti-CD4 e anti-CD25 anticorpos adicionando 30-10 mL de cada anticorpo. Marcadores de anticorpos adicionais ou alternativos podem ser usados. No entanto, não use anticorpos PE rotulados desde que este canal deve ser reservado para o tetrâmeros. Neste momento, também único rótulo controles de cor ou isotipo usando células extra. </li><li> Células anticorpo rotulado incubar por 15-30 minutos em gelo ou a 4 ° C. </li><li> Lavar cada tubo com 0,5 a 2 mL tampão de corrida e centrifugar a 230 × g por 10 minutos. </li><li> Cuidadosamente decantar líquidos a partir de tubos FACS. Armazenar todos os tubos em um recipiente coberto (de preferência no gelo) para análise FACS subseqüentes. </li></ol> 5. Aquisição e Análise de fluxo citómetro <ol><li> Calibrar O citómetro usando pérolas de referência. </li><li> Verifique as configurações do instrumento: <ol><li> Usando células controle imaculada ou controles isotipo, ajustar a localização da porta de linfócitos viáveis ​​(FSC versus SSC). Remover auto-fluorescência de todos os canais pela centralização da população (alterando as configurações ganho) abaixo da primeira década em cada eixo. </li><li> Usando tubos de cor única de controle, centro de eventos dentro da quadrantes correto para cada cor (alterando as configurações de compensação). </li><li> Fazer um ajuste fino das configurações do instrumento usando um tubo manchado com um tetrâmero irrelevante. Em configurações específicas para o canal de PE podem precisar de ajustes, porque muitas vezes tetrâmeros mancha mais brilhante do que o controle de anticorpos. O tetrâmero irrelevantes devem mancha &lt;0,5% das células CD4 +. </li></ol></li><li> Aquisição de dados para cada tubo <ol><li> Coletar eventos para cada tubo de amostra e tubo de controle negativo </li><li> Adquirir e salvar pelo menos 20.000 eventos para Analysys </li></ol></li><li> Analisar os dados <ol><li> Importar arquivos de dados em FACS software de análise (por exemplo, software CellQuest, WinMDI, ou programa FlowJo). Comece sua análise através de um tubo manchado usando um tetrâmero irrelevante. </li><li> Plot FSC versus SSC e desenhar uma porta em torno dos linfócitos ao vivo (Figura 1, o painel superior esquerdo). </li><li> CD4 trama contra CD3 (linfócitos gated para mostrar ao vivo apenas) e desenhar portas em todo o CD3 + e CD4 + populações (Figura 1 painel superior direito). </li><li> CD4 enredo vs tetrâmero (gated para mostrar linfócitos CD3 + somente) e estabelecer os limites para que o quadrante CD4 + + tetrâmero população é menos de 0,5% (Figura 1 painel inferior esquerdo). </li><li> Plot CD25 versus tetrâmero (gated para mostrar linfócitos CD4 + apenas) e definir os limites do quadrante de modo que o CD25 + + tetrâmero população é inferior a 0,5% (Figura 1 painel inferior direito). </li><li> Analisar todos os tubos de amostra, sem alterar as portas. </li></ol></li></ol>1167/JOVE% 20FIGURE% 201.png &quot;alt =&quot; Figura 1 &quot;width =&quot; 600 &quot;height =&quot; 342 &quot;/&gt; Figura 1. Representante controlo negativo resultados de coloração tetrâmero. O painel superior esquerdo mostra a frente scatter scatter lado versos eo portão tamanho de linfócitos (R1). O painel superior direito é fechado para R1 e mostra ant-CD4 versus anti-CD3 e CD3 + (R2) e CD4 + (R3) portões. O painel inferior esquerdo é fechado para R2 e shows anti-CD4 contra tetrâmero. O painel inferior direito é fechado para R3 e shows anti-CD25 contra tetrâmero. Os quadrantes para ambos os lotes tetrâmero foram ajustados para 0,5%. 6. Resultados representante <ol><li> As células tetrâmero positivo deve ser uma população distinta entre as células CD4 + expandido (Figura 2). </li><li> Tetrâmero células positivas são geralmente CD25 + CD4 e, muitas vezes elevados. </li><li> Em alguns casos, uma combinação MHC / peptídeo pode dar coloração de fundo (geralmente causadas por um peptídeo com baixa solubilidade). Coloração de fundo como pode ser diferenciado de um verdadeiro positivo porque o &quot;falso positivo&quot; células não são uma única população distinta em ambos os CD4 vs tetrâmero ou o CD25 versus parcelas tetrâmero (Figura 3). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%202.png" alt="" width="600" height="362" /> Figura 2. Coloração resultados positivos Representante tetrâmero. O layout do painel e da estratégia de propagação são idênticos a Figura 1. As células tetrâmero positivos aparecem como uma população distinta CD4 elevado na CD4 anti-versus tetrâmero painel e uma distinta população CD25 + sobre o anti-CD25 contra painel de tetrâmero. <img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%203.png" alt="Figura 3" width="600" height="336" /> Figura 3. Representante &quot;falsos positivos&quot; os resultados da coloração tetrâmero. O layout do painel e da estratégia de propagação são idênticos a Figura 1. O CD4 anti-versus painel mostra um tetrâmero coloração indistinta &quot;mounded&quot;. O anti-CD25 contra tetrâmero mostra também uma coloração &quot;mounded&quot;, sem tendência clara em direção a ser CD25 +.

