We thank Dr. Yuval Reiss and Dr. William Breuer for critically reviewing the manuscript and Omri Alfassy for helping in the development of the Ura3-GFP screen assay. We also thank Dr. M. Hochstrasser and Dr. R. Kulka for plasmids and strains. This work was funded by the Israeli Academy of Sciences (grant 786/08) and by the United States-Israel Binational Scientific foundation (grant 2011253).

1. Cultura celular <ol><li> Transformar as células de levedura auxotróficos, adequados, tais como Try467 (Tabela 2), com um plasmídeo contendo (a) um URA3 -degron de fusão e (b) um marcador de selecção adicional para metabólica plasmídeo e manutenção. NOTA: Um exemplo de um plasmídeo adequado é YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-Ura3 (LYS2) (Deg1- UV) Este é um plasmídeo integrativo de levedura contendo uma proteína de fusão que compreende de Deg1 - degron um derivado da transcrição de levedura. factor de mat2 17, epitopo FLAG - para a detecção por imunotransferência, Vma12 - uma proteína ER estável, e Ura3 15,18 (Figura 3A). (Ver Tabela 3 para os plasmídeos usados ​​neste estudo e para exemplos adicionais de plasmídeos apropriados.) </li><li> Para a selecção da manutenção do plasmídeo e, manter as células em placas de agar sintético adequado sob uma Definido (SD) meio sem marcadores de selecção amino ácidos <saté&gt; 19 (Por exemplo, Deg1 -UV é selecionada e mantida sob SD-LYS meios seletivos). </li><li> Cultivar células S / N a 30 ° C num meio SD selectivo adequado para manutenção do plasmídeo, até uma fase estacionária é alcançada. Cresça as células em tubos de ensaio ou em uma placa de 96 cavidades, dependendo do número de amostras a serem examinadas (ponto 2). </li></ol> 2. Preparação de células para análise <ol><li> Quando um pequeno número de amostras (N≤15) está a ser ensaiada, diluir as células e substituir o meio como se segue: <ol><li> Dilui-se 50 ul de células a partir de uma cultura D / N com 150 ul de meio SD por poço numa placa de 96 poços (fundo claro). Note-se, a primeira amostra é designado como branco contém apenas médio. </li><li> Determinar os valores de OD 600 amostras na placa de 96 poços utilizando um leitor de microplacas. </li><li> Calcula-se a OD efectiva 600 em cada poço pela multiplicação da leitura de OD 600 pelo factor de diluição (x4), a partir which o valor da leitura do branco é subtraído. Normalizar os valores resultantes dividindo por 0,55 para obter um caminho de comprimento calculado de 1 cm de acordo com a lei de Beer-Lambert. Note-se, este valor é constante quando se mede o OD 600 de 200 ul de células em uma placa de 96 poços padrão. </li><li> Calcule o volume exato necessário para a obtenção de células de levedura em montante equivalente a DO600 de 0,25 e transferir para um tubo Eppendorf. </li><li> Girar as células a alta velocidade (12.000 xg) durante 1 min. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de meio selectivo apropriado (ver secção 3.1) para se obter DO600 de 0,25. </li><li> Transferir 200 uL das estirpes diluídos para um novo poço de uma placa de 96 poços. </li></ol></li><li> Quando um grande número de amostras (N&gt; 15) estão a ser testados, diluir as células e substituir o meio, sem medição OD 600 anterior, como segue: <ol><li> Transferir 10 ml de células estacionáriascrescida O / N em uma placa de 96 poços para uma nova placa de 96 poços contendo 190 ul (diluição de 1:20) dos meios selectivos apropriados (ver secção 3.1). </li></ol></li></ol> 3. cinética de crescimento em cultura líquida em condições selectivas (Gils) <ol><li> Use os seguintes meios para medições de crescimento utilizando o repórter Ura3-degron: <ol><li> Para controles positivos de crescimento da levedura em condições não restritivas, o uso plasmídeo mídia SD seletiva (ver secção 1.2). Se nenhuma selecção plasmídeo é necessária, por exemplo, quando se usa um plasmídeo integrativo, tal como Deg1 -UV, meio SD contendo todos os aminoácidos necessários (SD completa) pode ser utilizado. </li><li> Para amostras experimentais de medição de crescimento sob condições restritivas, use meio SD-URA. </li></ol></li><li> Definir um leitor de microplacas multimodo para:. Uma temperatura de incubação de 30 ° C, OD 600 intervalos de medição de 15 minutos, e um ciclos orbitais e lineares de agitação de 1 min a cada sete minutos &lt;br /&gt; NOTA: Esta-dual mode tremor foi otimizada para obter uma distribuição homogênea de células; no entanto, outros modos de agitação ou mesmo nenhuma agitação pode funcionar tão bem. </li><li> Incubar as células a 30 ° C num leitor de microplacas O / N ou até que as células tenham atingido a fase estacionária (12-24 h). </li><li> Exportar os dados brutos em um arquivo de planilha. </li><li> Determinar a cinética de crescimento de leveduras utilizando MDTcalc, um programa de software personalizado que calcula o tempo mínimo (em horas) para as células para dobrar seu tamanho populacional (Minimal tempo de duplicação (MDT); para mais detalhes ver seção 4). </li></ol> 4. O cálculo do tempo de duplicação Minimal (MDT): Princípios do Algoritmo MDTcalc NOTA: Princípios do algoritmo MDTcalc, utilizando uma amostra representativa de células de levedura Try467 (Tabela 2) cultivadas em meio completo SD, são ilustrados na Tabela 1 e na Figura 1, que mostra uma folha de cálculo e dados de crescimento parcelas, respecpectivamente. <ol><li> Subtrair OD 600 valores em branco, obtido no respectivo poço, a partir de cada uma das leituras obtidas no poço da amostra. Separe as diferenças resultantes de 0,55 (por placas de 96 poços) para corrigir o comprimento do percurso da luz. Traça-se os valores finais (Tabela 1, Trans.) Contra o tempo para produzir a curva de crescimento de levedura real (OD 600 / hr) (Figura 1A). </li><li> Calcular o log 2 (OD 600) para cada um dos valores transformados para converter a fase logarítmica de crescimento em uma curva linear (Figura 1B). </li><li> Calcular o declive de um intervalo de 10 pontos temporais (N = 10) começando no tempo 0 e movendo um ponto de tempo de cada vez até N &lt;10 (Tabela 1, Pista; Figura 1C). </li><li> Calcula-se o valor inverso de cada inclinação para obter o tempo necessário para a população de células para dobrar (Tabela 1, 1 / Declive; Figura 1C). Calcula-se o mínimo1 / valor Slope para determinar o MDT (Tabela 1, retângulo preto; Figura 1C). Extrai-se a MDT calculada para células na amostra (Tabela 1, 1 / Slope, rectângulo preto) a partir do intervalo de tempo seleccionado (Tabela 1, delineada pelo rectângulo vermelho, as Figuras 1B, 1D). NOTA: A taxa de crescimento celular em meio SD-URA é inversamente proporcional ao MDT. </li></ol> 5. Usando MDTcalc <ol><li> Copie os arquivos de programas suplementados em uma pasta designada no computador. </li><li> Verifique se o arquivo de planilha que contém os dados de crescimento é salvo e fechado. Abra o programa de aplicação MDTcalc para ver o início da tela aparece. <ol><li> Insira as informações necessárias, como demonstrado na Figura 2: <ol><li> Em &#39;Caminho do arquivo &quot;, clique no retângulo à direita para localizar o arquivo de planilha. </li><li> Em &#39;Nome de folha &quot;, escrever o nome da planilha onde tele dados brutos está localizado. </li><li> Em &quot;Posição inicial&quot;, insira coordenar a planilha de tempo 0 da primeira amostra. </li><li> Em &#39;coluna Time&#39;, insira a letra que define a localização da coluna ponto de tempo (tempo deve ser fornecido em segundos). </li><li> Sob &#39;coluna em branco &quot;, inserir a carta que define a localização da coluna em branco (geralmente, mas não necessariamente no poço A1 da placa de 96 poços). </li><li> Em &#39;valor OD&#39;, escolha o valor mínimo transformado OD 600 necessário para o início do cálculo MDT (geralmente ,15-0,25). A definição deste valor impede cálculos de MDT para as culturas em fase de latência, devido à diluição excessiva para que MDT é calculado apenas para as amostras que chegam ao valor DO600 definido ou superior. </li></ol></li><li> Uma vez que o último valor foi inserido, pressione o botão &quot;calcular&quot; na parte inferior da tela. Certifique-se de que a barra de progresso na direita muda gradualmente para green. Não abra o arquivo de planilha durante o processo de cálculo. </li><li> Exportar os dois conjuntos de dados que aparecem automaticamente na tela após a conclusão do cálculo MDT em uma planilha. Certifique-se de que os dados incluem: (a) o valor MDT para cada bem que passa o teste do valor OD mínimo (como definido na seção 5.2.1.6) e (b) o ponto do intervalo a partir do qual o MDT foi calculado o tempo inicial (Iniciar tempo). </li></ol></li></ol>

