Trabalho no laboratório dos autores é apoiado por uma bolsa do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (GM41628) e por um subsídio ao Instituto Stowers de Pesquisa Médica do Nelson Fundo de Investigação Médica Helen na Fundação Comunidade Maior Kansas City.

1 Geração e Cultura de HEK293 Lines Estável célula que expressa Corpo Inteiro ou versões mutantes FLAG marcadas com epítopos INO80 ou outras subunidades INO80 complexos <ol><li> O clone de cDNA que codifica para o comprimento completo ou mutante humano INO80 ATPase ou outra subunidade INO80 no vector de expressão de mamífero pcDNA5 / FRT com um, o terminal N epitopo marcador FLAG em grelha. </li><li> Confirme a sequência dos cDNAs inseridos por sequenciamento de DNA antes de prosseguir. </li><li> Para realizar a transfecção, crescer Flp-Em células HEK293 10 centímetros em pratos de cultura de tecidos em meio contendo DMEM (Dulbecco Modified Eagle Médium), 5% de glutamina, e 10% de FBS (soro fetal bovino). </li><li> Quando as células atingem a ~ 70% de confluência, adicionar a cada placa de cultura de tecido de uma mistura de 40 ul de reagente de transfecção FuGENE6, 0,5 ug do pcDNA5 / FRT do plasmídeo de expressão apropriado, e 9,5 ug de pOG44, que codifica a recombinase Flp, em um volume total de 800 ul. </li><li> 48 horas mais tarde, e s trypsinizeplit células a uma razão de 1:30 em placas de 10 cm, e crescê-las em DMEM com 5% de glutamina, FBS a 10%, e 100 ug / ml de higromicina B para a 3 - 4 semanas. Mude o meio de cultura, sempre que começa a virar amarelo (normalmente a cada 3-5 dias). </li><li> Para identificar os clones positivos que expressam o nível mais elevado de proteína etiquetada com FLAG, seleccionar colónias individuais higromicina B-resistentes e transferi-los para um único poço de uma placa de 24 poços. <ol><li> Uma vez que as células atingirem 80% de confluência, as células de cada poço de colheita em ~ 1 ml de PBS e sedimento por centrifugação a 1000 xg durante 5 min. </li><li> Depois de remover o sobrenadante, ressuspender o sedimento celular em 60 ul de tampão de amostra de SDS-PAGE. </li><li> Assunto metade do pellet celular foi novamente suspensa a SDS página e western blot para monitorar a expressão da bandeira com a tag proteína isca; salvar a outra metade para análises futuras. </li></ol></li><li> Se a proteína INO80 humano marcado com FLAG é detectada em lisados ​​celulares, expanda a popu celular clonal inicialmento adicional por plaqueamento de células a partir de poços individuais de uma placa de 24 poços em placas de cultura de 15 centímetros de tecido. <ol><li> Para colher as células a partir de 15 centímetros pratos, ressuspender perto de células confluentes em PBS gelado e transferir para um tubo de 50 ml. </li><li> Levar o volume final de 50 ml por adição de PBS adicional. </li><li> Células de pellets em 1000 xg durante 5 min, e remover o máximo possível de sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento de células em 1 ml de tampão de Lys450 (20 mM de HEPES-NaOH pH 7,9, NaCl 450 mM, 0,5% Triton X-100, 10 mM de KCl, 4 mM de MgCl2, 0,2 mM EDTA, 10% glicerol, 1 mM de DTT, 200 uM de PMSF, e 1: 1000 Protease Inhibitor Cocktail). NOTA: aqui e em outros lugares, sempre adicionar DTT, PMSF, e inibidor de protease cocktail para buffers imediatamente antes de iniciar um experimento. </li><li> Proteínas a partir do lisado celular total resultante imuno-precipitado FLAG-etiquetado usando 20 ul de gel de agarose de anti-FLAG, e analisar os eluatos FLAG por Western blotting. [Para mais detalhes sobre immunprocedimento oprecipitation, consulte o passo 5] </li></ol></li><li> Prepare os estoques congelados de desejadas linhas de células clonais 12 e armazená-los em nitrogênio líquido até o uso. </li></ol> 2. Crescer linhas celulares HEK293 em frascos cilíndricos Para preparação em grande escala de complexos INO80, células de cultura em cada 10 - 20 garrafas de rolo; um rendimento típico de cada frasco rolante é ~ 1 ml de células embaladas. <ol><li> Para cada garrafa cilíndrica, adicionar 200 ml de DMEM, 5% de glutamina, e 10% de soro de vitelo, sem higromicina B. </li><li> Transferir todas as células a partir de um único quase confluentes 15 centímetros prato em cada frasco rolante </li><li> Garrafas lugar de rolo em um 37 ° C rolo garrafa incubadora e rodam a 0,2 rpm. </li><li> Uma vez que as células chegar a 70% de confluência, deitar fora e descartar o meio. </li><li> Adicionar ~ 50 ml de PBS gelado