Os autores gostariam de agradecer a James Oesterling para citometria de fluxo assistência. Esta pesquisa foi suportada por uma concessão do Instituto Nacional do Câncer (R01-CA178380, ZY) e uma bolsa de US National Institutes de Pós-Doutorado formação (5T32CA009035-37, Lwy).

A utilização de animais neste protocolo foi realizado de acordo com os procedimentos aprovados pelo Comitê Cancer Center, Animal Care and Use a Fox Chase. 1. preparação de instrumentos, Solutions e Lamelas <ol><li> Limpe dois conjuntos de # 5 pinça fina, um conjunto de # 7 pinças curvas finas, uma grande tesoura cirúrgica, uma tesoura microdissecting, uma espátula e uma colher perfurada. Coloque os instrumentos em uma auto-selante bolsa de esterilização e autoclave. Mantenha instrumentos em bolsa até que esteja pronto para uso. </li><li> Prepara-se uma solução de agarose de baixo ponto de fusão de 3%. <ol><li> Adicionar 1,5 g de agarose em 50 ml de tampão fosfato salina estéril por Dulbecco (DPBS) em seguida, coloque no microondas e aqueça até que apareçam bolhas. Frasco do redemoinho e reaquecimento até que todos agarose foi dissolvida. Misturar a solução com uma barra de agitação, antes do aquecimento, se aglomerados aparecer. </li><li> Solução da loja em um banho de água a 37 ° C até ser necessário. </li><li> Para armaze longo prazoe, armazenar a solução de agarose para uso futuro, à temperatura ambiente ou a 4 ° C, durante meses. Reaquecimento no microondas para liquefazer. Para o aquecimento repetido da solução de agarose, pesar o frasco antes de aquecimento para manter o seu peso inicial, com água destilada estéril quente. </li></ol></li><li> Preparar as seguintes soluções para a dissociação de células à base de papaína como descrito previamente 2: <ol><li> A solução de papaína com papaína (100 U / ml), cisteína (0,2 mg / ml) e ADNase (250 U / ml) em fenol vermelho estéril contendo DPBS. </li><li> Uma solução ovomucóide com albumina de soro bovino (BSA, 8 mg / ml), inibidor de tripsina de soja (8 mg / ml)) e DNase (250 U / ml) em fenol estéril contendo vermelho-DPBS. Filtrar esterilizar ambas as soluções e ajustar o pH para retornar cor original de fenol contendo vermelho-DPBS. </li></ol></li><li> Preparar meios de cultura de células (NB / B27): complementar meio basal com piruvato de sódio 1 mM, 2 mM de L-glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina (P / S) e suplemento de B27. Filter esterilizar e proteger da luz. Equilibrar media a 37 ° C e 5% de CO 2 antes da sua utilização. </li><li> Preparar tampão de FACS: 5% de soro fetal bovino (FBS) em DPBS. Adicionar 2,5 ml de FBS a 47,5 ml de DPBS. </li><li> Prepare a poli-D-lisina (PDL) -Revestido lamelas. <ol><li> Autoclave novas lamelas de vidro. </li><li> Revestir as lamelas com PDL (100 ug / ml em água destilada estéril) e incubar durante 2 horas a 37 ° C ou à temperatura ambiente durante a noite. </li><li> Lavar lamelas com água destilada estéril. Lave uma vez com meio NB / B27. Vamos lamelas secar completamente no tecido de cultura capa antes de usar. </li></ol></li></ol> 2 Dissecção e Preparação de fatias de tecido <ol><li> No dia da dissecção, limpe a área de dissecção com etanol e 70% de cobertura com um pano absorvente. </li><li> Remover ferramentas de dissecção da bolsa de esterilização. Adicionar gelada, DPBS