Os trabalhos que conduziram a esta publicação tem recebido financiamento do programa Marie Curie COFUND &quot;U-Mobility&quot;, co-financiado pela Universidade de Málaga e do Programa da União Europeia 7 º Programa-Quadro (FP7/2007-2013) sob n º 246550 GA. O trabalho em nosso laboratório é suportado por concessões do NIH, USDA / NIFA, NSF, BARD, e BSF para VC

1. A expressão de proteínas <ol><li> A escolha do sistema de expressão Escolha do sistema, ou seja, vectores e um método de distribuição de vectores, os mais adequados para a expressão da proteína de interesse no modelo de organismo / célula específica. Note-se que o nosso ensaio requer a expressão das proteínas testadas em quantidades facilmente detectáveis, o que é melhor alcançada pela transformação transiente de um grande número de células. Em plantas, por exemplo, isto é melhor conseguido utilizando plasmídeos binários como os vectores de expressão e de Agrobacterium como sistema de entrega. </li><li> Construção de vectores de expressão binário O clone da sequência de codificação (s) da proteína (s) de interesse num vector de expressão, quer isoladamente ou em fusão de tradução de um marcador de epitopo. Uso Os vectores adequados para o sistema de expressão escolhido e processos de biologia molecular convencionais para a clonagem de genes. Para a entrega de genes mediada por Agrobacterium, empregar vetores binários e apresentá-los, utilizando também standaprotocolos rd, em uma cepa de Agrobacterium, como EHA105, para inoculação posterior dos tecidos vegetais. </li><li> A escolha de espécies de plantas Selecione as espécies de plantas em que a proteína (s) de interesse serão expressas. Note-se que, ao passo que todas as espécies de plantas susceptíveis à transformação genética mediada por Agrobacterium pode ser usado, as nossas espécies de plantas de Nicotiana benthamiana escolha é, que seja facilmente cultivada, altamente susceptíveis a Agrobacterium, e tem grandes folhas que são facilmente inoculados. </li><li> O crescimento das plantas Crescer uma planta de 4 a 6 semanas em uma panela com Pro-Mix BX em uma panela (20 cm x 20 cm x 20 cm), sob condições controladas-ambiental (por exemplo, câmara de crescimento) de dia longo (ou seja, 16 h de 130 -150 μE m-2 s-1 de luz a 23 ° C e 8 horas e escuro a 20 ° C) e 40-65% de humidade relativa. 1.5.2 Fertilize ocasionalmente com produtos comercialmente disponíveis por instruções do fabricante. Uma vez que a planta é cultivada, selecionefolhas com o tamanho de 50 mm x 70 mm ou maior (estas medições de comprimento não incluem o pecíolo) para inoculação com Agrobacterium. </li><li> A inoculação com Agrobacterium Grow Agrobacterium estirpe portadora da construção binário expressando a proteína testada (s) a partir do passo 1.3 durante a noite a 28 ° C em meio YEP (1% de peptona, 1% de extracto de levedura e 0,5% de NaCl) suplementado com os antibióticos apropriados (por exemplo, 100 mg / L de estreptomicina e 10 mg / L, rifampicina para vectores baseados em pPZP-RSC2 24-25). 1.6.2 Centrifugar as células ressuspensas a OD 600 = 0,5 em tampão de infiltração [10 mM de MgCl 2, 10 mM de MES (pH 5,6), 100 pM de acetosiringona], e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente. Infiltrar a cultura para o lado abaxial da folha, usando uma agulha de seringa de 1 ml; observar que as folhas são inoculadas in situ, enquanto que está ligado à planta. 