The authors would like to thank Drs. C. Szalinski, H. Teng, and M. Bruchez for help with Imaris, R. Vistein, and D. Shiwarski for technical help and advice, and Dr. M von Zastrow, Dr. T Kirchhausen, Dr. D Drubin, and Dr. W Almers for reagents and helpful discussion. Funding provided by T32 grant NS007433 to SLB and NIH DA024698 and DA036086 to MAP.

1 Expressão de fluorescência Tagged CME Componentes em células cultivadas HEK293 são células modelo útil que têm sido usados ​​extensivamente para estudar biologia GPCR e endocitose, e, portanto, são utilizados como modelos neste protocolo. Usar qualquer protocolo de transfecção proporcionando expressão uniforme sem superexpressão e baixa citotoxicidade. <ol><li> Pega de toda a cultura de células numa câmara de fluxo laminar estéril. Encha 4 cavidades de uma placa de 12 poços com 1 ml de Dulbecco Modificado meio essencial (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS). A partir de um frasco de T25 confluente de células HEK293 diluir 1:50, 1:25, 1:16, 1:10, respectivamente, em cada um dos quatro poços. <ol><li> Alternativamente, as células semente de uma placa multi-poços de tamanho desejado, de acordo com as instruções do fabricante. Semente 0,4-2 x 10 4 células para uma placa de 12 poços. Crescer as células durante a noite em um estéril 37 ° C com 5% de CO 2 e 95% de humidade. NOTA: Considerando-se que o crescimento rates variam de acordo com as condições e linhas de células, pode ser preferível para semear vários poços para garantir confluência ideal para transfecção no dia seguinte ou a possibilidade de realizar transfections em duplicado. </li></ol></li><li> Na manhã seguinte, selecione um bem que é de aproximadamente 70% confluentes para transfecção (ver Figura 1B). Se nenhum bem chegou a este estado, esperar mais um dia. NOTA: 70% de confluência é ideal para células HEK293. Transfecção de células de que são resultados mais escasso em morte celular e toxicidade. Transfecção de células confluentes sobre-expressão resulta em fraca. </li><li> Adicionar 60 ul de tampão CE (kit de transfecção), 400 ng dos plasmídeos que codificam para os GPCRs etiquetado e / ou de componentes da maquinaria de clatrina e 2,4 ul de potenciadora no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, como descrito no protocolo do fabricante. Vórtice durante 2 segundos para assegurar uma mistura suficiente, e girar numa microcentrífuga a 2000 xg durante 2 segundos para recolher o líquido, na parte inferior. </li><li> Adicionar6 ul Effectene como descritos no protocolo do fabricante. Vortex durante 2 segundos, e rotação a 2.000 x g durante 2 segundos numa microcentrifuga para recolher o líquido, na parte inferior. Esperar durante 20 min para permitir a formação de micelas de complexos de transfecção. </li><li> Aspirar mídia do bem a ser transfectada. Adicionar cuidadosamente 0,8 ml de DMEM com FBS a 10% para a mistura de reagente de transfecção e misturar por pipetagem para cima e para baixo, lentamente, para reduzir a quebra das micelas. Adicionar a mídia e mistura de transfecção para o bem muito lentamente de lado. Adicionar qualquer mistura de transfecção restante do tubo de microcentrífuga para o poço utilizando uma micropipeta. NOTA: Se necessário, adicionar um extra de 0,5 ml de DMEM com FBS a 10% para o bem transfectado para dar as células de alimento extra resultando em transfecção suave e menor expressão transitória. </li><li> Retorne as células para o 37 ° C incubadora por 5 horas. </li><li> Aspirar mídia contendo a mistura de transfecção. Substituir com 1 ml de DMEM com 10% de FBS. Permitiras células a crescer durante a noite. </li><li> No dia seguinte, as células passam a lamelas não revestidos, previamente esterilizado em autoclave. <ol><li> Adicionar 0,5 ml de Tampão Fosfato Salino (PBS) com EDTA a 1 mM a cada poço. Alternativamente, usar 0,5 ml de 0,05% de tripsina-EDTA. Deixar na incubadora durante 1 min. </li><li> Coloque 3 round, estéreis 25 milímetros lamelas nas cavidades de uma placa de 6 poços. Encher cada poço com 2 ml de meio. Empurre a lamela para baixo para o fundo do poço, para evitar que as células que crescem na parte inferior da lamela. </li><li> Agitar manualmente o bem para retirar as células a partir do fundo do poço. Adicionar 1 ml de DMEM com 10% de FBS para ressuspender. Distribua as células levantadas a partir de um poço de uma placa de 12 poços uniformemente entre os três lamelas. Alternativamente, placa células em 3 pratos com fundo de vidro. </li></ol></li><li> Permitir que as células crescem sobre as lamelas durante pelo menos 48 horas antes da imagiologia. Certifique-se de que as células