estéril / 1% P / S para uma pequena placa de Petri e colocar no gelo. </li><li> Decapitaria P4 Math1-GFP / nestin-PCP filhotes de rato com grandes tesouras cirúrgicas em seguida, mantenha a cabeça para baixo com uma pinça curva finas. Retire a pele e descascar delicadamente fora o crânio com # 5 pinça fina, em seguida retire o cérebro do crânio utilizando uma espátula e transfira-o para a placa de Petri contendo DPBS / 1% P / S. <ol><li> Usando # 5 fórceps finos, cuidadosamente separar o cerebelo a partir do resto do cérebro. Certifique-se de dissecar um filhote de cada vez mais rápido possível. </li><li> Recolha um mínimo de 8 cerebelo, a fim de obter NEPs suficientes para análises moleculares e funcionais. </li></ol></li><li> Encher um molde medindo a incorporação de 2 x 2 x 2 cm de altura com uma solução de agarose de baixo ponto de fusão de 3%. Certifique-se de que a temperatura de agarose é não mais do que 37 ° C. </li><li> Retire o excesso de líquido do cerebelo, esfregando suavemente sobre um tecido de laboratório. Coloque cerebelo em molde na posição vertical. Coloque o molde em gelo para permitir que solidifique rapidamente. Use ~ 4 cerebelo por bloco. </li><li> Obter licortes de tecido ving com uma lâmina vibratome vibrando. Apare contendo cerebelo bloco de agarose com uma lâmina de barbear. Cole o bloco de agarose para a placa com vibratome orientada na posição vertical, os cerebelos. </li><li> Encha a bandeja do vibratome com geladas DPBS estéril / 1% P / S e local de gelo embaixo. <ol><li> Cortar 600 uM secções através de todo o comprimento do cerebelo. Colete seções da bandeja de gelo utilizando uma colher perfurada. Seções coloque em um prato de Petri cheia de DPBS / 1% P / S no gelo. </li></ol></li></ol> 3. Microdissecção e dissociação celular <ol><li> Coloque a placa de Petri contendo fatias de tecido sob um microscópio de dissecação fluorescente. <ol><li> Cuidadosamente separar o EGL do resto da secção de cerebelar usando uma pinça fina dissecando entre o PCP + camada molecular e a GFP + EGL (referem-se a linha a tracejado na Figura 1). Ter cuidado para não incluir qualquer parte da camada molecular, o que irá resultar emcontaminação de expressando nestina Bergmann glia. </li><li> Conclua esta etapa, tão rapidamente quanto possível e manter o tecido em gelo para evitar a morte celular. </li><li> Retire a agarose em torno do tecido antes de prosseguir para a próxima etapa. </li></ol></li><li> Digerir o tecido EGL microdissecados utilizando um protocolo baseado em papaína como descrito previamente 2 para se obter uma suspensão de célula única. <ol><li> Re-suspender as células em tampão FACS para a coleta de células CFP-positivos através de FACS. </li></ol></li></ol> 4 células de triagem e Galvanização <ol><li> Ordenação de células de fluorescência utilizando um PCP e de alta velocidade de fluxo estéril citómetro contendo um filtro apropriado PCP e recolher células em tampão de SCAF em gelo. Obter aproximadamente 100.000 NEPs de cada cerebelo P4. </li><li> Células centrifugar a 300 xg por 5 min. Utilizar imediatamente células para análise molecular ou cultura para mais experimentação. </li><li> Para células de cultura, re-suspender as células pré-aquecido NB / B27 mEDIA e placa em lamelas PDL-revestidos como descrito anteriormente 2. </li></ol>