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	<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).</li><li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system.">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).</li><li>Willems, A. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorder+Targets+Misorder+in+Nuclear+Quality+Control+A+Disordered+Ubiquitin+Ligase+Directly+Recognizes+Its+Misfolded+Substrates.">Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates.</a> Molecular cell. 41, 93-106 (2011).</li><li>Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+heat-stable+polypeptide+component+of+an+ATP-dependent+proteolytic+system+from+reticulocytes.">A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes.</a> Biochemica., &amp; Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).</li><li>Finley, D., Ulrich, H. 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Induction of protein sumoylation by cellular stresses.</a> J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).</li><li>Alani, E., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+type+of+fusion+analysis+applicable+to+many+organisms:+protein+fusions+to+the+URA3+gene+of+yeast.">A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast.</a> Genetics. 117, 5-12 (1987).</li><li>Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+ubiquitin+ligase+of+the+nuclear+envelope/endoplasmic+reticulum+that+functions+in+both+ER-associated+and+Matalpha2+repressor+degradation.">A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation.</a> Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).</li><li>Ravid, T., Kreft, S. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+signals+for+ubiquitin+system+proteolysis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Embo J. 17, 2759-2766 (1998).</li><li>Hochstrasser, M., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+degradation+of+a+transcriptional+regulator:+the+yeast+2+repressor.">In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor.</a> Cell. 61, 697-708 (1990).</li><li>Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+a+cytosolic+protein+requires+endoplasmic+reticulum-associated+degradation+machinery.">Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery.</a> J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).</li><li>Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, (1991).</li><li>Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+catalytic+residue+in+the+ubiquitin-conjugating+enzyme+family.">A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family.</a> Embo J. 22, 5241-5250 (2003).</li><li>Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Fluoroorotic+acid+as+a+selective+agent+in+yeast+molecular+genetics.">5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics.</a> Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).</li><li>Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placing+a+disrupted+degradation+motif+at+the+C+terminus+of+proteasome+substrates+attenuates+degradation+without+impairing+ubiquitylation.">Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation.</a> J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).</li><li>Cronin, S. R., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein+degradation+with+green+fluorescent+protein.">Measuring protein degradation with green fluorescent protein.</a> Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Aqui nós descrevemos um ensaio baseado no crescimento celular para determinar a taxa de degradação da proteína relativos, denominado &#39;A cinética do crescimento em cultura líquida sob condições selectivas &quot;(Gils). O ensaio Gils tem várias vantagens: é simples de configurar, aquisição e análise de dados é simples e é extremamente modular. Consequentemente, Gils podem ser aplicadas simultaneamente para várias amostras em um amistoso formato de placa de multi-usuário que também pode ser adaptado a...