1.6.3 Após a infiltração, cultivar a planta durante 72 h sob o regime de luz de 16 h 130-150 &amp;# 181; E m-2 s-1 de luz a 23 ° C / 8 h escuro a 20 ° C antes da colheita. </li><li> Aplicação de inibidores proteossomo Para apoiar a noção de que a proteína testada (s) é degradada através de uma via proteosomal, usar inibidores de proteossomo MG132 específicos e lactacistina 28-29, o que deve reduzir ou mesmo bloquear a degradação. Quatro horas antes da colheita (ver passo 2.1), infiltrar as áreas foliares inoculados com Agrobacterium com 10 mM MG132 (EMD Millipore) ou 10 mM lactacistina (Sigma-Aldrich) ou mock-tratar a folha com os respectivos solventes, ou seja, 0,1% de DMSO ou água destilada. </li></ol> 2. Preparação de extractos isentos de células <ol><li> Colheita Folha Colher as áreas inoculadas da folha, geralmente ca. 200-400 mg de peso fresco, e triturá-los em pó fino em nitrogênio líquido. Alternativamente, conta-bater os tecidos, usando qualquer bead-beater (por exemplo, Biospec) ou um amalgamador dental (por exemplo, TPC Avançada<html> Technologies) diretamente no buffer de degradação (ver passo 2.2). </li><li> Extração de proteínas Preparar um extracto de proteína total, colocando o tecido triturado em 500 mL de tampão de degradação [50 mM Tris-HCL (pH 7,5), 100 mM de NaCl, 10 mM de MgCl2, 5 mM DTT, 5 mM de adenosina-5&#39;-trifosfato, e 1 x inibidor da protease cocktail (Sigma-Aldrich)]. Note-se que a mistura de inibidores de protease afecta principalmente serina, cisteína, aspártico, e metaloproteases e não interfere com a protease 26S. Clarificar o extracto por duas centrifugações sequenciais a 12,000 xg por 5 min. </li><li> Reacção de degradação de proteínas Transferir volumes iguais de extractos, normalmente 20 mL, para tubos de microcentrífuga e incubar à temperatura ambiente durante períodos de tempo crescente. Tipicamente, o tempo de amostra zero, e 5, 10, 15, 20, e 30 pontos de tempo mínimo. Pare reacções por fervura em tampão de amostra de SDS-gel, e analisá-las por western blotting. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 3. detecção da degradação da proteína por imunotransferência <ol><li> A electroforese em gel 3.1.1 resolver as amostras de proteínas por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida e electrotransferência das proteínas resolvidas para uma membrana de nitrocelulose de acordo com o protocolo padrão 30. 3.1.2 Determinar a concentração de proteína utilizando o método de Bradford (Bio-Rad), e carregar 50-80 ug de proteína total por pista. Certifique-se de que todas as amostras são carregadas igualmente. Para os controlos de carga, comparar as intensidades de uma espécie de proteína ubíquos, tais como putativo Rubisco grandes correntes que migram como uma banda principal com uma mobilidade electroforética relativa de cerca de 50 kDa, podem ser detectadas em géis corados Coomassie-Blue ou em Ponceau S-ou fluorescente SYPRO Rubi-manchado membranas de nitrocelulose. </li><li> Bloqueio Bloquear a membrana com 5% de leite desnatado em TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM de NaCl, 0,05% de Tween 20, pH 7,4) durante 1 h à temperatura ambiente. </li&gt; <li> O anticorpo primário Diluir anticorpo anti-epitopo primária em 1% de leite desnatado em TBST com a concentração recomendada pelo fabricante e incubar com a membrana bloqueada durante 1 h à temperatura ambiente ou durante uma noite a 4 º C com agitação suave. </li><li> Lavagem Lavar a membrana é lavada com 20 ml de TBST, durante 15 minutos, uma vez, e duas vezes durante 5 min à temperatura ambiente com agitação suave. </li><li> O anticorpo secundário Dilui-se anticorpo secundário (por exemplo, anti-IgG de coelho) conjugado com peroxidase de rábano (HRP) em 1% de leite desnatado em TBST tal como recomendado pelo fabricante e incubar com a membrana durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação suave. </li><li> Detecção Lavar a membrana tal como é descrito no Passo 3.4. Após a lavagem final em TBST, visualizar as proteínas de interesse com um substrato quimioluminescente HRP, mais vulgarmente usando um kit ECL. </li></ol>

