Este trabalho foi financiado pelo National Cancer Institute (K08CA140946, para YC), (5F32CA130372, para PC), (R01CA102774 e R01HL055748 a PB), o Departamento de Defesa (PC094302 para YC), o Fundo de Pesquisa da Família Shuman GIST (para PC), eo Consórcio Cancer Starr (para PC, YC, CLS e PB). Gostaríamos de agradecer a Katia Manova, Fan Ning, e Mesurh Turkekul da instalação do núcleo Molecular Citologia MSKCC para ajudar com cryosectioning e imunomarcação.

1. Dissecção do mouse trato GI <ol><li> Camundongos submetidos à eutanásia por locais diretrizes IUCAC </li><li> Pin cada membro na superfície de isopor e enxaguar superfície abdominal com etanol 70%. Abra cavidade abdominal com incisão mediana longo do diafragma para púbis. Fazer um corte no esôfago distal e um segundo corte no intestino distal grande e remover o trato GI do estômago ao ânus em bloco, corte cuidadosamente ligamentos no duodeno e ceco com uma tesoura pequena. Trato GI lugar numa placa de Petri com PBS. Dissecar longe mesentério usando uma pinça (Figura 1). Para separar o estômago, intestino delgado e intestino grosso, cortado em piloro e junção ileocecal. Lavar o lúmen de cada parte do trato GI com PBS usando uma seringa de 5ml preso a uma agulha de alimentação (ratos mais velhos) ou agulha sem corte (ratos mais jovens). </li><li> Estômago aberto, intestino delgado, intestino grosso e ao longo da borda mesentérica. Corte dois pedaços para cada parte do trato gastrointestinal, um para visualização montar todo e um para cryosection. </li></ol> 2. Preparação da amostra toda montagem e imunomarcação <ol><li> Coloque a peça inteira de cada parte do trato gastrointestinal em um tubo de microcentrífuga 1,5 centímetros cheia com 1,0 ml de acetona gelada e amostras de correção para pelo menos 1 hora a 4 ° C. Amostras podem ser armazenadas por até uma semana a -20 ° C. Nós normalmente armazenam amostras em acetona e prossiga para preparar cyrosections. </li><li> Lave 2X amostra com PBS. Colocar a amostra em placa de Petri com PBS. Sob dissecar miscroscope, cuidadosamente raspar camada mucosa com um bisturi, segurando uma ponta com um par de pinças, deixando a muscularis. </li><li> Muscular pode ser cortado em pedaços de 5 mm para coloração com anticorpos diferentes. Não armazenar por mais de dois dias em PBS antes da coloração. </li><li> Passos de bloco e de incubação pode ser feito em um poço de uma placa de 24 poços ou em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Bloco com 0,5 ml de tampão de bloqueio (soro de cabra 5%, 0,1% Triton X-100 em PBS por 1 hora a 4 ° C). </li><li> Incubar com anticorpo primário diluído em tampão de bloqueio e rodar durante a noite a 4 ° C. Temos utilizado com sucesso ACK-2 rato anti-Kit, coelho anti-Ano1, e de coelho anti-Pgp9.5 anticorpos para a imunocoloração montar todo. </li><li> Lavar por 5 min 2X com PBS em rotator em temperatura ambiente. </li><li> Incubar com anticorpo secundário diluído em tampão de bloqueio por 2 horas a temperatura ambiente em rotador. Normalmente usamos Alexa Fluor 488 anti-coelho e Alexa Fluor 594 anti-rato anticorpos. </li><li> Lavar por 15 min 3X com PBS em rotator em temperatura ambiente. </li><li> Montagem no slide, lado seroso em cima para garantir a orientação do tecido durante a microscopia. Esta orientação irá garantir o lado seroso para enfrentar a lamela e ser encontrado primeiro como uma foca no slide em um microscópio. Fazemos isso em um microscópio de