Este trabalho foi apoiado pela USDA financiamento in-house.

1. preparação
<ol><li>Reunir os equipamentos, materiais e software para gravar e processar o vídeo da planta congelando.<ol>
<li>Começar um congelador programável, definindo o interruptor de alimentação para nae definir a temperatura de 0 ° C. Programa do freezer para chegar-8 ° C a 1 ° C/h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloca um 6 semanas de idade morango planta com flores de 2-5 que foi cultivada em um recipiente de 1 L para o congelador.</li>
	<li>Configurar 2 câmeras IR (por exemplo, as câmeras FLIR T620) usando as cintas de fixação e um pequeno bloco de madeira para produzir o ângulo correto de convergência das lentes. Nota: A distância ideal para o espaço do centro das lentes das 2 câmeras é considerada para ser o mesmo que a distância entre os olhos1 ou cerca de 7 cm.</li>
	<li>Monte as duas câmeras para um jack de laboratório de 10 x 10 cm e posição do jack no freezer perto o suficiente para a planta, para permitir que a imagem a ser focado. Ajustar as câmeras na vertical e na horizontal para que a mesma parte da planta é visível de ambas as câmaras. Use o jack para a posição de ambas as câmaras verticalmente de modo que as 2 imagens contêm uma porção do solo e toda a planta.</li>
	<li>Conecte as 2 câmeras usando um conector USB para as saídas de USB no computador.</li>
	<li>Ligue as 2 saídas de ar condicionado em ambas as câmaras para permitir um monitoramento contínuo das plantas.</li>
</ol>2. computador e configuração do Software para gravação
<ol><li>Abrir 2 janelas (1 janela para cada câmera) do software, clicando duas vezes no ícone para o software da câmera IR 2 x. Siga as instruções no menu de ajuda para conectar a câmera à esquerda na janela da esquerda e a câmera bem na janela da direita. Nota: Os detalhes para utilizar o software podem ser acessados através do menu ajuda. Uma paleta monocromática é o mais adequada para este exemplo, devido a necessidade de utilizar a matiz de vermelho e azul para a renderização em 3D.</li>
	<li>Abra o software de captura de tela clicando duas vezes no ícone para o programa. Ajuste o quadro de captura clicando e arrastando o quadro então inclui ambas as câmeras para permitir que uma captura de tela de ambas as câmeras simultaneamente. Nota: A tela, capturando o fluxo de vídeo de ambas as câmeras simultaneamente é crucial, porque permite uma sincronização perfeita de pontos de vista de esquerda e direita.</li>
	<li>Grave o vídeo em incrementos de 3-h para um processamento mais fácil no software de processamento de vídeo. Nota: É impossível saber exatamente quando a planta irá congelar, então é importante para registro, por algum tempo antes do evento de congelamento. A opção de gravar em segmentos é uma característica deste software, por isso é recomendado que este está definido para gravar para 3h. O software irá automaticamente salvar a gravação de 3-h e então começar uma nova gravação. O arquivo para cada gravação 3-h automaticamente será dada uma sequência numérica após o nome. Cada arquivo de vídeo será de 10 a 20 GB, então certifique-se de que o espaço suficiente está disponível em um disco rígido para múltiplos arquivos deste tamanho.</li>
	<li>Inicie o programa de congelador, selecionando executar no menu de controlador e começar a captura de tela. Em seguida, pressione o botão Rec na janela. Certifique-se de que o contorno mostrando a região da tela sendo capturada fica vermelho.</li>
	<li>Gravar a planta de morango congelamento até-8 ° C e mantenha a temperatura do congelador por 1h.</li>
	<li>Elevar a temperatura do congelador a 2 ° C/h até o congelador é a + 2 ° C. Pare a gravação. Nota: O total de tempo de congelamento é 14 h.</li>
	<li>Converta o arquivo (s) de interesse do. MP4 formato. mov usando um software de conversão de arquivo. Nota: neste caso, um arquivo único 3h contendo 1 ou mais eventos de congelamento será usado.</li>
</ol>3. processamento de vídeo usando um Software de imagem de vídeo
Nota: Software de imagem de vídeo será usado neste exemplo. Tutoriais sobre como usar o software estão disponíveis online. Este exemplo irá assumir um conhecimento básico do software. A compreensão de termos como "composição", "camada" e "render queue", bem como os vários painéis e como manipulá-los, presume-se.
<ol><li>Clique duas vezes em qualquer lugar dentro do painel de projeto para importar o arquivo. mov de interesse para o software de imagem e arraste o arquivo para a composição ícone na parte inferior do painel do projeto. Em seguida, salve o projeto para a mesma pasta que contém os vídeos originais. Nota: O vídeo gravado será visível no painel de visualização.</li>
	<li>Clique no ícone na parte inferior da janela de visualização da Região de interesse e, usando o cursor, delinear apenas a gravação da câmera à esquerda.</li>
	<li>Arraste o mesmo vídeo. MOV para o ícone de composição para criar uma segunda composição do vídeo mesmo. Repita a etapa 3.3, mas desta vez, utilize o cursor para selecionar apenas a câmera direita.</li>
	<li>Selecione a composição > Crop Comp a região de interesse para a vista esquerda. Repita isto para a vista direita. Renomeie cada composição para indicar o que é esquerda e direita.</li>
	<li>Destacar a composição à esquerda clicando sobre ele e, no menu principal no topo, selecionando composição > Add para processar a fila.</li>
	<li>Na fila de render, clique no Módulo de saída e verifique se que o vídeo será processado como um vídeo (por exemplo, um vídeo do QuickTime). Clique no botão Configurações de renderização , para reduzir a resolução para permitir um processamento mais rápido. Clique em saída para, nome a Esquerda de morangoe salve-o na mesma pasta como a gravação original e o projeto. Clique em salvare, em seguida, clique no botão processar na parte superior direita do painel de render.</li>