a cada frasco. Segurando garrafas na horizontal, agite bem para soltar a monocamada de células. </li><li> Transferir as células ressuspensas para 250 ml plastgarrafas cônicas ic e colocar no gelo. </li><li> Lavar frascos cilíndricos com PBS adicional, transferindo-o sequencialmente de garrafa a garrafa. Quando a solução de lavagem não é mais clara (tipicamente depois de ter sido usada para lavar garrafas a cerca de 5), adicionar-se à suspensão de células. </li><li> As células por centrifugação a 400 xg durante 10 min. </li><li> Delicadamente ressuspender as células em PBS, combiná-los em um único frasco cónico de 250 ml, e manter em gelo até ulterior processamento. </li></ol> 3 mediada por siRNA knockdown de INO80 subunidades em células que expressam Outra marcado com FLAG INO80 Subunidade Para obter subcomplexos INO80 falta uma única subunidade, utilização FLAG-imunopurificação para purificar complexos INO80 de células ou células tratadas de siRNA que expressam estavelmente shRNA. O siRNA &quot;reverso&quot; (pequeno RNA de interferência) protocolo de transfecção descrito aqui é otimizado para HEK293 células que crescem em 15 centímetros pratos. O protocolo é de um único prato de 15 centímetros de células e shoUld ser aumentadas proporcionalmente, dependendo do número de células necessárias. Para preparar quantidades úteis do complexo bioquimicamente INO80 de células tratadas com siRNA, deve dimensionar-se a culturas cultivadas em pratos de 40 15 centímetros; estes irão originar aproximadamente 2-4 ml de sedimento globular. <ol><li> Cultivar células HEK293 que expressam estavelmente a subunidade desejada do complexo INO80 para próximo da confluência em pratos de 15 centímetros. </li><li> Adicionar um volume de tampão de ressuspensão siRNA (KCl 20 mM, 6 mM de HEPES pH 7,5, e 0,2 mM de MgCl 2), suficiente para preparar uma solução de estoque 50 mM de siRNA para um tubo contendo liofilizado siRNA. Pipetar a solução para cima e para baixo algumas vezes e incuba-se em um nutator durante 30 min à temperatura ambiente para garantir que o siRNA é totalmente dissolvido. </li><li> Preparar um cocktail de transfecção contendo siRNAs e reagente de transfecção. Misturar 10 ml de solução-mãe de 50 uM siRNA com 32 ul de Lipofectamina RNAiMAX e adicioná-lo aos 4 ml de Opti-MEM Meio de Soro Reduzido com agitação muito suave; albaixos todos os reagentes atinjam a temperatura ambiente antes do uso. </li><li> Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Preparar células Flp-In HEK293 expressando estavelmente a subunidade INO80 desejado para a transfecção. <ol><li> Durante a incubação do Passo 3.4, lave as células nos pratos de 15 centímetros uma vez com PBS temperatura ambiente. </li><li> Depois de retirar PBS, tratar as células com 1 ml de tripsina apenas até que eles começam a levantar a placa. </li><li> Imediatamente adicionar 10 ml de meio completo (DMEM + 5% de glutamina + 10% de FBS) para as células tratadas com tripsina e misturar suavemente. Recolher as células por centrifugação a 1000 xg durante 5 min à TA. </li><li> Ressuspender o sedimento de células em ~ 4 ml de meio completo, e a contagem de células utilizando um ressuspensão hemocitómetro. </li><li> Dilui-se as células com meio completo a uma concentração de ~ 5,4 x 10 6 / ml. </li></ol></li><li> Para cada 15 centímetros prato, adicione 15 ml de meio de cultura completo seguido de 4 ml de transfecção cocktail. Mexa cuidadosamente para garantir a médio e transfecção cocktail são thoroughly misturado. Finalmente, adicionar um ml de suspensão de células e novamente agitar suavemente para dispersar as células uniformemente. </li><li> Após 60 horas de cultura em um 37 ° C, 5% incubadora de CO 2, remover suavemente médio, Ressuspender as células em PBS gelado, e proceder imediatamente a preparar os extractos nucleares. </li></ol> 4 Preparação de Extractos Nucleares Este procedimento foi modificado a partir do protocolo de Dignam 13 e podem ser ajustados para cima ou para baixo, dependendo do tamanho dos agregados de células de partida. Tipicamente, 1 mL de sedimento de células empacotadas rendimento de 1 ml de extracto nuclear final. Todos os tampões devem ser arrefecida com gelo, e todos os passos devem ser realizados numa câmara fria ou em gelo, se um quarto frio adequado não estiver disponível. <ol><li> Isolamento de núcleos: <ol><li> Suavemente transferir células de um tamanho adequado (de 15 ou 50 ml) e graduado de tubo cónico de centrifugação a 1000 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Retirar o sobrenadante, e medir o volume da célula embalada peldeixar. 