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	<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li><li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medulloblastoma+can+be+initiated+by+deletion+of+Patched+in+lineage-restricted+progenitors+or+stem+cells.">Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells.</a> Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).</li><li>Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. 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M., Frain, M., Vernet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+plasticity+of+adult+Bergmann+fibers+is+associated+with+radial+migration+of+grafted+Purkinje+cells.">Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells.</a> J Neurosci. 14, 124-133 (1994).</li><li>Lumpkin, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Math1-driven+GFP+expression+in+the+developing+nervous+system+of+transgenic+mice.">Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice.</a> Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).</li><li>Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoxetine+targets+early+progenitor+cells+in+the+adult+brain.">Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro.">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).</li><li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons.">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J Vis Exp. (23), (2009).</li><li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nat Protoc. 1, 586-603 (2006).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O método descrito aqui é microdissecção o primeiro procedimento capaz de isolar uma população pura de células vivas para utilização em análises moleculares e funcionais. Como demonstrado por Li et al. 9, NEPs obtidos por este método podem ser cultivadas e retomado em diferentes experiências e por causa do seu elevado grau de pureza, pode também ser utilizado para a análise de microarray. É muito importante ter tempo para se tornar proficientes co...

O cerebelo é composta de várias camadas de células, cada uma contendo tipos celulares distintas. Durante o desenvolvimento, a EGL contém proliferando grânulos dos neurônios precursores (PNB), enquanto a camada molecular e camada de Purkinje conter Bergmann glia e neurônios de Purkinje, respectivamente. Profundamente dentro do cerebelo encontra-se a substância branca, que contém células-tronco neurais (NCCC) e oligodendrócitos 1. Sonic hedgehog (Shh) desempenha um papel fundamental na regulação do desenvolvimento do cerebelo e, em particular, que promove a proliferação de PNB através da ligação ao seu receptor de Patched (Ptc), um regulador negativo da sinalização Shh 2-4. A ativação anormal de sinalização Shh gera meduloblastoma (MB), o tumor cerebral maligno mais comum em crianças 5,6. PTC MB mutantes modelos transgênicos são ferramentas poderosas para o estudo da MB e desenvolver tumores que lembram MB humano 7,8. Usando estesratos, foi descoberto que PNB são a célula de origem para hedgehog de ​​tipo MB 7. Além disso, em adição ao PNB, que recentemente identificada uma população única de células progenitoras neuronais dentro da EGL do cerebelo em desenvolvimento, que também pode dar origem a MB. Estas células expressam níveis elevados da proteína de tipo VI filamento intermediário, nestina, e são denominados NEPs 9. NEPs estão localizados na parte profunda da EGL existir transitoriamente e apenas durante o desenvolvimento do cerebelo neonatal. Eles estão comprometidos com a linhagem de células granulares como PNB, mas são distintos como eles estão quietos e não expressam Math1, um marcador bem estabelecido para PNB convencionais 10. Além disso, NEPs dar origem a MB de forma mais eficiente do que o PNB após a ativação da via de sinalização Shh 9, que lhes uma nova origem para MB tumorigenesis faz. Nós NEPs da EGL cerebelar previamente isolada no dia pós-natal 4 (P4) pela técnica de microdissecçãodescrito aqui 9. Microdissecção visualização microscópica directa através do tecido permite a dissecção específica da EGL cerebelar. Isto é necessário porque Nestin também é expressa por NSC na substância branca do cerebelo e por Bergmann glia na camada molecular 1,7,11,12 e era crucial que estas células não ser incluídos, como eles iriam confundir análise. As células isoladas a partir de tecido microdissecados pode ser imediatamente utilizado para a análise molecular, ou podem ser cultivadas para outras aplicações. Para ajudar na especificamente microdissecting a EGL e para purificar ainda mais NEPs, ratos Math1-GFP (proteína fluorescente verde) foram cruzados com camundongos Nestin-CFP (proteína fluorescente ciano). O factor de transcrição de Math1 é especificamente expresso por PNB e expressão da GFP é claramente visível na EGL 9,13. Ratinhos nestina-PCP expressar uma forma nuclear de PCP e podem ser facilmente visualizadas na camada molecular 9,14. Juntos, GFP e expressão PCP criar limites para microdissecção do EGL (ver Figura 1). NEPs PCP-positivos foram então isolados por FACS, após dissociação enzimática das GECV dissecados. Actualmente, o método mais bem utilizados para isolar células da EGL é centrifugação em gradiente de Percoll de tecido cerebelar toda 15,16. Este método, no entanto, não é capaz de excluir completamente populações celulares nestina + a partir da camada molecular e da matéria branca e, portanto, não pode ser usado para o estudo de NEPs. Microdissecção captura a laser, que utiliza a transferência de energia laser para remover as células de interesse, é outro método usado para isolar células específicas dentro de um tecido heterogéneo 17,18 mas apenas células capturadas podem ser usadas para a recuperação de ADN, ARN e proteína e não está capazes de ser cultivadas. Este protocolo fornece uma maneira de isolar especificamente um puro população vivo, de NEPs da EGL.Esta técnica também pode ser aplicado para diferentes tipos de tecidos que tenham ou arquitectura anatómica reconhecível ou marcados com fluorescência células / regiões. Por conseguinte, a principal vantagem de incorporar esta técnica microdissecção novo em protocolos de isolamento de células é que as células podem ser isoladas a partir de regiões específicas do tecido para eliminar os contaminantes de tecidos vizinhos e as células podem ser recolhidas para análise imediatamente ou cultivadas durante outras aplicações.