	<li>Repita a etapa 3.6 para a composição de Morango direito .</li>
	<li>Clique duas vezes no painel de projeto e importar os vídeos Morango esquerda e Direita de morango que só eram prestados.</li>
	<li>Destacar os dois vídeos e arraste-os para o ícone de composição na parte inferior do painel do projeto. Na tela pop-up pedindo a Duração ainda, insira 3 com 5 zeros para uma duração de 3-h. Nota: Ambos os vídeos, precisamente sincronizados, será no painel de projeto, mas apenas o vídeo de nível superior no painel composição será visível.</li>
	<li>Para ver a outra imagem, clique no globo ocular pouco para desativar a camada. Pressione Control/W para permitir um controle rotacional das imagens no painel de visualização, usando o cursor. Usando o cursor e a camada superior, clicando em ligar e desligar, ajuste o aspecto rotacional de topo ou a vista inferior para certificar-se de que ambas as imagens estão no mesmo plano rotacional. Em seguida, ajuste o X - e Y-plano diretamente dentro da sub-rotina de óculos 3D.</li>
	<li>Destacar a camada superior do painel composição e selecione efeito > perspectiva > óculos 3D no menu no topo. Nota: Os parâmetros para o 3D óculos efeito irá aparecer dentro do painel de controle.</li>
	<li>No painel de controle, clique na caixa à direita da "esquerda vista" — se o painel de controle não é separado do painel de projeto, clique na guia painel de controle na parte superior do painel do projeto. Lista os 2 vídeos no painel composição em um menu drop-down, destacar o vídeo na lista para a exibição de"esquerda". Repita este passo para "vista direita".</li>
	<li>Na caixa à direita da vista 3D, selecione Vermelho azul LR.</li>
	<li>Usando óculos vermelho e azul, inspecione a exibição no painel de projeto. Se vista 3D parece ser incorreta, tente clicar em Trocar esquerda-direita. Ajuste a convergência de cena e o Alinhamento Vertical para eliminar qualquer tensão os fantasmas e olho.</li>
	<li>Quando o aspecto 3D do vídeo é aceitável, destaque a composição, clicando sobre ela e selecione a composição > Add para processar a fila como foi feito na etapa 3.7. Processar o vídeo para a mesma pasta que os outros arquivos no projeto. Nota: Este arquivo será bastante grande. Uma vez que o arquivo foi processado, pode ser re-processado para um tamanho de arquivo menor, usando o software de processamento de vídeo.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Geng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+display+technologies.">Three-dimensional display technologies.</a> Advances in Optics and Photonics. 5, 456-535 (2013).</li><li>Ceccardi, T. L., Heath, R. L., Ting, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-temperature+exotherm+measurement+using+infrared+thermography.">Low-temperature exotherm measurement using infrared thermography.</a> HortScience. 30, 140-142 (1995).</li><li>Wimmer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> History of thermal imaging, Security Sales and Integration. , (2011).</li><li>Wisniewski, M., Lindow, S. E., Ashworth, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+of+ice+nucleation+and+propagation+in+plants+using+infrared+video+thermography.">Observations of ice nucleation and propagation in plants using infrared video thermography.</a> Plant Physiology. 113, 327-334 (1997).</li><li>Kuprian, E., Tuong, T., Pfaller, K., Livingston, D. P., Neuner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+supercooling+of+reproductive+shoots+is+enabled+by+structural+ice+barriers+being+active+despite+an+intact+xylem+connection.">Persistent supercooling of reproductive shoots is enabled by structural ice barriers being active despite an intact xylem connection.</a> Public Library of Science ONE. 11, e0163160 (2016).</li><li>Livingston, D. P., Tuong, T. D., Murphy, J. P., Gusta, L., Wisniewski, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-definition+infrared+thermography+of+ice+nucleation+and+propagation+in+wheat+under+natural+frost+conditions+and+controlled+freezing.">High-definition infrared thermography of ice nucleation and propagation in wheat under natural frost conditions and controlled freezing.</a> Planta. 247, 791-806 (2017).</li><li>Boyles, R. P., Raman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+climate+patterns+and+trends+in+North+Carolina+(1949-1998).">Analysis of climate patterns and trends in North Carolina (1949-1998).</a> Environment International. 29 (2-3), 263-275 (2003).</li><li>Poling, E. B., Poling, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+Cold+Events.">Managing Cold Events.</a> A Growers' Guide to Production, Economics and Marketing. , 75-97 (2015).</li><li>Hacker, J., Neuner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice+porpagaion+in+plants+visualized+at+the+tissue+level+by+infrared+differential+thermal+analysis+(IDTA).">Ice porpagaion in plants visualized at the tissue level by infrared differential thermal analysis (IDTA).</a> Tree Physiology. 27, 1661-1670 (2007).</li><li>He, J. Q., Harrison, R. J., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3D+imaging+system+for+strawberry+phenotyping.">A novel 3D imaging system for strawberry phenotyping.</a> Plant Methods. 13, 93-101 (2017).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Duas câmeras IR são necessárias para este protocolo, e eles devem visar o assunto de ângulos ligeiramente diferentes1. Isso exigirá que as lentes para ser de 5 a 8 cm de distância, mas ambos devem visar o mesmo lugar sobre o assunto a ser filmado. Acho que as lentes de câmera de 2 como uma espécie de substituto para os olhos do observador. A câmera esquerda é análoga do olho esquerdo e a direito câmera no olho direito. O software de pós-processamento vai matizar a imagem à esquerda p...