dissecação. Às vezes, examinaremos brevemente o tecido sob microscopia de fluorescência para orientar corretamente. Sob microscopia de fluorescência para visualizar Kit ou Ano1, deve-se encontrar o ICC-MY primeira rede do lado da lamela. Em seguida, aspirar PBS, tanto quanto possível, sem secar completamente. Adicionar 50 ul de media set difícil de montagem (usamos Prolong Gold) e coloque delicadamente lamínula em cima do tecido. Permitir configuração de montagem durante a noite a temperatura ambiente e slides armazenar a -80 ° C. </li><li> Para exame microscópico, foi utilizado um microscópio de campo amplo com um Z-drive. Usamos tanto o objectivo de ar 20X (NA 0,75, Apochromat plano) ou objetivo do petróleo 60X (NA 1.4, Apochromat plano) e tomou 2 m ou 1 mícron Z-seções que abrangem a muscularis inteiro. As imagens foram posteriormente deconvoluídos usando software deconvolução Autoquant. Alternativamente, muitos outros usaram microscopia confocal vez com resultados semelhantes. </li></ol> 3. Preparação Cryosection e imunomarcação <ol><li> Coloque cada parte do trato GI, lado seroso baixo, flat em papel de filtro. Corte de papel de filtro em todo o tecido. Coloque o tecido em papel de filtro em paraformaldeído 4% (PFA) em PBS (nós diluir paraformaldeído 32% em frasco lacrado em PBS direito antes do uso) por 2 horas em temperatura ambiente. Fixação pode ser feito em um 6 - ou 12 bem-placa, dependendo do tamanho do tecido, ou em um microtubo de 1,5 ml. Se feito em chapa, parafilme para minimizar a exposição PFA. Vezes mais tempo de fixação pode resultar em mascaramento de antígenos, particularmente para o ACK-2 anticorpo anti-Kit. </li><li> Remover o tecido da PFA e coloque em sacarose 30% em PBS. Permitir que o tecido a afundar durante a noite em 4 ° C. </li><li> Equilibrar tecido com relação 1:1 de sacarose 30% e outubro por 1 hora. Então monte de tecidos verticalmente em cryomold cheia de outubro O eixo longitudinal do trato GI deve ser em paralelo com o cyrosections. Ao examinar os ratos com diferentes genótipos ou com diferentes tratamentos, pode ser útil para a montagem de tecido de ratos em diferentes cryomold mesmo para assegurar o processamento paralelo. Congelamento de gelo seco e colocar em freezer -80 ° C para armazenamento. </li><li> Corte de 10 mM criosecçõesem slide e armazenar a -80 ° C freezer. Nós normalmente cortadas por duas seções de slides. Também costumam fazer H &amp; E de coloração de uma lâmina cryosection. </li><li> Para imunofluorescência, primeiro deslize equilibrar à temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, desenhar círculo em torno do tecido usando caneta PAP. </li><li> Bloco com 150 mL de tampão de bloqueio (o mesmo que para a imunocoloração montar todo) por 1 hora. </li><li> Aspirar tampão de bloqueio e adicionar 150 mL de anticorpo primário diluído em tampão de bloqueio e incubar overnight a 4 ° C em câmara úmida. </li><li> Lavar 5 min 2x com PBS. </li><li> Incubar com anticorpo secundário diluído em tampão de bloqueio por 2 horas em temperatura ambiente. Normalmente usamos Alexa 488 anti-coelho e Alexa 594 anti-rato anticorpos. </li><li> Lavar por 15 min 3X com PBS. </li><li> Aspirar slide sem secagem total do tecido. Adicionar uma gota de set difícil de montagem de mídia com DAPI (usamos Prolong Gold) e coloque # 1.5 lamela. Slides lugar à temperatura ambiente durante a noite para definir e armazenar em freezer -80 C °. </li><li> Adquirir