estão espalhados e plana. </li></ol> 2.Imagem CCP e carga Dynamics Usando TIRFM <ol><li> Anticorpos anti-FLAG M1, conjugado com Alexa utilizando corantes Alexa Fluor kit de marcação de proteínas de acordo com o protocolo do fabricante. Alternativamente, os anticorpos pré-conjugados podem ser comprados. </li><li> Pré-incubar células com os anticorpos a uma diluição de 1: 1.000 em 1 ml de meio pré-aquecido Leibovitz com FBS a 10%, ou de Opti-MEM com 50 mM de HEPES pH 7,4 e 10% de FBS durante 10 min a 37 ° C (imagiologia meio), para etiquetar GPCRs marcaram-FLAG na superfície da célula. Ir estes passos se proteínas fluorescentes geneticamente codificados, como GFP, são usados ​​como marcas (veja a discussão para mais detalhes). </li><li> Transfira a lamela para uma câmara de imagem ao vivo de células. Alternativamente, para pratos com fundo de vidro, aspirado media de rotulagem anticorpo e adicionar 700 mL de meio de imagens pré-aquecido. <ol><li> Utilizar um par de pinças e dobrar a ponta de uma agulha de calibre 25 num gancho. </li><li> Segure um par de fórceps na mão dominante. Segure a agulha torta na other. Vire a agulha até que as curvas de gancho baixo em direção ao vidro. Suavemente arraste agulha, o lado do gancho para baixo, através da parte inferior de uma placa de 6 poços até que engancha na lamela. Tome cuidado para não arranhar a superfície da lamela, uma vez que irá retirar células. Suavemente elevar a lamela acima do fundo do poço. Equilibre a lamela contra a parede do poço para o apoio. </li><li> Utilizar as pinças para agarrar perto da extremidade da lamela e mover o lado das células lamela até a câmara de imagem, e montar a câmara. Adicionar 700 mL (ou quantidade adequada) de meio de imagem pré-aquecido. Lidar com as lamelas com cuidado, sem pressão para evitar rachar ou quebrar. </li></ol></li><li> Transferir a câmara para o microscópio e manter a temperatura das células a 37 ° C utilizando um aquecedor de fase ou numa incubadora fechada. </li><li> Traga células em foco usando um objetivo de imersão em óleo 100X ou 60X TIRF (1,45 NA ou acima). Imagem das células em epifluorescência convencional ou conmodos focais de iluminação (ou seja, não TIRFM) para identificar as células que expressam as construções adequadas. Fora de foco células são quase invisíveis na profundidade fina de iluminação TIRF tornando difícil encontrar o plano focal e células. NOTA: Alguns sistemas utilizam os mesmos lasers para TIRFM a imagem em epifluorescência convencional, movendo o ângulo de incidência do laser acima do ângulo crítico. Como uma importante medida de segurança, sempre estar ciente do ângulo do feixe de laser, e sempre dirigi-la longe do observador. </li><li> Concentre-se para baixo para a superfície de fundo de uma célula que expressa até o contorno da membrana plasmática em torno da célula desaparece e o centro da célula aparece. Isto é mais aparente com uma proteína da membrana plasmática de carga localizada, tal como o receptor μ-opióide (ver Figura 2A). </li><li> Mudar para TIRF imagem. <ol><li> Se utilizar os mesmos lasers para formação de imagens de epifluorescência convencional, aumentar o ângulo de incidência dalaser de fluorescência até que fora de foco no interior da célula desaparece, e sem contorno da membrana plasmática em torno da célula é visto. (Compare Figura 2C às Figuras 2A e 2B) NOTA: Em TIRFM, movendo-se no plano focal faz com que a imagem para ir completamente fora de foco e / ou fraca, e os níveis globais de fluorescência diminui devido à menor profundidade de iluminação. Por isso, um método alternativo para a alternar a iluminação TIRFM é primeiro foco no centro da célula de epifluorescência confocal / convencional, então, aumentar o ângulo de incidência até perder a maior parte da fluorescência, e depois concentrar-se para baixo para a membrana plasmática. </li><li> Uma vez em TIRFM, garantir a laser de excitação reflete de volta através do objectivo e não é visível acima do objetivo. Confirme isso verificando se o ponto de laser é visível. NOTA: Nos modos de epifluorescência ou confocal convencional, a iluminação laser é visível acima do objetivo,tal como no teto. </li><li> Limitar o foco para obter uma imagem nítida. Os principais componentes da maquinaria endocítica, como clathrin, será visível nos pontos lacrimais. Ajuste o foco no bem, por isso os pontos lacrimais são tão redonda quanto possível. NOTA: Para carga localizada à membrana, ajustar o foco bem até que o filopodia aparecer distintos. </li><li> Use um programa de aquisição de salvar todos os parâmetros de imagem, como espelhos e ângulo TIRF. Faça isso para todos os comprimentos