<table><tbody><tr><td>Neurobasal media</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Ultra pure low melting temperature agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of distinct cell populations from the developing cerebellum by microdissection

Microdissecção é uma nova técnica que pode isolar regiões específicas de um tecido e eliminar a contaminação a partir de fontes celulares em áreas adjacentes. Este método foi utilizado pela primeira vez no estudo de nestina expressa progenitoras (NEPs), uma população de células recentemente identificados na camada germinal externa cerebelar (EGL). Usando microdissecção em combinação com separação de células activada por fluorescência (FACS), uma população pura de NEPs foi recolhido separadamente, a partir de precursores neuronais dos grânulos convencionais na EGL e de outros contaminantes células que expressam nestina-no cerebelo. Sem microdissecção, análises funcionais de NEPs não teria sido possível com os atuais métodos disponíveis, tais como a centrifugação em gradiente de Percoll e captura a laser microdissecção. Esta técnica também pode ser aplicado para utilização com vários tecidos que contêm tanto regiões conhecidas ou células marcadas fluorescentemente. Mais importante ainda, uma grande vantagem do presente microdissection técnica é que as células isoladas são de vida e pode ser cultivado para experimentação posterior, o que não é actualmente possível com os outros métodos descritos.

Como mostrado na Figura 1A, as fatias de cerebelo foram preparadas a partir de P4 Math1-GFP / mice nestina-PCP, em que a EGL cerebelar foram dominados por PNB-expressando GFP e a camada molecular foi enriquecida por células gliais PCP-positivos. Para isolar NEPs que estão localizadas na parte profunda da EGL, fatias foram microdissecadas entre o EGL e a camada molecular (ao longo da linha tracejada, Figura 1A). GECV dissecado (Figura 1B) foram, em se...

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Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Progenitores que expressam nestina são uma população recentemente identificada de progenitores neuronais no cerebelo em desenvolvimento. Usando a técnica de microdissecção aqui apresentados em combinação com separação de células activada por fluorescência, esta população de células pode ser purificado sem contaminação de outras regiões do cerebelo e podem ser cultivadas para estudos posteriores.

O isolamento de populações de células distintas do cerebelo em desenvolvimento por Microdissecção

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

isolation-distinct-cell-populations-from-developing-cerebellum

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K visualizações.  Temple University Health System.  Progenitores que expressam nestina são uma população recentemente identificada de progenitores neuronais no cerebelo em desenvolvimento. Usando a técnica de microdissecção aqui apresentados em combinação com separação de células activada por fluorescência, esta população de células pode ser purificado sem contaminação de outras regiões do cerebelo e podem ser cultivadas para estudos posteriores. 