triple imagens de fluorescência usando DAPI, FITC, e define Texas Red filtro. </li></ol> 4. Resultados representativos: Aqui, usamos o intestino grosso como um exemplo. H &amp; E mancha de sacarose protegida fixa de congelação utilizado para imunofluorescência mostra alguns artefatos em comparação com uma seção de parafina de referência (Figura 2), onde a linha amarela demarks do plexo mioentérico entre as camadas musculares circular e longitudinal ea demarks linha verde na fronteira entre o mucosa e muscularlis. Examinando o cryosection, a partir da serosa a mucosa, você primeiro encontro da mais fina camada muscular longitudinal (LM), seguido do circular camada mais espessa do músculo (CM). A seção deve ser em paralelo com o músculo longitudinal para os núcleos de LM deve ser um pouco alongados, enquanto os núcleos do CM deve ser pequeno e redondo. Entre o LM e CM são plexi mioentéricos feito de neurônios que mancha com Pgp9.5. Pgp9.5 também processa manchas neuronal durante todo o CM. A rede mioentéricos ICC (ICC-MY) cercam o plexo mientérico e são feitos de células multipolar. Dentro da camada muscular longitudinal, há ICCs rara intramuscular (ICC-IMs), que são células bipolares operando em paralelo com o músculo. Dentro da camada muscular circular, existem abundantes ICC-IMs que também são células bipolares que correm paralelas com o músculo circular e são seccionadas transversalmente com este corte. Na junção dos muscularis e submucosa, a rede composta por submucosa ICC ICC-SMPs é uma rede fixa de ICCs multipolar. Examinando o Kit montar toda imunocoloração do intestino grosso, deve-se esperar encontrar o ICC-MY primeira rede, e então o ICC-IM do CM, e ICC-SMP redes, como uma foca da lamela (Figura. 3) . Medida volumétrica de redes ICC usando reconstrução 3D de toda montagem de imagens têm sido descritas 10. Usando wide-campo do microscópio, há fluorescência fora do plano significativa nas imagens-primas que podem ser removidos após a deconvolução (Figura 3). Incompleta stripping de mucosa irá resultar em alta fluorescência de fundo. ANO1 é outro marcador da ICC e co imunocoloração de KIT e ANO1 mostra sobreposição completa de ICC coloração (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Representante figura 1. Dissecados do trato gastrointestinal do rato, reimpresso com permissão 13. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. A) Representante H &amp; E coloração do intestino do rato grande de criosecções preparado como descrito e parafina referência incorporados secção que mostra alguns artefatos encolhimento de criosecções. O demarks linha amarela do plexo mioentérico ea linha azul separa a mucosa da muscularis. B) Representante Kit (vermelho, ACK-2) e Pgp9.5 (verde) imunofluorescência dupla com DAPI contracoloração (azul) do intestino de rato grande. LM: CM muscular longitudinal: músculo circular. Barra de escala 20 mM. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Representante Kit (vermelho, ACK-2) imunofluorescência toda montagem do mesmo campo em três planos focais, o ICC-MY avião na fronteira LM / CM, o avião ICC-IM na CM, e-ICC SMP avião na fronteira CM / submucosa. Imagens brutas e imagens deconvoluídos são mostrados. Barra de escala 20 mM. <img src="/files/ftp_upload/2802/2802fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Representante dupla imunofluorescência de Ano1 (verde) e Kit (vermelho, ACK-2) no intestino grosso. Barra de escala 20 mM.