de onda necessários. </li></ol></li><li> Digitalizar torno da lamela para encontrar as células que expressam todos os marcadores de endocitose desejadas: o receptor μ-opióide e o adaptador β-arrestina, no exemplo mostrado na Figura 3A. Selecione as células que estão expressando, mas não sobre-expressão. Veja a discussão para mais detalhes. </li><li> Uma vez que as células são identificadas, adquirir imagens a cada 3 s por 10 min. Isso é suficiente para captar a vida de uma CCP, uma vez que o tempo médio de vida de um CCP em células HEK293 fotografada nessas condições é around 40 seg 10-11. Isso permite que cerca de 12-14 quadros para observar o PCC. Por exemplo, ver filme 1. Repita todas as etapas de imagem células adicionais. </li></ol> 3 Análise de endocítica Dynamics por verificação manual Embora a verificação manual do PCC vidas é muito limitado pelo número de câmaras de compensação que podem ser detectados, ainda continua a ser um meio preciso de detecção implacável pelas mudanças globais na imagem e detecção de artefatos. Veja a discussão para mais detalhes. <ol><li> Abra o arquivo no ImageJ. As imagens são armazenadas como uma única pilha de arquivos TIFF com canais intercalados. Converta imagens para hyperstacks. Vá em Image&gt; Hyperstacks&gt; pilha para hyperstack. Digite o número de canais adquiridos (ou seja, se as imagens β-arrestin eo receptor μ-opióide, digite 2), Digite 1 para a pilha Z (TIRFM é um único plano), eo número de quadros do filme (ou seja, a 10 min filme em um quadro a cada 3 s is 200) na janela pop-up. </li><li> O formato hyperstack produz uma janela com duas barras de rolagem. Use a barra superior para percorrer os canais e parte inferior para mover através do tempo. Vá até o canal da proteína cuja vida útil será analisada. </li><li> Mover para enquadrar 10 ou 15 do filme para reduzir a inclusão de CCPs pré-existente cujo tempo inteiro não são visíveis. Desenhe uma caixa de ROI em torno de um ponto escolhido ao acaso. </li><li> Conte o número de quadros de um local é visível. NOTA: Ver Figura 3B e 3C para exemplos de três categorias morfológicas de eventos endocíticas 10,11,16-19. </li></ol> 4 Análise de endocítica Dynamics pelo reconhecimento objectivo Objectivo reconhecimento permite a detecção de praticamente todos os CCPs fotografada em uma célula, mas pode ser sujeita a erros, devido à detecção de estruturas espúria erróneos. Veja a discussão para mais detalhes, pesando as vantagens e desvantagens do emétodo ach. Vários programas, incluindo algoritmos de custom-built, pode ser usado para detectar objetivamente CCPs. Este protocolo descreve o reconhecimento objetivo de CCPs usando Imaris, um software de análise de imagens (ver Materiais). <ol><li> Para começar, abra o arquivo de imagem RAW no software de análise de imagens. Por padrão, aparece uma imagem de cor mesclada. Use a janela &quot;Ajuste de Display&quot; para ajustar o brilho de um canal. Clique sobre o nome de um canal para alterar a cor exibida. Desmarque a caixa ao lado do canal para evitar a sua exposição (veja a Figura 4A). </li><li> Criar &quot;spots&quot;, clicando no ícone com manchas laranja. Veja a figura 4B. Selecione uma região de interesse (ROI) em torno da célula. Ver Figura 4C. Use um ROI para excluir áreas que irão detectar incorretamente bordos de ataque brilhantes e placas. Analisar várias células com diferentes níveis de expressão separadamente. </li><li> Meça o diâmetro de um local para proviestimativas iniciais para o algoritmo de. Alternar para o modo &quot;Slice&quot;, e clique em extremidades polares de um ponto para medir seu diâmetro. Ver Figura 4E. Faça isso por 4 ou 5 pontos redondos que parecem indicativo de uma CCP, no auge de sua estabilidade, após a formação e antes de cisão. Use essas medidas para calcular o diâmetro médio até o décimo mais próximo de um mícron. </li><li> Detectar pontos. Voltar ao modo &quot;Superar&quot;. Selecione o canal apropriado para a detecção. Digite o diâmetro médio medido, geralmente 0,3 ou 0,4 m. Clique na seta azul para a frente para quantificar as manchas. Ver Figura 4E. Se o diâmetro dos pontos é subestimada, pontos espúrios de fluorescência será identificado como Spots. Se o diâmetro for demasiado grande, os verdadeiros Spots serão ignorados. Quando em dúvida, estimar um pouco menor, e filtrar as detecções incorretas depois. </li><li> Filtre Spots de Qualidade. Ajuste o filtro para capturar o maior número de pontos possível sem voltachão. O filtro de qualidade é selecionado por padrão 20. Ver Figura 4F. <ol><li> Use a curva de &quot;qualidade&quot; como um guia para definir um limiar adequado. Mova o limite