Apesar de viver em um mundo de três dimensões físicas, pesquisadores muitas vezes são limitados a relatar observações visuais em 2D. Embora imagens 2D são geralmente suficientes para transmitir informações importantes, esta falta de informação sobre profundidade restringe nossa capacidade de perceber e compreender a complexidade dos objetos do mundo real. 1
Esta deficiência em informações sobre a profundidade fornecido um incentivo para produzir vídeos 3D principalmente na indústria cinematográfica comercial desde o início dos anos 19001. No entanto, gerando informações claras 3D em ainda imagens e vídeo é prejudicada pelas complexidades envolvidas na produção dessas imagens. A abordagem mais simples para gerar o filme em 3D baseia-se em princípios utilizados em fotografia estereoscópica. Fotografia estereoscópica utiliza duas imagens do mesmo objeto de ângulos ligeiramente diferentes que transmite uma imagem 3D no cérebro. Para que isso seja possível, cada olho deve olhar apenas para sua respectiva imagem (ou seja, o olho esquerdo na imagem à esquerda e o olho direito na imagem à direita). Desde que os olhos não naturalmente o fará, arnês estereoscópico foi concebido para tornar este possível1. Vários estereoscópico visualização técnicas, bem como polarização entrelaçado, tempo-multiplexados e técnicas de cabeça-montagem de exposição, têm sido utilizados durante o desenvolvimento de filmes 3D, mas o método de entrelaçamento de cor ou anaglyph usando vermelho e verde (ou ciano) óculos é uma das técnicas mais simples e menos caras. Para uma revisão abrangente da imagem em 3D e as diversas técnicas envolvidas, consulte a revisão por Geng1.
Monitoramento de congelamento em plantas usando a termografia IR é baseado no princípio que quando a água congela, ele deve desistir de energia interna2. Esta energia é sob a forma de calor, que é detectável na região do espectro eletromagnético de IR. Câmeras capazes de gravar a energia IR estiveram no uso desde 19293. O primeiro relatório publicado usando tecnologia IR ao filme congelando em plantas é de Cecardi et al . 2, mas a resolução da câmera usada torna difícil determinar com precisão o tecido onde o congelamento é iniciado. Wisniewski et al 4 determinados sites mais precisos de nucleação de gelo em várias espécies de plantas, usando uma câmera de resolução mais alta. Como a tecnologia usada em Termografia IR melhorada, imagens de alta resolução levaram a descobertas como entraves ao congelamento5 e a exacta localização celular de formação de gelo6.
Uma dificuldade em filmar temas em IR é causada por pequenas diferenças nas temperaturas. Isso fará com que a maioria dos objetos no campo de visão de ser uma cor semelhante, tornando-se difícil determinar precisamente qual objeto (s) é (é) congelamento. Isso pode ser importante quando determinar a ordem de congelar-se em tecidos específicos, tais como folhas ou raízes em trigo6. Se o vídeo IR de plantas congelamento poderia ser fotografado em 3D, a precisão de determinar qual parte da planta está frio em um certo ponto no tempo poderia ser melhorada.
Morango é das culturas em determinadas áreas dos Estados Unidos em que as temperaturas de congelação são de considerável preocupação para os produtores. Em algumas condições de crescimento, é comum para as flores de morango aparecer 2-3 semanas antes da média na primavera passada congelar. Um evento de congelamento pode ocorrer tão tarde quanto junho em algumas áreas dos Apalaches7 e geralmente resultados na morte da flor. Anti-gelo, portanto, é crítico para congelam de produtores de morango em áreas sujeitas a estes eventos. Produtores de morango na Carolina do Norte, por exemplo, geadam-proteger, em média, entre 4-6 eventos de geada antes de florescer e 1-2 difícil congela durante o início florescem período8. Para ajudar a desenvolver genótipos morangos que são mais tolerantes a congelar, é importante compreender os vários aspectos do congelamento, como os sítios de nucleação de gelo e propagação para outras partes da planta. Termografia IR fornece meios eficazes para solucioná-los.
Aqui, usamos o morango para ilustrar uma técnica para gravação de eventos de congelação em 3D usando o método anáglifo. Morango é adequado para este exemplo, porque as folhas e flores são amplamente distribuídas no espaço 3D e podem ser difícil diferenciar quando visto em vídeos 2D de infravermelhos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="811">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">T620 Infrared Camera and software</td>
			<td style="width:71px;">FLIR</td>
			<td style="width:119px;">55903-5122</td>
			<td style="width:323px;">2 cameras are needed. Software works only on a Windows-based computer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:299px;">After Effects</td>
			<td style="width:71px;">Adobe</td>
			<td style="width:119px;">15.0.1.73</td>
			<td style="width:323px;">Post-Production Video Editing Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Bandicam</td>
			<td style="width:71px;">Bandisoft</td>
			<td style="width:119px;">4.1.2.1385</td>
			<td>Screen Capture Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Laboratory Scissor Jack&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Eisco</td>
			<td style="width:119px;">CH0642A</td>
			<td>Steel Platform 13X15 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Fastening Strap</td>
			<td style="width:71px;">Velcro</td>
			<td style="width:119px;">90441</td>
			<td>To hold camera on jack.&#160; Should be at least 60cm long by 2cm wide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Media Converter</td>
			<td style="width:71px;">iSkysoft</td>
			<td style="width:119px;">10.0.6</td>
			<td>Software to convert mp4 files to .mov&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for producing three-dimensional infrared video of freezing in plants