1 ml de células embaladas corresponde a 3 x 10 ~ 8 de células HEK293. </li><li> Adicionam-se 5 volumes de células embaladas de tampão A (10 mM de HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 10 mM de KCl e recentemente adicionado 1 mM de DTT, 200 uM de PMSF, e 1: 1000 Protease Inhibitor Cocktail). Ressuspender o sedimento de células por pipetagem suave. </li><li> Incubar no gelo por exatamente 10 min. </li><li> Agregar as células a 1.000 xg durante 10 min a 4 ° C, e remover o sobrenadante. </li><li> O tamanho do agregado de células deve aumentar até 2 vezes durante a incubação em tampão A. </li><li> Ressuspender as células em dois volumes de células embaladas de tampão A, e transferir a suspensão de células para um homogeneizador de tamanho apropriado do tecido de Dounce. Se começar com menos de 2 ml de hemácias, usar um homogeneizador de 7 ml; para 2-4 ml hemácias, use um homogeneizador de 15 ml; e para 10 ou mais ml de hemácias, usar um homogeneizador de 40 ml. </li><li> Homogeneizar a suspensão de células com o pilão de vidro solta do homogeneizador un Dounceaté 90% das células coram positivamente com 1% de azul de tripano. </li><li> Transferir a suspensão para um tubo de centrífuga de 45 ml de alta velocidade e de rotação a 25000 xg durante 20 min a 4 ° C num rotor JA-17 ou semelhante (ver Tabela de Materiais / Equipamento). </li><li> A partir do sedimento nuclear, remover o sobrenadante, que contém as proteínas ou as proteínas que vazam para fora do núcleo durante o fraccionamento citosólicas. </li></ol></li><li> Extraindo núcleos com sal: <ol><li> Adicionar tampão C (HEPES 20 mM, pH 7,9, 25% de glicerol, MgCl2 1,5 mM, EDTA 0,2 mM, e adicionada de fresco DTT 1 mM, 200 uM de PMSF, e 1: 1000 Protease Inhibitor Cocktail) para o sedimento nuclear; utilizar 2,5 ml Tampão C para cada 3 ml de começar volume globular (~ 1 x 10 9 células). </li><li> Usando uma vareta de vidro ou uma pipeta, desalojar o sedimento nuclear a partir da parede do tubo e transferir toda a mistura para um homogeneizador de Dounce de um tamanho apropriado. </li><li> Ressuspender os núcleos por homogeneização thmistura e com dois golpes de um pilão solto. </li><li> Transferir a fracção nuclear ressuspendido para uma proveta fria. Escolha uma taça de modo a que a suspensão irá encher o copo de pelo menos 0,5 cm de profundidade. </li><li> Para extrair as proteínas nucleares de cromatina ou outras estruturas insolúveis, gradualmente, aumentar a concentração de sal da suspensão de 0,42 M de NaCl por adição gota a gota de 5 M de NaCl, com agitação suave da suspensão com uma pipeta ou vareta de vidro em gelo; uma vez que todos os 5 M NaCl foi adicionado, a solução deve tornar-se muito viscoso ou semelhante a gel. Calcula-se o volume de 5 M de NaCl necessária para trazer a solução para uma concentração final de 0,42 M de NaCl de acordo com a seguinte fórmula: <img alt="Equação 1" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51720/51720equation1.jpg" width="500" /></li><li> Transferir cuidadosamente a suspensão viscosa em 10 ml tubos de policarbonato para um tipo de 70,1 Ti rotor (ou equivalente) ou 70 ml garrafas de policarbonato para um Tipo 45 Ti or rotor semelhante (ver Tabela de Materiais / Equipamentos). Seal firmemente com parafilme se usar 10 ml ou tubos com conjunto de tampa se estiver usando 70 ml. </li><li> Lentamente balançar os tubos selados a 4 ° C durante 30 min, utilizando um nutator. </li><li> Rodar as amostras em um Tipo 45 Ti ou rotor Ti 70.1 durante 30 minutos a 120.000 x g a 4 ° C. </li><li> Transferir o sobrenadante para um tubo de plástico simples ou garrafa. Este sobrenadante é o extracto nuclear, e o pellet contém cromatina e outros detritos nucleares. </li><li> Dividir o extracto nuclear em alíquotas convenientemente tamanho, congelá-lo em nitrogênio líquido, e armazená-lo a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 5. imunoafinidade purificação do INO80 humano ou INO80 subcomplexos <ol><li> Para descongelar extrato nuclear congelado, tubos lugar contendo o extrato na bancada ou rolo tubos entre as mãos até que o material congelado torna-se uma pasta. Em seguida, colocar os tubos em gelo ou no ambiente frio até que o extracto é completamente thawed. </li><li> Transferir o extracto nuclear descongeladas a 10 ml de tubos de policarbonato de ultracentrífuga, e