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	<li>Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+control+in+ubiquitin-dependent+proteolysis:+don&#8217;t+Skp+the+F-box+hypothesis.">Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don&#8217;t Skp the F-box hypothesis.</a> Trends Genet. 14, 236-243 (1998).</li><li>Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCF+and+cullin/ring+H2-based+ubiquitin+ligases.">SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases.</a> Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).</li><li>Callis, J., Vierstra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+degradation+in+signaling.">Protein degradation in signaling.</a> Curr. Opin. 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R., Shirasu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+ubiquitination+in+the+regulation+of+plant+defence+against+pathogens.">Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).</li><li>Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. 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Cell. 14, 414-416 (2004).</li><li>Magori, S., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hijacking+of+the+host+SCF+ubiquitin+ligase+machinery+by+plant+pathogens.">Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens.</a> Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).</li><li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+plant+transformation:+the+biology+behind+the+&amp;#34;gene-jockeying&amp;#34;+tool.">Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the &amp;#34;gene-jockeying&amp;#34; tool.</a> Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).</li><li>Lacroix, B., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+bacterial+and+host+plant+factors+in+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation.">The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation.</a> Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).</li><li>Schrammeijer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+the+virulence+protein+VirF+of+Agrobacterium+tumefaciens+with+plant+homologs+of+the+yeast+Skp1+protein.">Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein.</a> Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).</li><li>Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+induces+expression+of+a+plant+host+F-box+protein+required+for+tumorigenicity.">Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity.</a> Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).</li><li>Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+targeted+proteolysis+in+plant+genetic+transformation+by+Agrobacterium.">Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium.</a> Nature. 431, 87-92 (2004).</li><li>Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disassembly+of+synthetic+Agrobacterium+T-DNA-protein+complexes+via+the+host+SCFVBF+ubiquitin-ligase+complex+pathway.">Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway.</a> Proc. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tome-1,+a+trigger+of+mitotic+entry,+is+degraded+during+G1+via+the+APC.">Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC.</a> Cell. 113, 101-113 (2003).</li><li>Guardavaccaro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+meiotic+and+mitotic+progression+by+the+F+box+protein+b-Trcp1+in+vivo.">Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo.</a> Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).</li><li>Magori, S., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+counteracts+host-induced+degradation+of+its+F-box+protein+effector.">Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector.</a> Sci. Signal. 4, (2011).</li><li>Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophase+destruction+of+Emi1+by+the+SCFbTrCP/Slimb+ubiquitin+ligase+activates+the+anaphase+promoting+complex+to+allow+progression+beyond+prometaphase.">Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase.</a> Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).</li><li>Tzfira, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pSAT+vectors:+a+modular+series+of+plasmids+for+fluorescent+protein+tagging+and+expression+of+multiple+genes+in+plants.">pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants.</a> Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).</li><li>Goderis, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+set+of+modular+plant+transformation+vectors+allowing+flexible+insertion+of+up+to+six+expression+units.">A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units.</a> Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).</li><li>Lee, L. Y., Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-DNA+binary+vectors+and+systems.">T-DNA binary vectors and systems.</a> Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).</li><li>Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+multiple+transgenes+to+plant+cells.">Delivery of multiple transgenes to plant cells.</a> Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).</li><li>Yang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+the+Arabidopsis+26+S+proteasome:+biochemical+and+molecular+analyses+revealed+the+presence+of+multiple+isoforms.">Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms.</a> J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).</li><li>Fenteany, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+proteasome+activities+and+subunit-specific+amino-terminal+threonine+modification+by+lactacystin.">Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin.</a> Science. 268, 726-731 (1995).</li><li>Ausobel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (1987).</li><li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ. , (1997).</li><li>Kim, J. H., Kim, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+RING+E3+ubiquitin+ligase+AtAIRP3/LOG2+participates+in+positive+regulation+of+high+salt+and+drought+stress+responses).">The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses).</a> Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este ensaio baseia-se na expressão das proteínas testadas em tecidos de plantas, assim, o processo de degradação potencial proteosomal obviamente, já ocorre dentro dos tecidos vivos. Nós ensaio desestabilização da proteína, no entanto, apenas nos extratos, com o tempo de amostra de zero servindo como ponto de referência inicial. Por isso, nós definimos como um ensaio isento de células. Um aspecto importante para o sucesso deste ensaio é a escolha correcta do vector de expressão...