Congelamento em plantas pode ser monitorado usando termografia infravermelha de (IR), porque quando a água congela, desprende calor. No entanto, problemas com contraste de cor fazem 2-dimensões (2D) infravermelhas imagens um pouco difícil de interpretar. Visualização de uma imagem de IR ou o vídeo de plantas congelando em 3 dimensões (3D) permitiria uma identificação mais rigorosa dos sítios para nucleação de gelo, bem como a progressão de congelamento. Neste artigo, vamos demonstrar um meio relativamente simples para produzir um vídeo 3D infravermelho de uma planta de morango gelada. Morango é uma cultura economicamente importante que está sujeita a inesperada Primavera congelar eventos em muitas áreas do mundo. Uma compreensão precisa do congelamento em morango irá fornecer as criadores e produtores com formas mais econômicos para evitar qualquer dano às plantas durante condições de congelamento.
A técnica envolve um posicionamento de duas câmeras IR em ângulos ligeiramente diferentes para filmar o gelado de morango. Os dois fluxos de vídeo serão precisamente sincronizados usando um software de captura de tela que os registros de ambas as câmeras simultaneamente. As gravações serão importadas para o software de imagem e processadas utilizando uma técnica anaglyph. Usando óculos vermelho e azul, o vídeo 3D será mais fácil para determinar o local exato da nucleação de gelo nas superfícies da folha.