Vídeo: Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying neuronal proliferation and differentiation. In addition, evolutionary modifications of its proliferative capability have been responsible for the dramatic expansion of cerebellar size in the amniotes, making the cerebellum an excellent model for evo-devo studies of the vertebrate brain. The constituent cells of the EGL, cerebellar granule progenitors, also represent a significant cell of origin for medulloblastoma, the most prevalent paediatric neuronal tumour. Following transit amplification, granule precursors migrate radially into the internal granular layer of the cerebellum where they represent the largest neuronal population in the mature mammalian brain. In chick, the peak of EGL proliferation occurs towards the end of the second week of gestation. In order to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation, we have developed a method for genetic manipulation through ex vivo electroporation of cerebellum slices from embryonic Day 14 chick embryos. This method recapitulates several important aspects of in vivo granule neuron development and will be useful in generating a thorough understanding of cerebellar granule cell proliferation and differentiation, and thus of cerebellum development, evolution and disease.

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer is the site of the largest transit amplification in the developing brain. Here, we present a protocol to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation using ex vivo electroporation and culture of cerebellar slices from embryonic Day 14 chick embryos.

Ex Cultura Vivo de Pintainho Cerebelar Slices e voltadas para o espaço Eletroporação do grânulo precursores de células

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Biologia do Desenvolvimento

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the cerebellar neuronal types (granule cells, Purkinje cells and inhibitory interneurons), granule neurons are by far the most numerous and are the most abundant type of neurons in the mammalian brain. In rodents, cerebellar granule neurons are generated during the first two post-natal weeks from progenitor cells in the outermost layer of the cerebellar cortex, the external granule layer (EGL). The protocol presented here describes techniques to enrich and culture granule neurons and their progenitor cells from post-natal mouse cerebellum. We will describe procedures to obtain cultures of increasing purity3,4, which can be used to study the differentiation of proliferating progenitor cells into granule neurons5,6. Once the progenitor cells differentiate, the cultures also provide a homogenous population of granule neurons for experimental manipulation and characterization of phenomena such as synaptogenesis, glutamate receptor function7, interaction with other purified cerebellar cells8,9 or cell death7.

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons

Here we present a method to isolate and culture cerebellar granule neuron progenitor cells and cerebellar granule neurons from postnatal mouse.

Isolamento e Cultura de Pós-Natal do rato Cerebelar Granule Células Progenitoras Neuron e Neurônios

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the ...

Biologia

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure for isolation of microglia from neonatal murine cortices by mechanical agitation with a rotary shaker. This microglia isolation method yields highly pure cortical microglia that exhibit morphological and functional characteristics indicative of quiescent microglia in normal, nonpathological conditions in vivo. This procedure also preserves the microglial immunophenotype and biochemical functionality as demonstrated by the induction of morphological changes, nuclear translocation of the p65 subunit of NF-&#954;B (p65), and secretion of the hallmark proinflammatory cytokine, tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), upon lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam) challenges. Therefore, the present isolation procedure preserves the immunophenotype of both quiescent and activated microglia, providing an experimental method of investigating microglia biology in ex vivo conditions.

One key to successful investigation of microglial biology is the preservation of microglial immunofunction ex vivo during isolation from CNS tissue. Isolating microglia via rotary shaking results in highly pure and immunofunctional cell cultures as assessed by fluorescent imaging, immunocytochemistry, and ELISA following microglia activation with the proinflammatory stimuli lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam).

Isolamento de Cortical Microglia com Imunofenótipo preservada e funcionalidades de murino Os recém-nascidos

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

Imunologia e Infecção

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical conduction. Myelin alteration has been shown to occur in various neurological diseases, where it is associated with functional deficits. Here, we provide a detailed description of an ex vivo model consisting of mouse organotypic cerebellar slices, which can be maintained in culture for several weeks and further be labeled to visualize myelin.

Here we present a method to prepare organotypic slice cultures from mouse cerebellum and myelin sheath staining by immunohistochemistry suitable for investigating mechanisms of myelination and remyelination in the central nervous system.