<ol>
	<li>Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+case+for+interstitial+cells+of+Cajal+as+pacemakers+and+mediators+of+neurotransmission+in+the+gastrointestinal+tract.">A case for interstitial cells of Cajal as pacemakers and mediators of neurotransmission in the gastrointestinal tract.</a> Gastroenterology. 111, 492-515 (1996).</li><li>Ward, S. M., Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pathophysiology+of+the+interstitial+cell+of+Cajal:+from+bench+to+bedside.+I.+Functional+development+and+plasticity+of+interstitial+cells+of+Cajal+networks.">Physiology and pathophysiology of the interstitial cell of Cajal: from bench to bedside. I. Functional development and plasticity of interstitial cells of Cajal networks.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 281, 602-611 (2001).</li><li>Komuro, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+organization+of+interstitial+cells+of+Cajal+in+the+gastrointestinal+tract.">Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract.</a> J Physiol. 576, 653-658 (2006).</li><li>Sanders, K. M., Ordog, T., Koh, S. D., Torihashi, S., Ward, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+plasticity+of+interstitial+cells+of+Cajal.">Development and plasticity of interstitial cells of Cajal.</a> Neurogastroenterol Motil. 11, 311-338 (1999).</li><li>Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+the+proto-oncogene+c-kit+blocks+development+of+interstitial+cells+and+electrical+rhythmicity+in+murine+intestine.">Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine.</a> J Physiol. 480, 91-97 (1994).</li><li>Huizinga, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=W/kit+gene+required+for+interstitial+cells+of+Cajal+and+for+intestinal+pacemaker+activity.">W/kit gene required for interstitial cells of Cajal and for intestinal pacemaker activity.</a> Nature. 373, 347-349 (1995).</li><li>Rubin, B. P., Heinrich, M. C., Corless, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+stromal+tumour.">Gastrointestinal stromal tumour.</a> Lancet. 369, 1731-1741 (2007).</li><li>Hirota, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+mutations+of+c-kit+in+human+gastrointestinal+stromal+tumors.">Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors.</a> Science. 279, 577-580 (1998).</li><li>Chi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETV1+is+a+lineage-specific+survival+factor+in+Gastrointestinal+Stromal+Tumour+(GIST).">ETV1 is a lineage-specific survival factor in Gastrointestinal Stromal Tumour (GIST).</a> Nature. , (2010).</li><li>Kwon, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+structure+and+function+of+ICC+networks+in+ICC+hyperplasia+and+gastrointestinal+stromal+tumors.">Changes in the structure and function of ICC networks in ICC hyperplasia and gastrointestinal stromal tumors.</a> Gastroenterology. 136, 630-639 (2009).</li><li>Hwang, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+anoctamin+1/TMEM16A+by+interstitial+cells+of+Cajal+is+fundamental+for+slow+wave+activity+in+gastrointestinal+muscles.">Expression of anoctamin 1/TMEM16A by interstitial cells of Cajal is fundamental for slow wave activity in gastrointestinal muscles.</a> J Physiol. 587, 4887-4904 (2009).</li><li>Gomez-Pinilla, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ano1+is+a+selective+marker+of+interstitial+cells+of+Cajal+in+the+human+and+mouse+gastrointestinal+tract.">Ano1 is a selective marker of interstitial cells of Cajal in the human and mouse gastrointestinal tract.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1370-G1381 (2009).</li><li>Sommer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+stromal+tumors+in+a+mouse+model+by+targeted+mutation+of+the+Kit+receptor+tyrosine+kinase.">Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6706-6711 (2003).