O sistema de degradação da ubiquitina-proteassoma é um importante regulador da máquina, que tem sido implicado na manutenção da homeostase da proteína em todos os eucariotas. A UPS inicialmente conjuga múltiplas moléculas de ubiquitina a uma proteína-alvo, após o que a proteína poli-ubiquitina-marcado é degradado pelo proteassoma 26S. Na maioria dos casos, o passo limitante da velocidade para a degradação mediada por ubiquitina é ubiquitinação substrato, mediada por E2 e E3 conjugar enzimas ligando enzimas (ligases E3) 1. Por conseguinte, a estabilidade intracelular de proteínas específicas reflecte a sua susceptibilidade a ubiquitina-conjugação e a actividade das suas enzimas cognatas ubiquitinação. E3 ligases são os componentes de reconhecimento de substrato principais da UPS. Como tal, estas enzimas reconhecem degrons dentro de seus substratos que estão ausentes ou não expostos em suas contrapartes estáveis ​​2. Por exemplo, muitos reguladores do ciclo celular must ser sintetizado e degradado de uma forma temporal específica, a fim de manter a progressão do ciclo celular em ordem. A degradação destas proteínas é muitas vezes controlada pela fosforilação, mediadas por quinases de sinalização celulares regulados 3,4. Por outro lado, as proteínas anormalmente dobradas são reconhecidos através degrons enigmáticas. Estas são as regiões que normalmente são escondidos na estrutura nativa e estão expostos em cima estrutura perturbação. Tais degrons incluem domínios hidrófobos e segmentos de 5-7 intrinsecamente desordenados 8. Desde a descoberta seminal do sistema ubiquitina-proteína para degradação e a caracterização dos seus fundamentos em lisados ​​de reticulócitos de 9, genética de leveduras foi instrumental na descoberta de muitos dos componentes do sistema ubiquitina 10. O sucesso da levedura como organismo modelo para a análise sistemática da degradação das proteínas pelo UPS é principalmente devido ao fato de que o UPS é altaly conservada em todos os eucariontes 4, juntamente com a sua receptividade como um sistema experimental. De facto, os sistemas à base de levedura são vulgarmente utilizados para decifrar os mecanismos de acção da máquina ubiquitinação. Estudando a degradação da proteína por meios bioquímicos normalmente requer uma preparação de extractos celulares. Enquanto proteínas da célula animal pode ser extraída sob condições relativamente suaves que preservem as interacções e função de proteínas, a presença de uma parede celular de levedura 11 robusto no requer consideravelmente mais severas condições de perturbação, que podem afectar a recuperação de proteína. De fato, diferentes procedimentos de levedura rompimento celular variam consideravelmente em sua capacidade para recuperar proteínas intactas em quantidades que representem corretamente a sua abundância relativa celular. Além disso imprecisão é inerente aos diferentes métodos empregados para a determinação das taxas de degradação de proteínas específicas: experimentos metabólicos à base de rotulagem &#39;pulse-chase&#39; seguido de immunoprecipitation, para isolar proteínas específicas 12, muitas vezes não é estritamente quantitativa. Assim, quando a degradação da proteína é comparada por este método, cuidado extra deve ser tomado na interpretação dos resultados. Para contornar este inconveniente, um ensaio perseguição cicloheximida alternativa (CHX) podem ser empregados 12. Neste ensaio, o inibidor da tradução é adicionado a culturas de células e alterações temporais nos níveis em estado estacionário da proteína são subsequentemente monitorizados. No entanto, o uso de CHX está limitado às proteínas com semi-vidas relativamente curtas (&lt;90 min), como a inibição de longa duração da síntese de proteínas é citotóxica. Notavelmente, ambos os ensaios mencionados acima requerem a utilização de anticorpos específicos para a proteína, o que nem sempre estão disponíveis. Para superar estas limitações técnicas, os investigadores têm desenvolvido vários métodos que não requerem a extracção de células e proteínas manuseamento directo. Uma abordagem baseia-se no estabelecimento de sim auxotróficoestirpes st, obtidos por deleção dos genes que codificam enzimas metabólicas essenciais. Tais genes incluem HIS3, LEU2, LYS2 e TRP1, que codifica para as enzimas necessárias para a biosíntese de aminoácidos, bem como URA3 que codifica OMP-descarboxilase (Ura3), uma enzima essencial da pirimidina ribonucleótido biossíntese. Ura3 tem sido amplamente utilizado em estudos de degradação de proteínas. Nestes ensaios, a expressão constitutiva de Ura3 resgata o crescimento de células ura3 em meio deficiente em uracilo-13. Consequentemente, desestabilizando Ura3 através da fusão de um degron pode diminuir o crescimento das células em meio mínimo sem uracilo. Este método tem sido utilizado em vários estudos de degradação de proteínas, incluindo a identificação dos determinantes da degradação 5, 14 e ligases E3 ubiquitinação auxiliar factores 15 e a descoberta de novos UPS degrons 16. Todos estes métodos empregues crescimento celular em placas de agar como o ensaio de leitura. No entanto, tele critério de crescimento (crescimento positivo / negativo), enquanto robusto e eficiente, é principalmente qualitativa e não fornece informação quantitativa que é importante para avaliar a potência de um degron ou a contribuição relativa dos diversos fatores de degradação auxiliares. Temos, portanto, desenvolvidos e utilizados vetores de levedura e métodos de rastreio que permite uma análise sistemática e quantitativa da degradação de proteínas pela URA3 -degron sistema de fusão. O protocolo baseia-se em um ensaio de manusear fácil que mede a cinética do crescimento na cultura líquido sob condições selectivas (gils) e na geração de curvas de crescimento padrão. Cinética de crescimento de levedura são caracterizados por três fases principais - o atraso, o exponencial (log) e da fase estacionária. Cálculo da cinética de replicação de levedura durante a fase log em condições selectivas, que é determinada pelos níveis de expressão do Ura3-degron, fornece uma medição imparcial o quantitativof degradação da proteína. Este método pode ser aplicado para medir e comparar as taxas de degradação de vários substratos UPS simultaneamente em múltiplas linhagens e sob várias condições.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:184px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:149px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:339px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:184px;">Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>233520</td>
			<td rowspan="6" style="width:339px;">For yeast growth on SD minimal media.&#160; Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium sulfate</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>16325</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adenine</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A8626</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Uracil</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>U0750</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amino acids</td>
			<td>Highest purity available&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:184px;">96 well plates</td>
			<td style="width:149px;">Nunc</td>
			<td style="width:119px;">167008</td>
			<td>Any other compatible brand can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:184px;">Cyclohexamide&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Sigma - Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C7698</td>
			<td>Working conc. 0.5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:184px;">Infinite 200 PRO series</td>
			<td style="width:149px;">Tecan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:339px;">For yeast incubation and OD 600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:184px;">MDTcalc</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Experimental software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation

A degradação das proteínas pelo sistema ubiquitina-proteassoma (UPS) é um importante mecanismo de regulação para a homeostase da proteína em todos os eucariotas. A abordagem padrão para determinar a degradação da proteína intracelular se baseia em ensaios bioquímicos para seguir a cinética de declínio proteína. Tais métodos são frequentemente trabalhoso e demorado e, portanto, não passível de experiências destinadas a avaliar múltiplos substratos e as condições de degradação. Como alternativa, ensaios baseados em células de crescimento têm sido desenvolvidos, que são, no seu formato convencional, ensaios de ponto final, que não é possível determinar quantitativamente as mudanças relativas nos níveis de proteína. Aqui, descrevemos um método que determina fielmente as alterações nas taxas de degradação de proteínas por acoplamento los a uma cinética de crescimento de levedura célula. O método é baseado em um sistema de seleção estabelecido em uracila Auxotrofia de URA3 -deleted células de levedura é resgatado por uma proteína repórter exogenamente expressa, Composta de uma fusão entre o gene URA3 essencial e determinante degradação (degron). A proteína repórter é concebido de modo a que a sua taxa de síntese é constante enquanto que a sua taxa de degradação é determinada pela degron. Como o crescimento celular em meio deficiente em uracilo-é proporcional aos níveis relativos de Ura3, cinética de crescimento são inteiramente dependentes da degradação da proteína repórter. Este método mede com precisão mudanças na cinética de degradação de proteínas intracelulares. Aplicou-se a: (a) Avaliação da contribuição relativa dos factores de conjugação de ubiquitina conhecidos à proteólise (b) E2 enzima de conjugação de estrutura-função de análises (c) Identificação e caracterização de novos degrons. A aplicação do sistema baseado URA3 degron- transcende o campo de degradação de proteínas, como pode também ser adaptada para a monitorização das alterações dos níveis de proteína associados com as funções de outras vias celulares.

Investigar o papel das enzimas da via Doa10 na degradação de um substrato de repórter Para testar a validade do método gils que foi comparado com um ensaio de degradação de tradicional. Esta experiência avalia a contribuição relativa dos componentes da membrana localizada ER-Doa10-ligase E3 complexo de 20,21 para a degradação do substrato de proteína repórter de controlo de qualidade Deg1- VU (Figura 3A). O plasmídeo Deg...