Surpreendentemente, o vídeo de IR da planta de morango gelada (Supplemental vídeo 1) indicou que nem todas as folhas/flores congelou ao mesmo tempo. Ambas as folhas e flores individualmente congelaram em temperaturas diferentes, mas as folhas congelaram mais cedo do que as flores e a uma temperatura mais elevada. Além disso, o congelamento começou nas folhas, mas não necessariamente na mesma posição em cada folha. Enquanto estes resultados não têm sido descritos ...

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Protocol for Producing Three-Dimensional Infrared Video of Freezing in Plants

Aqui, apresentamos um protocolo para uma planta de morango gelada em 3 dimensões de imagem. Duas câmeras de infravermelhas, posicionadas em ângulos ligeiramente diferentes são usadas para produzir um vídeo de anaglyph azul e vermelho para observar o congelamento da planta em 3 dimensões.

Protocolo para a produção de vídeo infravermelho tridimensional de congelamento em plantas

Freezing in plants can be monitored using infrared (IR) thermography, because when water freezes, it gives off heat. However, problems with color contrast ...

protocol-for-producing-three-dimensional-infrared-video-freezing

Research

JoVE Journal

Environment

6.1K visualizações.  United States Department of Agriculture and North Carolina State University. Aqui, apresentamos um protocolo para uma planta de morango gelada em 3 dimensões de imagem. Duas câmeras de infravermelhas, posicionadas em ângulos ligeiramente diferentes são usadas para produzir um vídeo de anaglyph azul e vermelho para observar o congelamento da planta em 3 dimensões.