centrifugação a 100.000 xg durante 20 min a 4 ° C num rotor Ti tipo 70,1 ou equivalente para remover qualquer precipitado que se possa ter formado durante o ciclo de congelação-descongelação. </li><li> Transferir o sobrenadante para um tubo cónico de 15 ml. Adicionar DTT fresco cocktail, PMSF, e Inibidor de Protease para concentrações finais de 1 mM de DTT, 200 uM de PMSF, e 1: 1000 Cocktail de Inibidor de Protease. </li><li> Para preparar a agarose anti-FLAG para a imunopurificação, transferir 200 ul de 50% de pasta de contas de agarose anti-FLAG para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml usando uma pipeta de P200 ou semelhante, com uma ponta da qual a extremidade foi cortada com um bisturi limpa ou lâmina de barbear. </li><li> Agregar as esferas por centrifugação numa microcentrífuga de bancada a 8000 xg durante 30 seg. Remover o sobrenadante e lavar as pérolas por ressuspensão das pérolas em 1 ml de tampão de Lys450 e sedimentar as esferas a 8000 xg durante 30 seg. Lave a beads mais duas vezes. </li><li> Ressuspender as pérolas lavadas de agarose de anti-FLAG em cerca de 100 ul de extracto nuclear, utilizando uma pipeta de P200 ou semelhante de volume ajustável, com uma ponta da qual a extremidade foi cortada com um bisturi limpa ou lâmina de barbear e, usando a mesma ponta, transferência os grânulos em suspensão para o tubo de 15 ml contendo o extrato. Repita algumas vezes até que todos os grânulos foram transferidos para o tubo de 15 ml. </li><li> Incubar a mistura de extracto / pérola durante 4 horas a 4 ° C com rotação lenta em um rotor de laboratório. OPCIONAL: Incluir benzonase a uma concentração de 25 unidades / ml para remover contaminantes de DNA. </li><li> Recolhe-se o FLAG agarose por centrifugação a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender em 10 ml de Lys450 para lavar, incube 5 minutos a 4 ° C com agitação suave num nutator. Agregar as esferas a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender em 100-150 ul de Lys450 e contas de transferência para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Continue para enxaguar o tubo de 15 ml com 100-150 ul de Lys450 até que todos os grânulos foram transferidos para o tubo de microcentrífuga. </li><li> Girar as esferas a 8000 xg durante 30 seg a 4 ° C numa microcentrífuga. Lavar três vezes mais com 1 ml de Lys450 e uma vez com 1 ml de tampão EB100 (10 mM de HEPES pH 7,9, 10% de glicerol, 100 mM de NaCl, 1,5 mM de MgCl2, 0,05% de Triton X-100, e recentemente adicionado DTT a 1 mM, PMSF 200 uM , e 1: 1000 Inibidor de Protease Cocktail). </li><li> Para eluir proteínas ligadas, adicionar tampão EB100 200 mL contendo 0,25 mg / ml peptídeo FLAG 1x. Incubar 30 min a 4 ° C em cada uma nutator. </li><li> Agregar as esferas a 8000 xg durante 30 seg a 4 ° C numa microcentrífuga. Transferir o sobrenadante, que contém o complexo INO80 eluido, para um tubo de microcentrifugação fresco. </li><li> Repete-se a eluição mais quatro vezes, e reunir todos os sobrenadantes para um único tubo. </li><li> Para remover todas as pérolas residual FLAG-agarose a partir da fracção de proteína eluída,passar o eluato através de uma coluna de spin vazio. </li><li> Concentra-se a fracção de proteína eluída ~ 10 vezes utilizando um dispositivo de filtro de ultra-centrífuga (corte de peso molecular de 50.000). </li><li> Para remover o peptídeo FLAG, passar a fracção de proteína concentrada sequencialmente através de duas colunas de dessalinização. </li><li> Dividir a fracção de proteína purificada, dessalinizada em 20 mL alíquotas, congelada em azoto líquido, e armazenado a -80 ° C. </li><li> Analisar a composição de subunidades de INO80 ou subcomplexos INO80 em géis corados com prata ou por transferência de western, e estimar as suas concentrações por western blotting semi-quantitativa usando preparações de subunidades INO80 recombinantes de concentração conhecida como padrões. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Estudos estruturais e funcionais de várias subunidades complexos mamíferos remodelação da cromatina de eucariotos superiores foram prejudicados pela dificuldade de preparar bioquimicamente quantidades úteis de tais complexos contendo subunidades mutantes ou falta certas subunidades completamente. Há um certo número de dificuldades técnicas: Em primeiro lugar, a manipulação genética em células de mamíferos tem sido tecnicamente difícil e demorado. Ao contrário das células de levedura, cujo genoma pode ser...