inferior do filtro com o botão esquerdo do mouse para este primeiro mergulho na curva. Este é um bom ponto de partida para o filtro, pois esta posição normalmente refina detecção de Spots apenas visíveis. Ver Figura 4F. </li><li> Spots detectados aparecem no filme como esferas ou centro de pixels. Usando a aba &quot;Cores&quot;, ajustar a cor das manchas de uma cor contrastante para torná-lo mais fácil de vê-los. Percorra o filme para rever os pontos em cada quadro. O objetivo é detectar o maior número de pontos possível para a totalidade de suas vidas. </li><li> Elimina Pontos dimmer ou manualmente conectá-los em faixas contínuas, mais tarde, como eles não são detectados bem com o curso de suas vidas. </li><li> Remover placas brilhantes com um fil &quot;Intensidade&quot;ter, se necessário. Clique no sinal de mais verde para adicionar um novo filtro. Ver Figura 4F. Criar um filtro de Intensidade para filtrar ou reduzir Spots de uma dada sinais de fluorescência. Use a curva gerada Intensidade, (análoga à curva de qualidade discutido em 4.5) para definir o limite. Use o botão esquerdo do mouse para remover o extremo esquerdo da curva que representa os pontos mais brilhantes. NOTA: As grandes estruturas de placas são geralmente entre os elementos mais brilhantes do celular, e eles são facilmente excluídos com este filtro. </li><li> Percorrer o filme para assegurar que as CPCs são detectadas como pontos mais brilhantes e as placas não são mais detectadas. Figura 3D mostra uma célula em que a detecção de PCC (denotado por esferas brancas) foi optimizado com o filtro de qualidade, e as placas foram excluídos com a qualidade filtro. </li><li> Reduzir as arestas de células vivas com o filtro de qualidade. Objectos brilhantes ainda pode necessitar de ser removidas manualmente, na etapa seguinte. Continue com o azularrow. </li><li> Remover manchas anormais na tela Spots Editar. Mudar para &quot;Selecionar&quot; mode. Clique no local. Ele vai se transformar amarelo. Clique em &quot;Excluir&quot;. Clique na seta azul para continuar a construir o algoritmo. Ver Figura 4G. </li></ol></li><li> Faixas medida. Jogo de pistas &quot;movimento Browniano.&quot; O CCP não devem exibir qualquer movimento dirigido, só deriva mínima, através da membrana plasmática. Este algoritmo é o mais adequado para esse movimento. Ver Figura 4H. <ol><li> Defina a Distância Máxima para um pequeno valor como 0,7 m. Ver Figura 4H. NOTA: A definição de uma distância pequena minimiza ligação de pontos adjacentes e ainda permite monitoramento contínuo de um ponto célula através CCP ou movimento celular. </li><li> Defina Max Gap Tamanho para 1 Isso permite uma faixa para continuar se houver falta na sucessão apenas um quadro. Clique na seta azul para calcular as faixas. Ver Figura 4H. NOTA: Gtamanhos ap de mais de 3 faixas diferentes causas para ser incorretamente ligados entre si. </li><li> Mudar de faixa de visualização para &quot;Dragon Tail.&quot; Percorra o filme observando a qualidade de detecção. Se manchas adjacentes estão ligados, diminuir a distância máxima inferior a 0,7 ^ m. Se Spots estão sendo divididos muito rapidamente, aumentar a Max Gap Size. Clique na seta azul para criar faixas. Isto leva à tela de faixas de filtro. Ver Figura 4H. </li></ol></li><li> Filtro faixas e dados de exportação. Use um &quot;Intensidade&quot; filtro para remover placas brilhantes adicionais. Use um &quot;deslocamento&quot; filtro para remover endosomes que entram no campo TIRF. Tenha cuidado, como manchas mais longos terão deslocamentos mais longos também. Clique na seta dupla verde para completar o protocolo. Ver Figura 4I. <ol><li> Use a guia editar faixas, com o ícone de lápis, para remover detecções de falsos positivos de faixas que não puderam ser removidos através de filtros. Verifique se há discontinuities ou ligações falsas. Para conectar duas faixas, selecione-os usando Ctrl-botão esquerdo do mouse, em seguida, clique em &quot;Connect&quot; na caixa de edição Tracks. Para desligar faixas em pontos separados, selecionar uma faixa e clique em &quot;Disconnect&quot;. Selecionar vários pontos com Ctrl + botão esquerdo do mouse e clique em &quot;Connect&quot; para criar uma nova faixa. O método é o mesmo para os pontos de edição, descritas em 4.5.7. Ver Figura 4J. </li><li> Para exportar os dados, vá para a guia Estatísticas. Clique no ícone de um disquete para exportar a estatística selecionada. Clique no ícone que se parece com uma série de disquetes para exportar todas as estatísticas. A estatística &quot;Track Duração&quot; contém o comprimento das faixas de endocitose. Ver Figura 4K. </li></ol></li></ol>