Vídeo: Protocol for Producing Three-Dimensional Infrared Video of Freezing in Plants

Experimental Protocol for Manipulating Plant-induced Soil Heterogeneity

Coexistence theory has often treated environmental heterogeneity as being independent of the community composition; however biotic feedbacks such as plant-soil feedbacks (PSF) have large effects on plant performance, and create environmental heterogeneity that depends on the community composition. Understanding the importance of PSF for plant community assembly necessitates understanding of the role of heterogeneity in PSF, in addition to mean PSF effects. Here, we describe a protocol for manipulating plant-induced soil heterogeneity. Two example experiments are presented: (1) a field experiment with a 6-patch grid of soils to measure plant population responses and (2) a greenhouse experiment with 2-patch soils to measure individual plant responses. Soils can be collected from the zone of root influence (soils from the rhizosphere and directly adjacent to the rhizosphere) of plants in the field from conspecific and heterospecific plant species. Replicate collections are used to avoid pseudoreplicating soil samples. These soils are then placed into separate patches for heterogeneous treatments or mixed for a homogenized treatment. Care should be taken to ensure that heterogeneous and homogenized treatments experience the same degree of soil disturbance. Plants can then be placed in these soil treatments to determine the effect of plant-induced soil heterogeneity on plant performance. We demonstrate that plant-induced heterogeneity results in different outcomes than predicted by traditional coexistence models, perhaps because of the dynamic nature of these feedbacks. Theory that incorporates environmental heterogeneity influenced by the assembling community and additional empirical work is needed to determine when heterogeneity intrinsic to the assembling community will result in different assembly outcomes compared with heterogeneity extrinsic to the community composition.

Understanding the role of environmental heterogeneity in species coexistence has typically focused on types of heterogeneity that are extrinsic to the community&#8217;s species composition. We provide novel detailed methods for creating soil heterogeneity treatments using soils subject to plant-soil feedback conditioning, or heterogeneity intrinsic to the community composition.

Protocolo experimental para indução-Plant Manipulando heterogeneidade do solo

Coexistence theory has often treated environmental heterogeneity as being independent of the community composition; however biotic feedbacks such as ...

Ambiente

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture organisms, such as hyphae-building fungi and anaerobic bacteria, has hastened the use of recombinant technologies in this field. Plant expression methods are a desirable system for large-scale production of enzymes and other industrially useful proteins. Herein, methods for the transient expression of a fungal endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A, in Nicotiana tabacum are demonstrated. Successful protein expression is shown, monitored by fluorescence using an mCherry-enzyme fusion protein. Additionally, a set of basic tests are used to examine the activity of transiently expressed T. reesei Cel5A, including SDS-PAGE, Western blotting, zymography, as well as&#160;fluorescence and dye-based substrate degradation assays. The system described here can be used to produce an active cellulase in a short time period, so as to assess the potential for further production in plants through constitutive or inducible expression systems.

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Tobacco plants were used to produce a fungal cellulase, TrCel5A, via a transient expression system. The expression could be monitored using a fluorescent fusion protein, and the protein activity was characterized post-expression.

Expressão da proteína recombinante a partir da celulase Cel5A<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; Em Plantas de tabaco

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.

In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.

Medindo Fluxos de nutrientes minerais e substâncias tóxicas em plantas com Traçadores Radioativos

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).

O uso de alta resolução Termografia Infravermelha (Hrit) para o Estudo da Ice Ice nucleação e propagação de plantas

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

Extracting Metrics for Three-dimensional Root Systems: Volume and Surface Analysis from In-soil X-ray Computed Tomography Data

Plant roots play a critical role in plant-soil-microbe interactions that occur in the rhizosphere, as well as processes with important implications to climate change and crop management. Quantitative size information on roots in their native environment is invaluable for studying root growth and environmental processes involving plants. X-ray computed tomography (XCT) has been demonstrated to be an effective tool for in situ root scanning and analysis. We aimed to develop a costless and efficient tool that approximates the surface and volume of the root regardless of its shape from three-dimensional (3D) tomography data. The root structure of a Prairie dropseed (Sporobolus heterolepis) specimen was imaged using XCT. The root was reconstructed, and the primary root structure was extracted from the data using a combination of licensed and open-source software. An isosurface polygonal mesh was then created for ease of analysis. We have developed the standalone application imeshJ, generated in MATLAB1, to calculate root volume and surface area from the mesh. The outputs of imeshJ are surface area (in mm2) and the volume (in mm3). The process, utilizing a unique combination of tools from imaging to quantitative root analysis, is described. A combination of XCT and open-source software proved to be a powerful combination to noninvasively image plant root samples, segment root data, and extract quantitative information from the 3D data. This methodology of processing 3D data should be applicable to other material/sample systems where there is connectivity between components of similar X-ray attenuation and difficulties arise with segmentation.