Família SnF2 complexos de remodelação da cromatina evolutivamente conservadas são reguladores chave da organização da cromatina e acessibilidade DNA 1. Estes complexos de remodelação sempre incluir uma subunidade ATPase centro SnF2 semelhante, o qual, em alguns casos, monta com várias proteínas acessórias e forma de multi-subunidades macro-molecular conjuntos. Para estudar os detalhes moleculares do processo de remodelação da cromatina dependentes de ATP, é importante compreender as contribuições de determinados subconjuntos de subunidades e / ou estruturas de domínio para as atividades dos complexos. Tais análises exigem a capacidade de gerar complexos mutantes puras que não possuem determinadas subunidades de proteínas ou estruturas de domínio. Anteriores estudos de estrutura-função de complexos de remodelação da cromatina dependentes de ATP foram amplamente centrado no sistema modelo de levedura devido à manipulabilidade superior do genoma de uma levedura (ver, por exemplo, refs 1-4). Dada a conservação dacomposição de subunidades e funcionalidade entre os complexos de remodelação ortólogas, estudos da estrutura e função dos complexos de remodelação levedura ter fornecido informações importantes sobre os seus homólogos em eucariotos superiores. No entanto, existem espécies específicas apreciáveis ​​diferenças entre os complexos de remodelação, decorrente de ganho ou perda de espécies específicas subunidades, ganho ou perda de domínios específicos de espécies de subunidades conservadas, ea variabilidade de sequência dentro de domínios conservados de subunidades conservadas. Estas diferenças podem, em princípio, ser conduzido pela necessidade de células eucarióticas superiores a adaptar-se a novos ambientes moleculares e celulares. Assim, a compreensão de como subunidades maiores complexos de remodelação eucarióticas contribuir para o processo de remodelação nucleosome é valioso, porque não só lança luz sobre os mecanismos básicos do processo de remodelação da cromatina ATP-dependente, mas também pode fornecer informações valiosas sobre os mecanismos pelos quais a estrutura da cromatina e expressão gênica em higos eucariontes são regulados. Até o momento, não foram apenas limitado estudos estruturais e funcionais de várias subunidades de mamíferos complexos de remodelação da cromatina, em parte devido às dificuldades na obtenção de complexos de remodelação da cromatina bioquimicamente definidos e subcomplexos. Temos contornada parcialmente estas dificuldades com os procedimentos descritos abaixo, em que a purificação de imunoafinidade é utilizada para preparar INO80 ou INO80 subcomplexos intactas a partir de células humanas que expressam estavelmente FLAG no terminal-N marcada com epitopo do tipo selvagem ou mutantes de versões INO80 5-7 (Figura 1) . Para obter os complexos INO80 intactas de células humanas, a recombinação mediada por Flp é usado para gerar linhas de células HEK293 que expressam estavelmente transgénicos epitopo FLAG tag cDNAs que codificam as subunidades do complexo INO80 8-10. Porque o excesso de expressão de subunidades INO80 pode ser um pouco tóxica, é necessário isolar e manter linhas de células clonais sob co selectivonditions para assegurar a expressão do transgene estável durante as muitas passagens necessárias para a expansão de culturas de células em larga escala. Para obter subcomplexos INO80 menores que contenham apenas um subconjunto de subunidades, temos utilizado com sucesso duas abordagens (Figura 2A, B). No primeiro, podemos gerar linhagens de células HEK293 Flp-In expressando estavelmente versões mutantes de INO80 que não possuem domínios necessários para a interação com subunidades específicas 5. Alternativamente, knockdown siRNA mediada é utilizada para esgotar a subunidade desejada a partir de células que expressam uma subunidade INO80 marcado com FLAG apropriado (dados não publicados). Finalmente, para purificar os complexos INO80 humanos, FLAG cromatografia de agarose com base 11 é utilizada para enriquecer uma fracção contendo INO80 de extractos nucleares, reduzindo de forma eficaz a presença de proteínas contaminantes na fracção citosólica final contendo purificados INO80 ou INO80 subcomplexos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="890">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:173px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:212px;">Cellgro</td>
			<td style="width:147px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax-I (stablized glutamine)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">35050-079</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>SAFC</td>
			<td style="width:147px;">12176C</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FuGENE6 transfection reagent&#160;&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:147px;">E2312</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hygromycin B, sterile in PBS</td>
			<td>AG Scientific</td>
			<td style="width:147px;">H-1012-PBS</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pcDNA5/FRT vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">V6010-20</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Flp-In HEK293 cells&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">R780-07</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">V600520</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZview&#160; Red ANTI-FLAG&#160; M2 Affinity Gel&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F2426</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calf serum</td>
			<td>SAFC</td>
			<td style="width:147px;">12138C</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TARGETplus SMARTsiRNA pool</td>
			<td>Dharmacon / Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">various</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5x siRNA resuspension buffer&#160;</td>
			<td>Dharmacon / Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">#B-002000-UB-100</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine RNAiMAX&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">13778</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">51985-091</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Cellgro</td>
			<td style="width:147px;">45000</td>
			<td style="width:173px;">VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">TrypLE (trypsin)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">12604</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x FLAG Peptide</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F3290</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Bio-Spin Chromatography Column</td>
			<td style="width:212px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:147px;">737-5021</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO)</td>
			<td style="width:212px;">Amicon</td>
			<td style="width:147px;">UFC805024&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba Desalting Columns&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">89882</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Anti-FLAG M2 antibody, mouse</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F3165</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Anti-FLAG M2 antibody, rabbit</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F7425</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">P8340</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">benzonase&#160;</td>
			<td>Novagen</td>
			<td style="width:147px;">70664</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;"></td>
			<td style="width:212px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Equipment</td>
			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wheaton Dounce Tissue Grinders</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td style="width:147px;">06-435C&#160;</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">339080</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JA-17 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">369691</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 ml polycarbonate tubes&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">355630</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70 ml polycarbonate bottles&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">355655</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Type 45 Ti rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">339160</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Type 70.1 Ti rotor&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">342184</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Clay Adams Nutator Mixer</td>
			<td style="width:212px;">BD Diagnostics</td>
			<td style="width:147px;">15172-203&#160;</td>
			<td style="width:173px;">VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glas-Col Tube/Vial Rotator</td>
			<td style="width:212px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:147px;">099A RD4512</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR thermal cycler PTC 200</td>
			<td>MJ Research</td>
			<td style="width:147px;">PTC 200</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">roller bottle incubator</td>
			<td style="width:212px;">Bellco biotechnology</td>
			<td style="width:147px;">353348</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4</td>
			<td style="width:212px;">Millipore</td>
			<td style="width:147px;">IPFL07810</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Costar</td>
			<td style="width:147px;">3207</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and purification of human ino80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes

INO80 complexos de remodelação da cromatina regular a dinâmica nucleossomos e acessibilidade DNA, catalisando ATP-dependente remodelação nucleosome. Complexos INO80 humanos consistem de 14 subunidades de proteína incluindo INO80, um SnF2-como ATPase, que serve tanto como a subunidade catalítica e a armação para a montagem dos complexos. Funções das outras subunidades e os mecanismos pelos quais eles contribuem para a remodelação da cromatina actividade do complexo INO80 permanecem pouco compreendidos, em parte devido à dificuldade de gerar subconjuntos INO80 em células humanas ou de sistemas de expressão heterólogos. Este protocolo JOVE descreve um processo que permite a purificação de subcomplexos INO80 remodelação da cromatina humanos que carecem de uma subunidade ou um subconjunto de subunidades. FLAG no terminal-N marcada com epitopo INO80 cDNA são estavelmente introduzido no rim embrionário humano (HEK) 293 linhas de células que utilizam recombinação mediada por Flp. No caso em que um subconjunto de subunidades do complexo INO80 é abe excluídos, uma vez expressa proteínas INO80 mutantes que não possuem a plataforma necessária para a montagem dessas subunidades. No caso de um indivíduo é a subunidade a ser esvaziada, uma transfects siRNAs voltadas para esta subunidade em uma linha de células HEK 293 que expressam estavelmente FLAG etiquetado INO80 ATPase. Extratos nucleares são preparados, e imunoprecipitação FLAG é realizada para enriquecer frações de proteínas contendo derivados INO80. As composições de subcomplexos INO80 purificadas podem então ser analisados ​​por meio de métodos tais como imunoblot, coloração com prata, e espectrometria de massa. Os INO80 e INO80 subcomplexos gerados de acordo com este protocolo pode ser ainda analisada utilizando vários ensaios bioquímicos, que são descritos no protocolo JOVE acompanha. Os métodos aqui descritos podem ser adaptados para o estudo das propriedades estruturais e funcionais de qualquer mamífero de subunidades múltiplas de remodelação da cromatina e de complexos de modificadores.