<ol>
	<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+Class+II+tetramers+permit+detection+and+characterization+of+peptide-specific+human+CD4++T+cells+proliferating+to+influenza+A+antigen.">MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen.</a> J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).</li><li>Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetramer-guided+epitope+mapping:+rapid+identification+and+characterization+of+immunodominant+CD4++T+cell+epitopes+from+complex+antigens.">Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens.</a> J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).</li></ol>

Compreensão do papel das células T CD4 + na imunidade é de fundamental importância. No entanto, CD4 + antígeno específico das células T pode ser difícil de detectar e isolar usando métodos tradicionais. Em contraste, tetrâmeros de MHC classe II permite a visualização direta de células CD4 + T com a especificidade do antígeno desejado. Este vídeo demonstra o isolamento, purificação e amplificação in vitro de células CD4 + T e sua visualização posterior usando tetrâmeros. Tetrâmeros de classe II s?...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Class 2 Laminar flow biosafety cabinet</td>
<td>equipment</td>
<td>Thermo Forma</td>
<td>1200</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>50 mL conical Tube</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>47747-182</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>1X PBS (Ca/Mg free)</td>
<td>Reagent</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH30028.02</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Ficoll-paque PLUS</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1440-03</td>
<td>foil wrapped to protect from light</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipet Aid XP</td>
<td>equipment</td>
<td>Drummond</td>
<td>4-000-101</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>10 mL pipet</td>
<td>equipment</td>
<td>Corning/Costar</td>
<td>CLS4492</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Aerosolve Canisters</td>
<td>equipment</td>
<td>Beckman</td>
<td>359481</td>
<td>with 50 mL inserts</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>equipment</td>
<td>Beckman</td>
<td>GS-6R</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Transfer pipets </td>
<td>equipment</td>
<td>Samco</td>
<td>202-20S</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Pasteur pipets</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>14672-200</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Hemolytic Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypan blue</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T6146</td>
<td>0.2% in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Hemocytometer</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR </td>
<td>15170-208</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 mL conical tube</td>
<td>equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>05-527-90</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Running Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA</td>
</tr>
<tr>
<td>MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II</td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-091-155</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>EasySep&reg; Magnet</td>
<td>equipment</td>
<td>Stem Cell Technologies</td>
<td>18000</td>
<td>		</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL polypropylene tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Falcon</td>
<td>352063</td>
<td>		</td>
</tr>
<tr>
<td>RPMI 1640</td>
<td>Reagent</td>
<td> Invitrogen</td>
<td>22400-089</td>
<td>with 25 mM HEPES</td>
</tr>
<tr>
<td>Pooled human serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen Strep</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>1570-063</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>500mL 0.22 micron bottle top filter</td>
<td>equipment</td>
<td>Nalgene</td>
<td>595-3320</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>48-well plate</td>
<td>equipment</td>
<td>Costar</td>
<td>3548</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>37&deg;C CO2 incubator</td>
<td>equipment</td>
<td>Sanyo Scientific</td>
<td>MCO-18AIC</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>20 mg/mL synthetic peptide</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>Custom synthesis from any peptide vendor</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL FACS tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Falcon</td>
<td>352008</td>
<td>Polystyrene</td>
</tr>
<tr>
<td>Peptide loaded class II tetramer (as described)</td>
<td>Reagent</td>
<td>N/A</td>
<td>N/A</td>
<td>Prepared by the BRI tetramer core</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD3</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD pharmingen</td>
<td>347344</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD4</td>
<td>Reagent</td>
<td>eBioscience</td>
<td>17-0049-73</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-CD25</td>
<td>Reagent</td>
<td>eBioscience</td>
<td>11-0259-73</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>
<tr>
<td>Facs Calibur Flow Cytometer</td>
<td>equipment</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>342975</td>
<td>Or equivalent</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualizing antigen specific cd4+ t cells using mhc class ii tetramers

Complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe II tetrâmeros permite a visualização direta do antígeno específico CD4 + células T por citometria de fluxo. Esse método se baseia na interação altamente específica entre peptídeo carregado MHC eo receptor de células T correspondente. Enquanto a afinidade de uma molécula MHC / peptídeo única é baixa, cross-linking complexos MHC / peptídeo com estreptavidina aumenta a avidez da interação, possibilitando a sua utilização como coloração reagentes. Por causa das freqüências relativamente baixas de células CD4 + T (~ 1 em 300.000 para uma especificidade única) este ensaio utiliza um passo de amplificação in vitro para aumentar o seu limiar de detecção. Células mononucleares são purificadas do sangue periférico por underlay Ficoll. CD4 + células são então separados por seleção negativa usando cocktail anticorpo biotinilado e anti-biotina marcada esferas magnéticas. Usando células aderentes a partir da fração de células CD4-células apresentadoras de antígenos como, células T CD4 + são expandidos em mídia pela adição de um peptídeo antigênico e IL-2. As células expandidas estão manchadas com o correspondente da classe II tetrâmero pela incubação a 37 C por uma hora e, posteriormente, coradas anticorpos de superfície, como anti-CD4, anti-CD3 e anti-CD25. Após a marcação, as células podem ser diretamente analisados ​​por citometria de fluxo. As células positivas tetrâmero normalmente formam uma população distinta entre os CD4 + células expandidas. Tetrâmero células positivas são geralmente CD25 + CD4 e, muitas vezes elevados. Porque o nível de coloração tetrâmero fundo pode variar, os resultados da coloração positiva deve ser sempre comparado com a coloração das células mesmo com um tetrâmero irrelevante. Múltiplas variações deste ensaio básicas são possíveis. Tetrâmero células positivas podem ser classificadas para a análise fenotípica ainda, a inclusão no ELISPOT ou ensaios de proliferação, ou outros ensaios secundários. Vários grupos também demonstraram co-coloração usando tetrâmeros e ou de citocinas anti-ou anti-FoxP3 anticorpos.

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Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Este procedimento demonstra a purificação e expansão in vitro de células CD4 + antígeno específico das células T do sangue periférico todo e sua visualização usando tetrâmeros de MHC classe II. Tetrâmeros permitir a visualização direta das células T com uma especificidade antígeno único e definido MHC classe II restrição.

Visualizando CD4 + antígeno específico Células T usando MHC Classe II tetrâmeros

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

visualizing-antigen-specific-cd4-t-cells-using-mhc-class-ii-tetramers

Research

JoVE Journal

Biology

21.6K visualizações.  Benaroya Research Institute. Este procedimento demonstra a purificação e expansão in vitro de células CD4 + antígeno específico das células T do sangue periférico todo e sua visualização usando tetrâmeros de MHC classe II. Tetrâmeros permitir a visualização direta das células T com uma especificidade antígeno único e definido MHC classe II restrição.