A methodology for obtaining visual and quantitative root structure information from X-ray computed tomography data acquired in-soil is presented.

Extraindo Métricas para sistemas radiculares tridimensionais: Análise de volume e de superfície de In-solo X-ray tomografia computadorizada de dados

Plant roots play a critical role in plant-soil-microbe interactions that occur in the rhizosphere, as well as processes with important implications to ...

Video Tracking Protocol to Screen Deterrent Chemistries for Honey Bees

The European honey bee, Apis mellifera L., is an economically and agriculturally important pollinator that generates billions of dollars annually. Honey bee colony numbers have been declining in the United States and many European countries since 1947. A number of factors play a role in this decline, including the unintentional exposure of honey bees to pesticides. The development of new methods and regulations are warranted to reduce pesticide exposures to these pollinators. One approach is the use of repellent chemistries that deter honey bees from a recently pesticide-treated crop. Here, we describe a protocol to discern the deterrence of honey bees exposed to select repellent chemistries. Honey bee foragers are collected and starved overnight in an incubator 15 h prior to testing. Individual honey bees are placed into Petri dishes that have either a sugar-agarose cube (control treatment) or sugar-agarose-compound cube (repellent treatment) placed into the middle of the dish. The Petri dish serves as the arena that is placed under a camera in a light box to record the honey bee locomotor activities using video tracking software. A total of 8 control and 8 repellent treatments were analyzed for a 10 min period with each treatment was duplicated with new honey bees. Here, we demonstrate that honey bees are deterred from the sugar-agarose cubes with a compound treatment whereas honey bees are attracted to the sugar-agarose cubes without an added compound.

The loss of honey bee colonies presents a challenge to crop pollination services. Current pollinator protection practices warrant an alternative approach to minimize the contact of honey bees to harmful pesticides using repellent chemistries. Here, we provide detailed methods for a visual tracking protocol to screen deterrents for bees.

Protocolo de rastreamento de vídeo para a tela de quimioterapia para abelhas

The European honey bee, Apis mellifera L., is an economically and agriculturally important pollinator that generates billions of dollars annually. Honey ...

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and stability of the suspension. In this study, a systematic step-wise approach is carried out to identify optimal sonication conditions in order to achieve a stable dispersion. This approach has been adopted and shown to be suitable for several nanomaterials (cerium oxide, zinc oxide, and carbon nanotubes) dispersed in deionized (DI) water. However, with any change in either the nanomaterial type or dispersing medium, there needs to be optimization of the basic protocol by adjusting various factors such as sonication time, power, and sonicator type as well as temperature rise during the process. The approach records the dispersion process in detail. This is necessary to identify the time points as well as other above-mentioned conditions during the sonication process in which there may be undesirable changes, such as damage to the particle surface thus affecting surface properties. Our goal is to offer a harmonized approach that can control the quality of the final, produced dispersion. Such a guideline is instrumental in ensuring dispersion quality repeatability in the nanoscience community, particularly in the field of nanotoxicology.

Here, we present a step-wise protocol for the dispersion of nanomaterials in aqueous media with real-time characterization to identify the optimal sonication conditions, intensity, and duration for improved stability and uniformity of nanoparticle dispersions without impacting the sample integrity.

Dispersão de nanomateriais em meios aquosos: para otimização de protocolo

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...

Development of New Methods for Quantifying Fish Density Using Underwater Stereo-video Tools