A via proteassoma ubiquitin/26S está emergindo como um mecanismo generalizado para o controle de diversas reações biológicas, incluindo a regulação da transcrição, a progressão do ciclo celular e transdução de sinal, receptor infra-regulação ou endocitose, entre outros processos 1-4. Nesta via, a proteína alvo é identificado pela ubiquitina resíduos que estão ligados através de uma primeira ligação thiolester a enzima activadora de ubiquitina E1 e translocados para um resíduo de aminoácido cisteína da enzima de conjugação da ubiquitina-E2 e, finalmente, E2 interage com ubiquitina ligase E3 , resultando em polyubiquitination do substrato de proteína. Em última análise, as proteínas polyubiquitinated são reconhecidos e degradado pelo proteassoma 26S. Neste mecanismo, a enzima E3 especifica o substrato e funciona como o componente regulador chave do sistema de proteassoma ubiquitin/26S (UPS). Ligases E3 pode agir de forma independente, como ligases domínio RING, ou como parte de um SCF multisubunit (Sproteínas) complexo kp1/Cullin/F-box, tais como ligases de domínio F-box. SCF mediadas por vias de degradação proteosomal estão envolvidas na regulação da transcrição, do ciclo celular, a transdução de sinal 5-10 e muitas outras importantes funções celulares. Além desses papéis críticos na regulação de processos celulares, UPS toma o palco central em muitas interações planta-patógeno. Por exemplo, a evidência crescente sugere que vários patógenos de plantas, incluindo Agrobacterium, contam com a UPS host para facilitar o processo de infecção 11. Agrobacterium provoca tumores neoplásicos em plantas, os quais representam os seus hospedeiros naturais, e também podem transformar uma vasta gama de outros eucariotas, a partir de fungos de 1,2 para as células humanas 12,13. Durante a infecção, Agrobacterium exporta um elemento de DNA (T-DNA) e várias proteínas de virulência (vir) na célula hospedeira 12-13. Uma dessas proteínas é VirF, a primeira proteína F-box encontradoa ser codificada por um genoma procariótico 14. Como parte do complexo de SCF ubiquitina-ligase, VirF, e seu homólogo funcional hospedeiro VBF 15, facilitar a infecção por Agrobacterium por meio da degradação de proteínas mediado por UPS, que presumivelmente facilita desencapsulamento de o T-DNA de bactérias invasoras dos seus acompanhantes e proteínas bacterianas hospedeiras, VirE2 e VIP1, respectivamente 16,17. Curiosamente, muitas proteínas F-box, incluindo VirF, são intrinsecamente instáveis ​​devido ao seu próprio proteólise, que é mediada pela actividade autoubiquitination 18,19 ou por outras ligases E3 para o qual as proteínas F-box podem servir como substratos 20-23. Ao estudar actividades bioquímicas das proteínas F-box, outros ubiquitina ligases, e / ou os seus substratos, seria muito útil para empregar um ensaio simples e fiável para a degradação do proteossoma. Descrevemos aqui um tal protocolo para a análise da estabilidade da proteína na célula-Livre do sistema. Neste ensaio, a estabilidade do substrato UPS é analisada na presença ou ausência de um dos componentes essenciais da via de degradação do proteossoma, tal como uma proteína da caixa F, num sistema isento de células. Em geral, a expressão da proteína testada (s) em tecidos de plantas, preparação de extractos de células livres a partir destes tecidos e controlar as quantidades de proteína (s) de interesse por western blotting. O mecanismo dependente da UPS de degradação de proteínas é demonstrada pela inclusão de inibidores de proteossomo específicas e / ou da utilização de co-expressão de forma dominante negativa de um componente de SCF, Cullin. Considerando que ilustram este ensaio utilizando degradação proteosomal da proteína de Arabidopsis VIP1 17 pela proteína F-VBF caixa 15, que pode ser empregue para investigar a estabilidade de quaisquer outros substratos proteossomo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="662">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Protein assay kit</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">500-0001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Proteinase inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Mini-Protean system</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">165-8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Semi-dry western blotting SD electrotransfer system</td>
			<td style="width:129px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Affinity Purified Rabbit Anti-Ha</td>
			<td style="width:129px;">icllab</td>
			<td>RHGT-45A-Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate</td>
			<td style="width:129px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">31460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane</td>
			<td style="width:129px;">Pall Corportation</td>
			<td style="width:119px;">27377-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Immobilon western chemiluminescent HRP substrate</td>
			<td style="width:129px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">WBKL S0 050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">MG132</td>
			<td style="width:129px;">EMD Millipore</td>
			<td>474790-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Lactacystin</td>
			<td style="width:129px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate</td>
			<td style="width:129px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">35055</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assaying proteasomal degradation in a cell-free system in plants