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Saffarian, S., Cocucci, E., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Dynamics+of+Endocytic+Clathrin-Coated+Pits+and+Coated+Plaques.">Distinct Dynamics of Endocytic Clathrin-Coated Pits and Coated Plaques.</a> PLoS Biology. 7 (9), (2009).</li><li>Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo-Mediated+Regulation+of+a+Rapid+Rab4-Dependent+Recycling+Pathway.">Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway.</a> Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).</li><li>Batchelder, E. M., Yarar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Requirements+for+Clathrin-dependent+Endocytosis+at+Sites+of+Cell-Substrate+Adhesion.">Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (17), 3070-3079 (2010).</li><li>Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Single+Endocytic+Events+Reveals+Diversity+in+Clathrin,+Dynamin+and+Vesicle+Dynamics.">Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics.</a> Traffic. 12 (10), 1394-1406 (2011).</li><li>Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+analysis+of+low+signal-to-noise+images+link+dynamin+and+AP2+to+the+functions+of+an+endocytic+checkpoint.">Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint.</a> Dev Cell. 26 (3), 279-291 (2013).</li><li>Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redistribution+of+caveolae+during+mitosis.">Redistribution of caveolae during mitosis.</a> J Cell Sci. 124, 1965-1972 (2011).</li><li>Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+in+bacteria+and+archaea:+versatile+small+RNAs+for+adaptive+defense+and+regulation.">CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation.</a> Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).</li><li>Boch, J., Scholze, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+Code+of+DNA+Binding+Specificity+of+TAL-Type.">Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type.</a> III Effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Aqui descreve-se a utilização de TIRFM visualizar clatrina mediada por endocitose (CME) ao nível das CCP indivíduo em células vivas em tempo real. CME é um evento rápido e altamente dinâmica mediada pelo efeito cumulativo de muitas espacial e temporalmente distintos eventos individuais. A maioria dos ensaios que são usadas atualmente, como dosagens bioquímicas de internalização usando biotinilaï¿½ï¿½o superfície ou de ligação do ligando, citometria de fluxo ou células ensaios de medição fixa quan...