The use of video camera systems in ecological studies of fish continues to gain traction as a viable, non-extractive method of measuring fish lengths and estimating fish abundance. We developed and implemented a rotating stereo-video camera tool that covers a full 360 degrees of sampling, which maximizes sampling effort compared to stationary camera tools. A variety of studies have detailed the ability of static, stereo-camera systems to obtain highly accurate and precise measurements of fish; the focus here was on the development of methodological approaches to quantify fish density using rotating camera systems. The first approach was to develop a modification of the metric MaxN, which typically is a conservative count of the minimum number of fish observed on a given camera survey. We redefine MaxN to be the maximum number of fish observed in any given rotation of the camera system. When precautions are taken to avoid double counting, this method for MaxN may more accurately reflect true abundance than that obtained from a fixed camera. Secondly, because stereo-video allows fish to be mapped in three-dimensional space, precise estimates of the distance-from-camera can be obtained for each fish. By using the 95% percentile of the observed distance from camera to establish species-specific areas surveyed, we account for differences in detectability among species while avoiding diluting density estimates by using the maximum distance a species was observed. Accounting for this range of detectability is critical to accurately estimate fish abundances. This methodology will facilitate the integration of rotating stereo-video tools in both applied science and management contexts.

We describe a new method for counting fishes, and estimating relative abundance (MaxN) and fish density using rotating stereo-video camera systems. We also demonstrate how to use distance from camera (Z distance) to estimate species-specific detectability.

Desenvolvimento de novos métodos para quantificar a densidade de peixes usando ferramentas de estéreo-vídeo subaquáticas

The use of video camera systems in ecological studies of fish continues to gain traction as a viable, non-extractive method of measuring fish lengths and ...

Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides

This paper presents detailed methods on detecting hepatic mitochondrial function for a better understanding the cause of metabolic disorders caused by environmental organochlorine pesticides (OCPs) in hepatocytes. HepG2 cells were exposed to &#946;-hexachlorocyclohexane (&#946;-HCH) for 24 h at an equivalent dose of internal exposure in general population. Ultrastructure in hepatocytes was examined by transmission electron microscopy (TEM) to show the damage of mitochondria. Mitochondrial function was further evaluated by mitochondrial fluorescence intensity, adenosine 5'-triphosphate (ATP) levels, oxygen consumption rate (OCR) and mitochondrial membrane potential (MMP) in HepG2 cells incubated with &#946;-HCH. The mitochondria fluorescence intensity after stained by mitochondrial green fluorescent probe was observed with a fluorescence microscopy. The luciferin-luciferase reaction was used to determine ATP levels. The MMP was detected by the cationic dye JC-1 and analyzed under flow cytometry. OCR was measured with an extracellular flux analyzer. In summary, these protocols were used in detecting mitochondrial function in hepatocytes with to investigate mitochondria damages.

Understanding the influence of environmental organochlorine pesticides (OCPs) on mitochondrial function in hepatocytes is important in exploring the mechanism of OCPs causing metabolic disorders. This paper presents detailed methods on detecting hepatic mitochondrial function.

Protocolo Experimental para Detecção de Função Mitocondrial em Hepatócitos Expostos a Pesticidas Organoclorine

This paper presents detailed methods on detecting hepatic mitochondrial function for a better understanding the cause of metabolic disorders caused by ...

Combining Eye-tracking Data with an Analysis of Video Content from Free-viewing a Video of a Walk in an Urban Park Environment

As individuals increasingly live in cities, methods to study their everyday movements and the data that can be collected becomes important and valuable. Eye-tracking informatics are known to connect to a range of feelings, health conditions, mental states and actions. But because vision is the result of constant eye-movements, teasing out what is important from what is noise is complex and data intensive. Furthermore, a significant challenge is controlling for what people look at compared to what is presented to them.
The following presents a methodology for combining and analyzing eye-tracking on a video of a natural and complex scene with a machine learning technique for analyzing the content of the video. In the protocol we focus on analyzing data from filmed videos, how a video can be best used to record participants&#39; eye-tracking data, and importantly how the content of the video can be analyzed and combined with the eye-tracking data. We present a brief summary of the results and a discussion of the potential of the method for further studies in complex environments.

The objective of the protocol is to detail how to collect video data for use in the laboratory; how to record eye-tracking data of participants looking at the data and how to efficiently analyze the content of the videos that they were looking at using a machine learning technique.

Combinando dados de rastreamento de olhos com uma análise de conteúdo de vídeo de livre-visualizando um vídeo de uma caminhada em um ambiente de parque urbano

As individuals increasingly live in cities, methods to study their everyday movements and the data that can be collected becomes important and valuable. ...