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Células intersticiais de Cajal foram inicialmente caracterizados por Santiago Ramóón y Cajal exatamente um século atrás com manchas de azul de metileno e prata cromato de muscularis gastrointestinal. Cajal inicialmente pensado ICC foram neurônios com base em seus processos que são uma reminiscência de axônios e dendritos. Ao longo de muitos anos que se seguiram, o estudo da biologia ICC tem sido limitada pela falta de marcadores específicos, até a descoberta de que o KIT não só se expressa no ICC, mas também é necessário para o seu desenvolvimento 6. Desde então, KIT imunofluorescência tem sido amplamente utilizada no estudo da biologia e ICC também levou à valorização do ICC em outros órgãos contráteis, como a bexiga urinária. Recentemente, ANO1 tem sido identificada como um marcador ICC segundo confiável. Houve inúmeras publicações nos últimos 15 anos através de imunofluorescência para identificar ICC usando vários fixação e técnicas de montagem. Em nossas mãos &quot;fixed-congelados&quot; criosecções que foram prefixados com paraformaldeído e sacarose protegidos funciona melhor em comparação com acetona ou paraformaldeído pós-fixação após cryosectioning. Para montagens todo, descobrimos que a fixação acetona seguido de dissecção da mucosa dá os resultados mais robustos. Historicamente, o ACK-2 foi o anticorpo Kit de escolha para mouse ICC identificação. É um rato monoclonal que reconhece o domínio extracelular e é também um anticorpo de bloqueio que faz com íleo quando administrado a ratos vivem. No entanto, o epítopo ACK-2 é lentamente destruída pela fixação paraformaldeído e não é resgatado por métodos de recuperação padrão antígeno. Descobrimos que o epítopo ACK-4 é mais resistente à fixação paraformaldeído. Em comparação com fixo blocos congelados e seções, blocos parafinados e seções preserva a morfologia melhor e é mais fácil de longo prazo de arquivamento (Figura 4). Nem ACK-2 nem ACK-4 tem sido utilizado com sucesso em seções de parafina. Temos que caracteriza D13A2, um anticorpo monoclonal de coelho nova, funciona muito bem em ambas as seções fixas congelado e parafina do trato gastrointestinal. Kit é expressa em vários outros tipos de células, incluindo os melanócitos, células hematopoiéticas, células germinativas, e em particular que os mastócitos também são encontrados no trato gastrointestinal. Felizmente, a maioria das células são encontradas mastro é a mucosa e não na muscularis. Coloração dupla com coelho anti-rato Ano1 e anti-Kit pode eliminar coloração não específica de cada anticorpo (Figura 4). É importante notar também que a expressão relativa do Kit e Ano1 entre subclasses de ICC parece diferente. Por exemplo, no intestino delgado, coloração Kit é muito mais intensa no ICC mioentéricos em comparação com ICC das profundezas do plexo muscular enquanto Ano1 coloração é comparável.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> anticorpo anti rato Kit (clone ACK-2) </td><td> eBioscience </td><td> 14-1172 </td><td> Use a 2μg/ml. Epitopo é perdido com overfixation. </td></tr><tr><td> anticorpo anti rato Kit (clone ACK-4) </td><td> Cedarlane </td><td> CL8936AP </td><td> Use a 2μg/ml. </td></tr><tr><td> coelho de anticorpos anti-KIT (clone D13A2) </td><td> Sinalização celular </td><td> 3074 </td><td> Use a diluição 1:100. Único anticorpo listados aqui que funciona bem em seções de parafina. </td></tr><tr><td> coelho de anticorpos anti-Pgp9.5 </td><td> Abcam </td><td> ab10404 </td><td> Etiquetas citoplasma da célula neuronal. Útil para marcar os neurônios do plexo mioentérico. Use a 1:1000 diluição. </td></tr><tr><td> coelho de anticorpos anti-Ano1 </td><td> Abcam </td><td> ab53212 </td><td> Use a 2μg/ml </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 cabra anti-IgG de rato </td><td> Invitrogen </td><td> A-11007 </td><td> Use a 2μg/ml </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 cabra anti-IgG de coelho </td><td> Invitrogen </td><td> A-11008 </td><td> Use a 2μg/ml </td></tr><tr><td> Agulha Alimentação Animal </td><td> Pescador </td><td> 01-208-87 </td><td> Silicon ponta de agulha útil para a lavagem do trato GI de ratos adultos </td></tr><tr><td> Agulha Blunt </td><td> Becton Dickison </td><td> 305180 </td><td> Agulha Blunt útil para a lavagem do trato GI de pré-desmamados filhotes </td></tr><tr><td> Prolongar reagente Antifade ouro com DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P-36931 </td><td> Pode usar alternativas hard-configuração de mídia de montagem com DAPI </td></tr><tr><td> Tissue-Tek Cryomold </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4557 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek outubro </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeído 32% (10ml ampola selada) </td><td> EM Sciences </td><td> 15714 </td><td> Ampola selada aberta e diluída a 4% imediatamente antes da utilização </td></tr><tr><td> Tampão de bloqueio </td><td></td><td></td><td> Soro de cabra 5%, 0,1% Triton X-100 em PBS </td></tr></tbody></table>