A via da ubiquitina-proteassoma por degradação proteica tem emergido como um dos mecanismos mais importantes para a regulação de uma grande variedade de funções celulares em praticamente todos os organismos eucarióticos. Especificamente, em plantas, o sistema de proteassoma ubiquitin/26S (UPS) regula a degradação de proteína e contribui significativamente para o desenvolvimento de uma ampla variedade de processos, incluindo a resposta imunológica, desenvolvimento e morte celular programada. Além disso, a evidência crescente sugere que vários patógenos de plantas, tais como Agrobacterium, explorar as UPS de acolhimento para a infecção eficiente, enfatizando a importância da UPS em interações planta-patógeno. A especificidade do substrato da UPS é conseguido pela ubiquitina-ligase E3, que actua em conjunto com a E1 e E2-ligases para reconhecer e marcar as moléculas de proteína específicos destinados a degradação, anexando-os a cadeias de moléculas de ubiquitina. Uma classe das ligases E3 é o SCF (Skp1 / Cproteína Ullin / F-box) complexo, que reconhece especificamente os substratos UPS e tem como alvo os para ubiquitination através do seu componente de proteína F-box. Para investigar um papel potencial da UPS em um processo biológico de interesse, é importante elaborar um ensaio simples e confiável para a degradação de proteínas mediada por UPS. Aqui, nós descrevemos um tal teste, utilizando um sistema isento de célula de planta. Este ensaio pode ser adaptado para estudos sobre os papéis de degradação da proteína regulada em diversos processos celulares, com um foco especial sobre as interações proteína-substrato da caixa-F.

A Figura 1, adaptada do Zaltsman et al. 17, ilustra experiências representativas para a detecção da degradação proteosomal em um sistema isento de células. Especificamente, nós demonstramos a desestabilização de uma planta relacionada com a defesa proteína VIP1 pela proteína F-box VBF pela via SCF VBF em N. benthamiana. VBF Arabidopsis e marcadas com HA VIP1 (HA-VIP1 proteínas) foram transientemente co-expressos, e o conteúdo de proteína HA-...