A Figura 1 mostra um fluxograma que resume os procedimentos usados ​​para gerar, purificar e caracterizar INO80 dependentes de ATP complexos de remodelação da cromatina humanos. Como ilustrado nas Figuras 2 e 3, estes procedimentos permitem a geração de ambos os tipo INO80 e INO80 subcomplexos selvagens que faltam várias subunidades, permitindo assim análises bioquímicas subsequentes da contribuição destas subunidades que faltam...

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Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Este protocolo descreve um procedimento para gerar e purificação de tipo selvagem e as versões mutantes do complexo remodelação INO80 cromatina humana. Marcada com epitopo versões de subunidades INO80 são estavelmente expressos em células HEK293, e complexos completos e complexos que faltam conjuntos específicos de subunidades são purificados por cromatografia de imunoafinidade.

Geração e Purificação de INO80 cromatina remodelação Complexos Humanos e subcomplexos

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

generation-purification-human-ino80-chromatin-remodeling-complexes

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

DNA and Chromosome Structure

SCIENTISTS IN ACTION

9.7K visualizações.  Stowers Institute for Medical Research.  Este protocolo descreve um procedimento para gerar e purificação de tipo selvagem e as versões mutantes do complexo remodelação INO80 cromatina humana. Marcada com epitopo versões de subunidades INO80 são estavelmente expressos em células HEK293, e complexos completos e complexos que faltam conjuntos específicos de subunidades são purificados por cromatografia de imunoafinidade. 

Vídeo: Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

Purificação e Visualização de Influenza A complexos de ribonucleoproteínas Viral

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Biologia

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte II: Purificação e Cultura de Ilhotas Humanos

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves required for peristalsis and mediate neuronal input from the enteric nervous system1. Different subtypes of ICC form distinct networks in the muscularis of the GI tract 2,3. Loss or injury to these networks is associated with a number of motility disorders4. ICC cells express the KIT receptor tyrosine kinase on the plasma membrane and KIT immunostaining has been used for the past 15 years to label the ICC network5,6. Importantly, normal KIT activity is required for ICC development5,6. Neoplastic transformation of ICC cells results in gastrointestinal stromal tumor (GIST), that frequently harbor gain-of-function KIT mutations7,8. We recently showed that ETV1 is a lineage-specific survival factor expressed in the ICC/GIST lineage and is a master transcriptional regulator required for both normal ICC network formation and for of GIST tumorigenesis9. We further demonstrate that it cooperates with activating KIT mutations in tumorigenesis. Here, we describe methods for visualization of ICC networks in mice, largely based on previously published protocols10,11. More recently, the chloride channel anoctamin 1 (ANO1) has also been characterized as a specific membrane marker of ICC11,12. Because of their plasma membrane localization, immunofluorescence of both proteins can be used to visualize the ICC networks. Here, we describe visualization of the ICC networks by fixed-frozen cyrosections and whole mount preparations.

