Este protocolo de cultura celular foi projetado para evitar que as células endoteliais da córnea submetam a transição epitelial para mesenquimal durante o isolamento, expansão e subcultura. Culturas celulares são estabelecidas a partir de explanações de tecido córnea, que podem ser reutilizadas para garantir um fornecimento contínuo de células primárias de um doador. Comece revestindo os poços de uma placa de cultura de tecido de seis poços com fator de fixação usando as instruções do fabricante.
Em seguida, adicione um mililitro de cultura média a cada bem codificado. Coloque o lado endotélio da córnea em uma placa de Petri estéril no palco de um microscópio dissecando. Ajuste a iluminação para que a superfície da córnea esteja bem iluminada com contraste suficiente para destacar a camada endotelial, e ajuste o zoom para que a borda e algum endotélio córnea central esteja à vista.
Use fórceps esterilizados para levantar suavemente e rasgar a membrana de Descemet longe do estroma subjacente. Coloque a tira de membrana em um dos poços preparados da placa de cultura, certificando-se de substituir imediatamente a tampa da placa para reduzir o risco de contaminação. Remova as tiras da membrana de Descemet da periferia extrema do endotélio primeiro, e das regiões centrais mais tarde, colocando todas as tiras de uma córnea em um único poço.
Quando terminar, incubar as explantas em uma incubadora de cultura celular umidificada fixada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Monte a câmara superior da câmara micro Boyden colocando um anel O vermelho em seu centro. Use uma trefina de 18 milímetros de diâmetro para perfurar um disco de uma folha de material material em uma placa de corte PTFE.
Em seguida, coloque o disco sobre o anel O vermelho na câmara superior da câmara de Micro Boyden. Enrosque a câmara inferior na câmara superior, fixando o disco do material biológico no meio. E mergulhe a câmara micro Boyden montada em 70% de etanol por uma hora para esterilizá-la.
Após o mergulho, mergulhe completamente a câmara em HBSS estéril por 10 minutos para remover o etanol. Em seguida, lave a câmara em meio de cultura por 10 minutos. E transferir para o meio de cultura dentro de um poço de uma placa de seis poços, certificando-se de que a câmara superior é orientada para cima.
Ajuste o nível do meio para que entre em contato com a superfície inferior da membrana biomaterial, mas não flua para a câmara superior. Pipeta 100 microliters de suspensão celular na membrana na câmara micro Boyden, e incuba-lo na incubadora de cultura tecidual por quatro horas, antes de adicionar meio para submergir completamente a câmara. A maioria das explanações derivadas das córneas de ovelhas de um a dois anos de idade ou doadores humanos com menos de 30 anos de idade ligados a placas de cultura de tecido codificado por fator de apego dentro de uma semana.
Depois de seis semanas, muitas pequenas células bem embaladas estavam presentes ao lado da explanta. Pequenas células bem embaladas dentro das culturas de células endoteliais da córnea são resistentes à digestão com triplo, enquanto as células fibroblásticas maiores são mais sensíveis a ela. Essa diferença foi explorada para remover seletivamente grandes células das culturas antes de transferir as células menores para novas placas.
Foram realizadas análises de farinha de farinha imonal em culturas de células endoteliais da córnea para localizar o ZO-1, uma proteína de junção apertada, e n-cadherina, uma proteína de junção de adesão. Os mesmos anticorpos foram usados tanto para ovelhas quanto para células humanas, e ambas as proteínas foram detectadas nas membranas plasmáticas de células de ambas as espécies. A câmara micro Boyden feita sob medida permitiu que ambos os lados de uma membrana fossem usados como superfícies de cultura celular simultaneamente.
Uma visão transversal de uma construção celular projetada por tecido mostra uma única camada de células endoteliais córneas em uma superfície, e uma cultura multicamadas de células estrobomais córneas na outra. Ao tentar este protocolo, é importante evitar raspar o endotélio com seus fórceps quando você está descascando a membrana de Descemet longe da córnea. Após este procedimento, a integridade de uma camada de célula endotelial da córnea em uma membrana pode ser verificada medindo sua resistência elétrica.