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Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

Degradação de proteínas alvejado representa um grande mecanismo regulador para a função celular. Ela ocorre através da via de ubiquitina-proteassoma conservado, que se liga cadeias de poliubiquitina para a proteína alvo, que, em seguida, servir de &quot;tags&quot;, como moleculares para o proteassoma 26S. Aqui, descrevemos um ensaio livre de células simples e confiável para a degradação de proteínas proteosomal.

Ensaiando proteosomal Degradação em um sistema de livre-Cell em Plantas

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

assaying-proteasomal-degradation-in-a-cell-free-system-in-plants

Research

JoVE Journal

Biology

14.3K visualizações.  Stony Brook University, State University of New York.  Degradação de proteínas alvejado representa um grande mecanismo regulador para a função celular. Ela ocorre através da via de ubiquitina-proteassoma conservado, que se liga cadeias de poliubiquitina para a proteína alvo, que, em seguida, servir de "tags", como moleculares para o proteassoma 26S. Aqui, descrevemos um ensaio livre de células simples e confiável para a degradação de proteínas proteosomal. 

Vídeo: Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

Maintaining Wolbachia in Cell-free Medium

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ascertain the viability of the purified Wolbachia and (3) maintain the now extracellular Wolbachia in cell-free medium.  Purified Wolbachia remain alive in the extracellular phase but do not replicate until re-inoculated into eukaryotic cells.  Extracellular Wolbachia purified in this manner will remain viable for at least a week at room temperature, and possibly longer.  Purified Wolbachia are suitable for micro-injection, DNA extraction and other applications. 


This video describes a method for purifying Wolbachia pipientis from an Anopheles gambiae cell line and then culturing the endosymbiont in cell-free medium. An assay for viability of the bacterium is demonstrated.

Manutenção de Wolbachia em Cell-livre Médio

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ...

Biologia

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

Doseamento do atividade da quinase de LRRK2 In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Reconstituição de β-catenina degradação na<em&gt; Xenopus</em&gt; Extrato de ovo

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main lysosome-dependent pathway is called autophagy, while the primary non-lysosomal method for protein catabolism is the ubiquitin-proteasome system. Recent studies in model organisms suggest that the activity of both autophagy and the ubiquitin-proteasome system is not constant across the day but instead varies according to a daily (circadian) rhythm. The ability to measure biological rhythms in protein turnover is important for understanding how cellular quality control is achieved and for understanding the dynamics of specific proteins of interest. Here we present a standardized protocol for quantifying autophagic and proteasomal flux in vivo that captures the circadian component of protein turnover. Our protocol includes details for mouse handling, tissue processing, fractionation, and autophagic flux quantification using mouse liver as the starting material.

We describe our protocol for measuring biological rhythms in protein catabolism via autophagy and the proteasome in mouse liver.

Medindo ritmos diurnos no fluxo autophagic e Proteasomal

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar tolerance to environmental challenges. An experimental protocol is presented for setting up the hydroponic system, plantlet growth, RSA spreading, and imaging. The approach used a magenta box-based hydroponic system containing polypropylene mesh supported by polycarbonate wedges. Experimental settings are exemplified by assessing the RSA of the plantlets under varying nutrient (phosphate [Pi]) supply. The system was established to examine the RSA of Arabidopsis, but it is readily adaptable to study other plants like Medicago sativa (Alfalfa). Arabidopsis thaliana (Col-0) plantlets are used in this investigation as an example to understand the plant RSA. Seeds are surface sterilized by treating ethanol and diluted commercial bleach, and kept at 4 &#176;C for stratification. The seeds are germinated and grown on a liquid half-MS medium on a polypropylene mesh supported by polycarbonate wedges. The plantlets are grown under standard growth conditions for the desired number days, gently picked out from the mesh, and submersed in water-containing agar plates. Each root system of the plantlets is spread gently on the water-filled plate with the help of a round art brush. These Petri plates are photographed or scanned at high resolution to document the RSA traits. The root traits, such as primary root, lateral roots, and branching zone, are measured using the freely available ImageJ software. This study provides techniques for measuring plant root characteristics in controlled environmental settings. We discuss how to (1) grow the plantlets, and collect and spread root samples, (2) obtain pictures of spread RSA samples, (3) capture the images, and (4) use image analysis software to quantify root attributes. The advantage of the present method is the versatile, easy, and efficient measurement of the RSA traits.