visualization of the interstitial cells of cajal (icc) network in mice

As células intersticiais de Cajal (ICC) são mesenquimais derivadas &quot;células marca-passo&quot; do trato gastrointestinal (TGI) que geram ondas lentas espontânea necessários para o peristaltismo e mediar entrada neuronal do sistema1 nervoso entérico. Diferentes subtipos de ICC formar redes distintas na muscularis do trato gastrointestinal 2,3. Perdas ou danos a essas redes está associada a uma série de distúrbios de motilidade 4. Células ICC expressar a tirosina quinase do receptor KIT sobre a membrana plasmática e KIT imunocoloração tem sido usado nos últimos 15 anos a label da rede ICC 5,6. Importante, a atividade KIT normal é necessário para o desenvolvimento ICC 5,6. Transformação neoplásica de resultados ICC células no tumor estromal gastrointestinal (GIST), que freqüentemente porto mutações de ganho de função-KIT 7,8. Recentemente, mostrou que ETV1 é um fator de sobrevivência de linhagem específica expressa na linhagem ICC / GIST e é um regulador mestre de transcrição necessários para tanto a formação de rede normal ICC e para de tumorigênese GIST 9. Nós ainda demonstrar que coopera com mutações ativadoras KIT na tumorigênese. Aqui, descrevemos os métodos de visualização de redes de ICC em ratos, em grande parte com base em protocolos previamente publicados 10,11. Mais recentemente, o canal de cloro anoctamin 1 (ANO1) também tem sido caracterizada como um marcador específico de membranas de ICC 11,12. Devido a sua localização membrana plasmática, imunofluorescência de ambas as proteínas podem ser usadas para visualizar as redes ICC. Aqui, descrevemos a visualização das redes fixas por ICC congelado cyrosections e preparações montar todo.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice at JoVE.com

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

As células intersticiais de Cajal (ICC) são as células marcapasso do trato gastrointestinal (TGI). Eles formam redes complexas entre as células do músculo liso e fibras pós-ganglionares neuronal para regular a contratilidade GI. Aqui, apresentamos métodos de imunofluorescência transversal e todo o monte de visualização de redes murino ICC.

Visualização das células intersticiais de Cajal Network (ICC) em ratos

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

visualization-of-the-interstitial-cells-of-cajal-icc-network-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

54.2K visualizações.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. As células intersticiais de Cajal (ICC) são as células marcapasso do trato gastrointestinal (TGI). Eles formam redes complexas entre as células do músculo liso e fibras pós-ganglionares neuronal para regular a contratilidade GI. Aqui, apresentamos métodos de imunofluorescência transversal e todo o monte de visualização de redes murino ICC.

Vídeo: Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

Uma técnica rápida para a visualização de células vivas de levedura Imobilizado

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Biologia

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

Contagem e determinação da viabilidade das células em cultura

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing e Subcultura células de mamíferos

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the structure, function, behavior, and biology of the cells in culture. This video describes the basic skills required to freeze and store cells and how to recover frozen stocks. 

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. This video describes the basic skills required to freeze and store cells and how to recover frozen stocks.

Congelamento, descongelamento e Células de embalagem para transporte

Cultured mammalian cells are used extensively in cell biology studies. It requires a number of special skills in order to be able to preserve the ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Visualização de mRNAs retículo endoplasmático localizados em células de mamíferos

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualização do retículo endoplasmático Subdomains em células cultivadas

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

Visualização de G3BP Estresse grânulos Dynamics em pilhas ao vivo

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...