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Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Baseada Reporter ensaio de crescimento para análise sistemática de degradação de proteínas

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.6K visualizações.  The Hebrew University of Jerusalem. Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Vídeo: Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Actina Ensaio Co Sedimentação; para a Análise da proteína de ligação a F-Actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Biologia

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Usando o sistema de fracionamento GELFREE 8100 para Fracionamento baseada no peso molecular com Recovery Fase Líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Vídeo Bioinformática Análise de Crescimento Humano embrionárias Colony Stem Cell

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Determinação baseado no crescimento e confirmação bioquímica de Requisitos Genéticos para a degradação de proteínas em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Cicloheximida Análise perseguição de degradação da proteína em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Os ensaios para a degradação de proteínas em células deformadas

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

A Hydroponic Co-cultivation System for Simultaneous and Systematic Analysis of Plant/Microbe Molecular Interactions and Signaling

An experimental design mimicking natural plant-microbe interactions is very important to delineate the complex plant-microbe signaling processes. Arabidopsis thaliana-Agrobacterium tumefaciens provides an excellent model system to study bacterial pathogenesis and plant interactions. Previous studies of plant-Agrobacterium interactions have largely relied on plant cell suspension cultures, the artificial wounding of plants, or the artificial induction of microbial virulence factors or plant defenses by synthetic chemicals. However, these methods are distinct from the natural signaling in planta, where plants and microbes recognize and respond in spatial and temporal manners. This work presents a hydroponic cocultivation system where intact plants are supported by metal mesh screens and cocultivated with Agrobacterium. In this cocultivation system, no synthetic phytohormone or chemical that induces microbial virulence or plant defense is supplemented. The hydroponic cocultivation system closely resembles natural plant-microbe interactions and signaling homeostasis in planta. Plant roots can be separated from the medium containing Agrobacterium, and the signaling and responses of both the plant hosts and the interacting microbes can be investigated simultaneously and systematically. At any given timepoint/interval, plant tissues or bacteria can be harvested separately for various &#34;omics&#34; analyses, demonstrating the power and efficacy of this system. The hydroponic cocultivation system can be easily adapted to study: 1) the reciprocal signaling of diverse plant-microbe systems, 2) signaling between a plant host and multiple microbial species (i.e.&#160;microbial consortia or microbiomes), 3) how nutrients and chemicals are implicated in plant-microbe signaling, and 4) how microbes interact with plant hosts and contribute to plant tolerance to biotic or abiotic stresses.

The described hydroponic cocultivation system supports intact plants with metal mesh screens and cocultivates them with bacteria. Plant tissue, bacteria, and secreted molecules can then be separately harvested for downstream analyses, simultaneously allowing for the molecular responses of both plant hosts and interacting microbes or microbiomes to be investigated.

Um sistema de co-cultivo hidropônico para análise simultânea e sistemática de interações e sinalização moleculares de plantas/microorganismos

An experimental design mimicking natural plant-microbe interactions is very important to delineate the complex plant-microbe signaling processes. ...

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the systems level. Recent studies have reported correlations between bacterial growth and genome-wide events, such as genome reduction and transcriptome reorganization. Correctly analyzing bacterial growth is crucial for understanding the growth-dependent coordination of gene functions and cellular components. Accordingly, the precise quantitative evaluation of bacterial growth in a high-throughput manner is required. Emerging technological developments offer new experimental tools that allow updates of the methods used for studying bacterial growth. The protocol introduced here employs a microplate reader with a highly optimized experimental procedure for the reproducible and precise evaluation of bacterial growth. This protocol was used to evaluate the growth of several previously described Escherichia coli strains. The main steps of the protocol are as follows: the preparation of a large number of cell stocks in small vials for repeated tests with reproducible results, the use of 96-well plates for high-throughput growth evaluation, and the manual calculation of two major parameters (i.e., maximal growth rate and population density) representing the growth dynamics. In comparison to the traditional colony-forming unit (CFU) assay, which counts the cells that are cultured in glass tubes over time on agar plates, the present method is more efficient and provides more detailed temporal records of growth changes, but has a stricter detection limit at low population densities. In summary, the described method is advantageous for the precise and reproducible high-throughput analysis of bacterial growth, which can be used to draw conceptual conclusions or to make theoretical observations.

Quantitative evaluation of bacterial growth is essential to understanding microbial physiology as a systems-level phenomenon. A protocol for experimental manipulation and an analytical approach are introduced, allowing for precise, high-throughput analysis of bacterial growth, which is a key subject of interest in systems biology.

Preciso, elevado-throughput análise do crescimento bacteriano

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

Baseada Reporter ensaio de crescimento para análise sistemática de degradação de proteínas

Resumo

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