We use simple laboratory tools to examine the root system architecture (RSA) of Arabidopsis and Medicago. The plantlets are grown hydroponically over mesh and spread using an art brush to reveal the RSA. Images are taken using scanning or a high-resolution camera, then analyzed with ImageJ to map traits.

Um Protocolo Simples para Mapear as Características da Arquitetura do Sistema Radicular da Planta

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar ...

Quantificação da infiltração gordurosa do músculo esquelético via descelularização

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic disorders, and dystrophies. Clinically in human populations, fatty infiltration is assessed using noninvasive methods, including computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), and ultrasound (US). Although some studies have used CT or MRI to quantify fatty infiltration in mouse muscle, costs and insufficient spatial resolution remain challenging. Other small animal methods utilize histology to visualize individual adipocytes; however, this methodology suffers from sampling bias in heterogeneous pathology. This protocol describes the methodology to qualitatively view and quantitatively measure fatty infiltration comprehensively throughout intact mouse muscle and at the level of individual adipocytes using decellularization. The protocol is not limited to specific muscles or specific species and can be extended to human biopsy. Additionally, gross qualitative and quantitative assessments can be made with standard laboratory equipment for little cost, making this procedure more accessible across research laboratories.

Autor em destaque: Quantificação baseada em descelularização da infiltração gordurosa do músculo esquelético  

The present study describes decellularization-based methodologies for visualizing and quantifying intramuscular adipose tissue (IMAT) deposition through intact muscle volume, as well as quantifying metrics of individual adipocytes that comprise IMAT.

Quantificação da Infiltração Gordurosa do Músculo Esquelético Baseada na Decelularização

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic ...

Incorporando reações de CFPS em uma variedade de matrizes de hidrogel

Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. While the dominant paradigm for the deployment of gene networks is within a cellular chassis, synthetic gene networks may also be deployed in cell-free environments. Promising applications of cell-free gene networks include biosensors, as these devices have been demonstrated against biotic (Ebola, Zika, and SARS-CoV-2 viruses) and abiotic (heavy metals, sulfides, pesticides, and other organic contaminants) targets. Cell-free systems are typically deployed in liquid form within a reaction vessel. Being able to embed such reactions in a physical matrix, however, may facilitate their broader application in a wider set of environments. To this end, methods for embedding cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in a variety of hydrogel matrices have been developed. One of the key properties of hydrogels conducive to this work is the high-water reconstitution capacity of hydrogel materials. Additionally, hydrogels possess physical and chemical characteristics that are functionally beneficial. Hydrogels can be freeze-dried for storage and rehydrated for use later. Two step-by-step protocols for the inclusion and assay of CFPS reactions in hydrogels are presented. First, a CFPS system can be incorporated into a hydrogel via rehydration with a cell lysate. The system within the hydrogel can then be induced or expressed constitutively for complete protein expression through the hydrogel. Second, cell lysate can be introduced to a hydrogel at the point of polymerization, and the entire system can be freeze-dried and rehydrated at a later point with an aqueous solution containing the inducer for the expression system encoded within the hydrogel. These methods have the potential to allow for cell-free gene networks that confer sensory capabilities to hydrogel materials, with the potential for deployment beyond the laboratory.

Autor em destaque: uma nova abordagem para incorporar reações de síntese de proteínas livres de células em hidrogéis 

Here, we present two protocols for embedding cell-free protein synthesis reactions in macro-scale hydrogel matrices without the need for an external liquid phase.

Métodos para Incorporação de Reações de Síntese Proteica Livre de Células em Hidrogéis em Macroescala

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. ...