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are the pacemaker cells of the gastrointestinal (GI) tract. They form complex networks between smooth muscle cells and post-ganglionic neuronal fibers to regulate GI contractility. Here, we present immunofluorescence methods cross-sectional and whole-mount visualization of murine ICC networks.

Visualização das células intersticiais de Cajal Network (ICC) em ratos

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for magnetic resonance imaging (MRI). Many commercially available ligands are especially useful because they contain 
functional groups that allow for fast, high-purity, and high-yielding conjugation to macromolecules and biomolecules via amine-reactive 
activated esters and isothiocyanate groups or thiol-reactive maleimides. While metalation of these ligands is considered common 
knowledge in the field of bioconjugation chemistry, subtle differences in metalation procedures must be taken into account when 
selecting metal starting materials. Furthermore, multiple options for purification and characterization exist, and selection of the most 
effective procedure partially depends on the selection of starting materials. These subtle differences are often neglected in published 
protocols. Here, our goal is to demonstrate common methods for metalation, purification, and characterization of lanthanide complexes 
that can be used as contrast agents for MRI (Figure 1). We expect that this publication will enable biomedical scientists to incorporate 
lanthanide complexation reactions into their repertoire of commonly used reactions by easing the selection of starting materials and 
purification methods.

We demonstrate the metalation, purification, and characterization of lanthanide complexes. The complexes described here can be conjugated to macromolecules to enable tracking of these molecules using magnetic resonance imaging.

Purificação de preparação, e Caracterização de Complexos de lantanídeos para uso como agentes de contraste para Imagem por Ressonância Magnética

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Isolamento de cromatina por purificação de RNA (CHIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases Alzheimer's disease (A&beta;, tau), Parkinson's Disease (&alpha;-synuclein), Huntington's disease (polyglutamine, huntingtin), and others. Protein aggregation is thought to occur due to disturbed proteostasis, i.e. the imbalance between the arising and degradation of misfolded proteins. Of note, the same proteins are found aggregated in sporadic forms of these diseases that are mutant in rare variants of familial forms.
Schizophrenia is a chronic progressive brain condition that in many cases goes along with a permanent and irreversible cognitive deficit. In a candidate gene approach, we investigated whether Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), a gene cloned in a Scottish family with linkage to chronic mental disease1, 2, could be found as insoluble aggregates in the brain of sporadic cases of schizophrenia3. Using the SMRI CC, we identified in approximately 20 % of cases with CMD but not normal controls or patients with neurodegenerative diseases sarkosyl-insoluble DISC1 immunoreactivity after biochemical fractionation. Subsequent studies in vitro revealed that the aggregation propensity of DISC1 was influenced by disease-associated polymorphism S704C4, and that DISC1 aggresomes generated in vitro were cell-invasive5, similar to what had been shown for A&beta;6, tau7-9, &alpha;-synuclein10, polyglutamine11, or SOD1 aggregates12. These findings prompted us to propose that at least a subset of cases with CMD, those with aggregated DISC1 might be protein conformational disorders.
 Here we describe how we generate DISC1 aggresomes in mammalian cells, purify them on a sucrose gradient and use them for cell-invasiveness studies. Similarly, we describe how we generate an exclusively multimeric C-terminal DISC1 fragment, label and purify it for cell invasiveness studies. Using the recombinant multimers of DISC1 we achieve similar cell invasiveness as for a similarly labeled synthetic &alpha;-synuclein fragment. We also show that this fragment is taken up in vivo when stereotactically injected into the brain of recipient animals.

The generation, purification and cell invasion of intracellular, cytoplasmic full length DISC1 protein aggresomes from cell cultures and of a labeled, multimeric recombinant DISC1 protein fragment in E. coli are described. Cell invasiveness is shown for recipient cells in cell culture and for neurons in vivo after stereotactical brain inoculation.

Geração, purificação, caracterização e de Cell-invasivos espécies de proteína Disc1

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Geração de alta Chromatin Template DNA Immunoprecipitation Qualidade para seqüenciamento de alto rendimento (CHIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Produção eficiente e Purificação de recombinante murino Kindlin-3 a partir de células de insetos de Estudos biofísicos

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

Os ensaios bioquímicos para analisar as actividades de ATP-dependente cromatina remodelação Enzimas

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...