O processo de endocitose mediada por clatrina (CME) é dependente da chegada oportuna dos diversos componentes da maquinaria de endocitose mediada por clatrina para recolher a carga e manipular a membrana plasmática para as vesículas 1-3. CME é iniciada por proteínas deformantes membrana e do adaptador de carga que se juntam em locais de nascentes de endocitose 1. Estas proteínas recrutar o clathrin capa protéica, que reúne em uma estrutura de gaiola que forma o poço revestido de clatrina (CCP) 4. Uma vez que o PCC está totalmente montados em uma forma esférica, cisão membrana, principalmente através da ação do grande GTPase, dynamin, gera vesículas revestidas por clatrina livres (ccvs) 5,6. Esta internalização desencadeia rápida desmontagem do revestimento de clatrina, permitindo que os componentes a serem re-utilizados para múltiplos ciclos de CME. A descoberta e caracterização das proteínas envolvidas no CME foi enraizada na Bioch tradicionalemical, genéticos e técnicas de microscopia 4-6,8. Estes ensaios têm elucidado as funções e pontos de interação destes componentes endocíticas. Embora muito útil para a definição de componentes essenciais de máquinas tráfico, estes ensaios são muito limitados em capturar o comportamento dinâmico de componentes CME ou concentração de carga. Esta é uma limitação fundamental, uma vez CME é impulsionada pela montagem coreografada por conjuntos de módulos de proteína em etapas definidas, e uma vez que pequenas alterações na dinâmica dos eventos endocíticas individuais podem ter grandes conseqüências cumulativas sobre endocitose. Além disso, dados recentes indicam que as CPCs individuais podem diferir tanto na composição como no comportamento, o que sugere que a regulação fisiológica do presente processo é altamente espacialmente e temporalmente restrita 9-14. Visualizando eventos endocíticas individuais, portanto, é essencial para entender por que há várias proteínas redundantes envolvidas na CME e como essas proteínas podem ser controlados bsinais fisiológicos y para regular a internalização de carga. Aqui descreve-se a utilização de reflexão interna total microscopia de fluorescência (TIRFM) para observar o CME ao nível da dinâmica de CPCs individuais em células vivas. TIRFM baseia-se na diferença de índice de refracção entre a lamela de vidro e para o ambiente fluido de células 15,16. Quando a luz de excitação é dirigida para as células em mais do que o ângulo crítico, é reflectida internamente, gerando uma onda evanescente, que mantém uma área de iluminação fina que se estende, aproximadamente, de 100 nm acima da lamela. Isso garante que apenas as moléculas fluorescentes dentro desse estreito campo está animado. Na prática, isto permite a excitação de moléculas fluorescentes em ou perto da membrana do plasma, e minimiza a fluorescência a partir das partes interiores da célula. Isto proporciona uma resolução significativamente mais elevada relação sinal-ruído e do eixo z para visualizar os eventos na membrana plasmática, compared para modos mais habitualmente utilizados tais como epifluorescência convencional ou microscopia de fluorescência confocal. Descrevemos também, a um nível de introdução e prático, a utilização de uma plataforma de análise de imagem utilizada para analisar e quantificar características morfológicas simples e dinâmica dos fenómenos endocíticos cargas individuais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="909">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:180px;">Company</td>
			<td style="width:157px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:207px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">DMEM/High Glucose with L-glutamine and sodium pyruvate</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>SH3024301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS), no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:180px;">Gibco, by Life Technologies</td>
			<td>21600-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">EDTA Free Acid</td>
			<td style="width:180px;">Amresco</td>
			<td style="width:157px;">0322-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:180px;">Gibco, by Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td style="width:180px;">Gibco, by Life Technologies</td>
			<td>21083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:180px;">Gibco, by Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">HEPES</td>
			<td style="width:180px;">CellPURE by Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP2937-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Effectene&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Qiagen</td>
			<td style="width:157px;">301425</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">25 millimeter coverglass</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12-545-86&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Corning cell culture treated flasks, 25cm2</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>10-126-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Cell culture 6-well plate</td>
			<td style="width:180px;">Greiner Bio-One, by VWR</td>
			<td>82050-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Monoclonal ANTI-FLAG M1</td>
			<td style="width:180px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>F3040-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">[D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO)</td>
			<td style="width:180px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>E7384-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit</td>
			<td style="width:180px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">A20173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">ImageJ</td>
			<td style="width:180px;">NIH</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>http://rsb.info.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Imaris Image analysis software</td>
			<td style="width:180px;">BitPLane</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>http://www.bitplane.com/imaris/imaris, for automated analysis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Nikon Eclipse Ti inverted microscope and required accessories including filter cubes and filters</td>
			<td style="width:180px;">Nikon</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">Nikon TIRF arm with required adapters for Nikon Eclipse Ti</td>
			<td style="width:180px;">Nikon</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td>For adjusting angle of incidence</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:367px;">iXon+ EMCCD camera and adapters</td>
			<td style="width:180px;">Andor</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing clathrin-mediated endocytosis of g protein-coupled receptors at single-event resolution via tirf microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Utilizando-de células vivas microscopia TIRF temos registada a dinâmica de endocitose do receptor μ--opióide (MOR), um receptor acoplado a proteína G (GPCR), e a sua endocitose proteína adaptadora β-arrestina. O constructo β-arrestina foi transitoriamente transfectado para uma linha celular que expressa estavelmente MOR utilizando o protocolo delineado na Figura 1, e fotografada 96 horas mais tarde. A MOR na linha celular estável é a N-terminal etiquetado com uma GFP sensível ao pH. Esta prot...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy at JoVE.com