Preparação e imunocoloração de culturas de fatia cerebelar microambiental Organotypic

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Neurociência

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model system is to provide a controlled microenvironment and maintain the high survival rate and the natural features of dissociated neuronal and nonneuronal cells as much as possible under in vitro conditions. In this article, we demonstrate a method of isolating primary neurons from the developing mouse cerebellum, placing them in an in vitro environment, establishing their growth, and monitoring their viability and differentiation for several weeks. This method is applicable to embryonic neurons dissociated from cerebellum between embryonic days 12&ndash;18.

Conducting in vitro experiments to reflect in vivo conditions as adequately as possible is not an easy task. The use of primary cell cultures is an important step toward understanding cell biology in a whole organism. The provided protocol outlines how to successfully grow and culture embryonic mouse cerebellar neurons.

Cultura primária de neurônios isolados do cerebelo embrionário do rato

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

Dissecção e isolamento da glia murina de múltiplas regiões do sistema nervoso central

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies indicate that distinct cerebellar regions contribute to these different functions. Molecular studies examining regional cerebellar differences are lagging as they are mostly done on whole cerebellar extracts thereby masking any distinctions across specific cerebellar regions. Here we describe a technique to reproducibly and quickly dissect four different cerebellar regions: the deep cerebellar nuclei (DCN), anterior and posterior vermal cerebellar cortex, and the cerebellar cortex of the hemispheres. Dissecting out these distinct regions allows for the exploration of molecular mechanisms that may underlie their unique contributions to balance, movement, affect and cognition. This technique may also be used to explore differences in pathological susceptibility of these specific regions across various mouse disease models.

Different cerebellar regions have been implicated to play a role in distinct behavioral outputs, yet the underlying molecular mechanisms remain unknown. This work describes a method to reproducibly and quickly dissect cerebellar cortex of the hemispheres, anterior and posterior regions of the vermis, and the deep cerebellar nuclei in order to probe for molecular differences by isolating RNA and testing for differences in gene expression.&#160;

Dissecção Regional Cerebelr para Análise Molecular

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies ...

Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In the granule cell precursor (GCP), the primary cilium acts as a pivotal signaling center that orchestrates precursor cell proliferation by modulating the Hh signaling pathway. The investigation of primary cilium-dependent Hh signaling machinery is facilitated by in vitro genetic manipulation of the pathway components to visualize their dynamic localization to the primary cilium. However, transfection of transgenes in the primary cultures of GCPs using the currently known electroporation methods is generally costly and often results in low cell viability and undesirable transfection efficiency. This paper introduces an efficient, cost-effective, and simple electroporation protocol that demonstrates a high transfection efficiency of ~80-90% and optimal cell viability. This is a simple, reproducible, and efficient genetic modification method that is applicable to the study of the primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathway in primary GCP cultures.

Here, we present a reproducible in vitro electroporation protocol for genetic manipulation of primary cerebellar granule cell precursors (GCPs) that is cost-effective, efficient, and viable. Moreover, this protocol also demonstrates a straightforward method for the molecular study of primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathways in primary GCP cells.

Método de eletroporação eficiente e econômico para estudar vias de sinalização dependentes de cítio primário no precursor da célula de grânulo

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Source: Laaper, M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55871">Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates the technique for isolating and culturing primary mouse cerebellar granule neurons. Cells are treated with an antimetabolite to eliminate proliferating glial cells and produce a pure culture of cerebellar granule neurons.

Isolamento e cultura de neurônios granulares cerebelares primários de camundongos

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Experimental Preparation
NOTE: ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

Isolation of Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum and Differentiation into Neural Cells

Source: Edamakanti, C. R., et al. <a href="https://app.jove.com/v/60554">Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a method for isolating stem cells from the postnatal mouse cerebellum and differentiating them into neural cells. Stem cells from the isolated cell suspension are purified using antibody-coated magnetic beads and are cultured to form neurospheres. The neurospheres are then maintained in a differentiation medium to generate neural cells.

Isolamento de células-tronco do cerebelo pós-natal de camundongo e diferenciação em células neurais

1. Preparation of Solutions

	Prepare tissue dissociation solution made from sterile phenol red-containing Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS) ...