Vídeo: Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-linfócitos Captura Usando um chip descartável microfluídicos para HIV

Biologia

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Isolamento de células T CD4 + a partir dos nós linfáticos rato Usando Miltenyi Purificação MACS

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in determining outcomes that range from clearance to chronic persistent infections. We describe here a method for assessing the spatial and quantitative relationships between immune effector (E) virus-specific CD8+ T cells and infected targets (T) that combines in situ tetramer (IST) staining to detect virus-specific CD8+ T cells and in situ hybridization (ISH) to detect viral-RNA+ cells in the tissues where the battle between immune defenses and infection takes place. The combination of IST staining and ISH, abbreviated ISTH, enables visualization and mapping of the locations of immune effector cells and targets, and facile determination of E:T ratios.  These parameters in turn can then be used to determine the relationships between spatial proximity, and the timing and magnitude of the immune response that predict outcomes in early infection.

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A technique combining in situ tetramer staining and in situ hybridization (ISTH) enables visualization, mapping and analysis of the spatial proximity of virus-specific CD8+ T cells to their virus-infected targets, and determination of the quantitative relationships between these immune effectors and targets to infection outcomes.

Uma técnica para Simultaneamente Visualize-Virus específicos células T CD8 + e células infectadas por vírus In situ</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Análise de célula específico<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Folhas utilizando ordenação células activadas por fluorescência

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

Visualizando bactérias em nematóides por microscopia de fluorescência

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Um Ensaio de Ligação de Alto Rendimento II do MHC para análise quantitativa de Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Detecção de intracelular Expressão Gênica em células vivas de murino, humano e porcino Origem Usando nanopartículas marcados com fluorescência

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Rastreamento e quantificação processos de desenvolvimento em<em&gt; C. elegans</em&gt; Como usar as ferramentas de código aberto

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the lymph node microenvironment in B-cell non-Hodgkin&#39;s lymphoma is analyzed. Subsets of circulating T-follicular helper cells (cTfh), the circulating memory compartment of Tfh cells in the blood, are also perturbed in disease and therefore represent potential novel predictive biomarkers. Peripheral blood-based testing is advantageous because it is relatively non-invasive and allows simple serial monitoring.This article describes a method for isolating CD4+ T-cells from human blood, and further analysis by flow-cytometry to enumerate cTfh cells and the proportions of their various subsets (cTfhPD-1-/+/hi, cTfh1,2,17 and cTfh1/17). The level of these subsets was then compared between normal subjects and patients with lymphoma. We found that the method was robust enough to obtain reliable results from routinely collected patient material. The technique we describe for the analysis can be easily adapted to cell sorting and downstream applications such as RT-PCR.

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Here, a protocol for the isolation and characterization of CD4+ T-cell subsets from human peripheral blood is described. Purified CD4+ T-cells are analyzed by flow cytometry to determine proportions of T-follicular helper cell subsets.

Isolamento de CD4+ T-células e análise de circulação folicular-T Helper (cTfh) célula subconjuntos de citometria de fluxo de 6 cores usando o sangue periférico

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...

Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is essential in revealing cellular events associated with the recruitment and assembly of DNA repair complexes at the site of DNA damage. In the last few years, several powerful tools have been developed to induce site-specific DNA damage. Moreover, novel seminal techniques allow us to study these processes at the single-cell resolution level using both fixed and living cells. Although these techniques have been used to study various biological processes, herein we present the most widely used protocols in the field of DNA repair, Fluorescence Immunostaining (IF) and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), which in combination with endonuclease-based site-specific DNA damage make it possible to visualize and quantify the genomic occupancy of DNA repair factors in a directed and regulated fashion, respectively. These techniques provide powerful tools for the researchers to identify novel proteins bound to the damaged genomic locus as well as their post-translational modifications necessary for their fine-tune regulation during DNA repair.

This article introduces essential steps of immunostaining and chromatin immunoprecipitation. These protocols are commonly used to study DNA damage-related cellular processes and to visualize and quantify the recruitment of proteins implicated in DNA repair.

Visualizando e quantificando danos de DNA específicos do local baseados em endonuclease

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is ...