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

Visualizando Endocitose clatrina mediada por receptores acoplados à proteína a resolução de evento único através de microscopia TIRF

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

visualizing-clathrin-mediated-endocytosis-g-protein-coupled-receptors

Research

JoVE Journal

Biology

80.1K visualizações.  Carnegie Mellon University. Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process. 

Vídeo: Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective imaging of fluorescent molecules that are closest to a high refractive index substance such as glass1. In this article, we apply this technique to image exocytosis of synaptic vesicles in retinal bipolar cells isolated from the goldfish retina. These neurons are very suitable for this kind of study due to their large axon terminals. By simultaneously patch clamping the bipolar cells, it is possible to investigate the relationship between pre-synaptic voltage and synaptic release2,3. Synaptic vesicles inside the bipolar cell terminals are loaded with a fluorescent dye (FM 1-43&reg;) by co-puffing the dye and a ringer solution containing a high K+ concentration onto the synaptic terminals. This depolarizes the cells and stimulates endocytosis and consequent dye uptake into the glutamatergic vesicles. After washing the excess dye away for around 30 minutes, cells are ready for being patch clamped and imaged simultaneously with a 488 nm laser. The patch pipette solution contains a rhodamine-based peptide that binds selectively to the synaptic ribbon protein RIBEYE4, thereby labeling ribbons specifically when terminals are imaged with a 561 nm laser. This allows the precise localization of active zones and the separation of synaptic from extra-synaptic events.

In this video, we demonstrate how to label and visualize single synaptic vesicle exocytosis and trafficking in goldfish retinal bipolar cells using total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy.

Exocitose imagem em células da retina com Bipolar Microscopia TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Biologia

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Replicação de DNA visualizar Único molécula com microscopia de fluorescência

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

Em Quantificação in vivo de proteínas G Interações Receptor Acoplado usando espectral Resolvido Microscopia de dois fótons

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

Na imagem in vivo de larvas Drosophila Intact no Sub-celular Resolução

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Receptor de imagem proteína G-Coupled (GPCR) mediada por eventos de sinalização que Quimiotaxia de Controle de Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell or tissue. This process can be analyzed at the level of a single receptor, a population of receptors, or a downstream response. Here we describe how to analyze the downstream response to obtain an estimate of the agonist affinity constant for the active state of single receptors.
Receptors behave as quantal switches that alternate between active and inactive states (Figure 1). The active state interacts with specific G proteins or other signaling partners. In the absence of ligands, the inactive state predominates. The binding of agonist increases the probability that the receptor will switch into the active state because its affinity constant for the active state (Kb) is much greater than that for the inactive state (Ka). The summation of the random outputs of all of the receptors in the population yields a constant level of receptor activation in time. The reciprocal of the concentration of agonist eliciting half-maximal receptor activation is equivalent to the observed affinity constant (Kobs), and the fraction of agonist-receptor complexes in the active state is defined as efficacy (&#949;) (Figure 2).
Methods for analyzing the downstream responses of GPCRs have been developed that enable the estimation of the Kobs and relative efficacy of an agonist 1,2. In this report, we show how to modify this analysis to estimate the agonist Kb value relative to that of another agonist. For assays that exhibit constitutive activity, we show how to estimate Kb in absolute units of M-1.
Our method of analyzing agonist concentration-response curves 3,4 consists of global nonlinear regression using the operational model 5. We describe a procedure using the software application, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). The analysis yields an estimate of the product of Kobs and a parameter proportional to efficacy (&tau;). The estimate of &tau;Kobs of one agonist, divided by that of another, is a relative measure of Kb (RAi) 6. For any receptor exhibiting constitutive activity, it is possible to estimate a parameter proportional to the efficacy of the free receptor complex (&tau;sys). In this case, the Kb value of an agonist is equivalent to &tau;Kobs/&tau;sys 3.
Our method is useful for determining the selectivity of an agonist for receptor subtypes and for quantifying agonist-receptor signaling through different G proteins.

A method for estimating the affinity constant of an agonist for the active state (Kb) of a G protein-coupled receptor is described. The analysis provides absolute or relative measures of Kb depending on whether constitutive receptor activation is measurable. Our method applies to various responses downstream from receptor activation.

Quantificar atividade agonista no G receptores acoplados à proteína

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

Visualizando bactérias em nematóides por microscopia de fluorescência

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce informative probes or labels into expressed receptors that do not perturb receptor function. We used amber codon suppression technology to genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine (azF) at various targeted positions in GPCRs heterologously expressed in mammalian cells. The versatility of the azido group is illustrated here in different applications to study GPCRs in their native cellular environment or under detergent solubilized conditions. First, we demonstrate a cell-based targeted photocrosslinking technology to identify the residues in the ligand-binding pocket of GPCR where a tritium-labeled small-molecule ligand is crosslinked to a genetically-encoded azido amino acid. We then demonstrate site-specific modification of GPCRs by the bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaction that targets the azido group using phosphine derivatives. We discuss a general strategy for targeted peptide-epitope tagging of expressed membrane proteins in-culture and its detection using a whole-cell-based ELISA approach. Finally, we show that azF-GPCRs can be selectively tagged with fluorescent probes. The methodologies discussed are general, in that they can in principle be applied to any amino acid position in any expressed GPCR to interrogate active signaling complexes.

We genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine at various targeted positions in GPCRs and show the versatility of the azido group in different applications. These include a targeted photocrosslinking technology to identify residues in the ligand-binding pocket of a GPCR, and site-specific bioorthogonal modification of GPCRs with a peptide-epitope tag or fluorescent probe.

Geneticamente codificados Molecular Probes para estudar G receptores acoplados à proteína

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

Super-resolution Imaging do Z Anel Cytokinetic em bactérias vivas Usando o Fast-estruturados 3D Iluminação Microscopy (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs). The onset of a reverse pharmacology assay is the cloning and subsequent transfection of a GPCR of interest in a cellular expression system. The heterologous expressed receptor is then challenged with a compound library of candidate ligands to identify the receptor-activating ligand(s). Receptor activation can be assessed by measuring changes in concentration of second messenger reporter molecules, like calcium or cAMP. The fluorescence-based calcium mobilization assay described here is a frequently used medium-throughput reverse pharmacology assay. The orphan GPCR is transiently expressed in human embryonic kidney 293T (HEK293T) cells and a promiscuous G&#945;16 construct is co-transfected. Following ligand binding, activation of the G&#945;16 subunit induces the release of calcium from the endoplasmic reticulum. Prior to ligand screening, the receptor-expressing cells are loaded with a fluorescent calcium indicator, Fluo-4 acetoxymethyl. The fluorescent signal of Fluo-4 is negligible in cells under resting conditions, but can be amplified more than a 100-fold upon the interaction with calcium ions that are released after receptor activation. The described technique does not require the time-consuming establishment of stably transfected cell lines in which the transfected genetic material is integrated into the host cell genome. Instead, a transient transfection, generating temporary expression of the target gene, is sufficient to perform the screening assay. The setup allows medium-throughput screening of hundreds of compounds. Co-transfection of the promiscuous G&#945;16, which couples to most GPCRs, allows the intracellular signaling pathway to be redirected towards the release of calcium, regardless of the native signaling pathway in endogenous settings. The HEK293T cells are easy to handle and have proven their efficacy throughout the years in receptor deorphanization assays. However, optimization of the assay for specific receptors may remain necessary.

The here described fluorescence-based calcium mobilization assay is a medium-throughput reverse pharmacology screening system for the identification of functionally activating ligand(s) of orphan G protein-coupled receptors (GPCRs).

Caracterização dos receptores acoplados à proteína por uma mobilização de cálcio Ensaio baseado em fluorescência

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...