Agradecemos a Barbara Carletti e Anna Marie Kenney para sugestões de valor inestimável. H. é suportado pelo Training Grant &quot;Hormônios: Bioquímica e Biologia Molecular&quot;, DK07328. Apoiado em parte pelo NIH conceder 5R01 NS16951 (CAM).

Parte 1: Configurando (1-2 dias antes da dissecção) (Não mostrado no vídeo) <ol><li> Preparar soluções CULTURA E MEDIA: <ul><li> 4X CMF-PBS-EDTA (cálcio e magnésio free-tampão fosfato salina-EDTA para diluições de Percoll): litro, adicione 32 g NaCl, 1,2 g KCl, 8 g de glicose, 2 g NaH 2 PO 4, 1 g KH 2 PO 4, 8 ml de 2% NaHCO stock 3, 10 ml 1M EDTA (pH 8,0) para água destilada / deionizada. Ajuste o volume para 1 litro eo pH para 7,4. Filtro de esterilizar. </li><li> HBSS GLUCOSE: Adicionar glucose (6 gramas / litro) para cálcio e magnésio da solução de Hank livre de sal Balance (HBSS) e filtro estéril. 500 ml pode ser armazenado a 4 ° C por até um mês. </li><li> Meios de cultura: sem soro médio (SFM) e 10% médio FBS. A 48 ml de Neurobasal A-Médio adicionar 500 mL 100X Glutamax I, 500 100X mL penicilina-estreptomicina (final 100 Unidades penicilina e estreptomicina 100 mg), 6,25 mL KCl 2 M (final 250 mM). Dividido em duas alíquotas de 9 ml e 40 ml. Para preparar 10% de médio FBS, adicionar 1 ml de inativado pelo calor FBS à alíquota de 9 ml. Para preparar SFM, adicionar 800 mL do suplemento sem soro B-27 à alíquota de 40 ml. Filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C para um máximo de duas semanas. Para melhores resultados fazer novas mídias para cada experimento. </li></ul></li><li> Preparar diluições PERCOLL: <ul><li> Percoll é fornecido como um líquido e deve ser acidificado antes de usar. Para preparar o estoque, adicionar HCl 1N, pouco a pouco para a solução Percoll durante um período de 1-2 horas até que o pH 7,4 é atingido. Adicionando o HCl muito rapidamente fará com que o Percoll para agregar. Cerca de 6.5ml de 1N HCl são necessários para cada litro de Percoll. Filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C. </li><li> A 35% e 60% (vol: vol) diluição Percoll será utilizado na etapa de gradiente de Percoll. Preparar 100 ml Percoll diluições contendo 35 ou 60 ml de Percoll estoque, 25 ml de 4X CMF-PBS-EDTA e água destilada / deionizada H2O ao volume final. Adicione algumas gotas de azul de toluidina para a solução de 60%, ele vai ajudar a visualizar a interface e as células. Filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C. </li><li> 4X CMF-PBS-EDTA não deve ser mais de 3 meses, como buffer inadequada causará a morte celular aumentou durante o procedimento. </li></ul></li><li> Lamelas PREPARAÇÃO: lamínulas de vidro (melhor se de Carolina Supply Company Biológicas) são lavados com HCl 10% durante a noite a temperatura ambiente com agitação leve, enxaguar bem com água destilada / deonized água e armazenadas em etanol 70%. Antes do uso, lamínulas simples são chama-esterilizados por breves instantes, segurando-os com uma pinça sobre uma flama aberta (bico de Bunsen), até a evaporação do etanol. Lamínulas de 12 mm de vidro podem ser colocadas em placas de quatro bem-cultura e de 25 mm lamínulas em placas de 6 poços cultura. </li><li> NAVIOS DE REVESTIMENTO DE SUBSTRATO COM CULTURA: Para imunofluorescência ou lamelas de drogas tratamentos de vidro são mais adequadas, pois podem ser facilmente montados em lâminas de vidro para visualização sob um microscópio. Quando um grande número de células necessárias para a recolha de amostras de proteína ou RNA, as células podem ser cultivadas em cultura de plástico noite dishes.The antes da dissecação, lamínulas de vidro ou pratos de plástico para a cultura devem ser revestidos com poli-D-lisina (500 mg / ml; 800 mL / poço de 6-lamelas ou 350 mL / poço para 4 bem-chapas). 5 mg / ml solução estoque de poli-D-lisina é armazenada a -20 ° C, em seguida, diluídos em água destilada / deonized estéril e direito estéril filtrado antes do uso. Embarcações de cultura são incubados a 37 ° C durante a noite (ou pelo menos por 2 horas antes do plaqueamento) e lavadas duas vezes com direito a água destilada estéril / deonized antes do plaqueamento. </li><li> Preparar pratos PREPLATING: Estes pratos serão utilizados para a pré-revestimento de células isoladas do cerebelo diante da cultura para remover os contaminantes da glia, que aderem mais facilmente a uma menor concentração de substrato. Revestimento dois de 60 mm de plástico placas de cultura com 4 ml por prato de poli-D-lisina (100 mg / ml; Note que este é 1 / 5 da concentração utilizada para cultura). Incubar a 37 ° C durante a noite (ou pelo menos por 2 horas antes da dissecção). Logo antes da dissecção, remover a solução de poli-D-lisina, lavar a louça duas vezes com água estéril e deixar secar no capô. </li><li> Esterilizar instrumentos de dissecação em autoclave ou no dia da dissecção, mergulhe as ferramentas em etanol 70% por 20 minutos. Ferramentas necessárias: uma tesoura Permaset, tesoura microdissecting, quatro Dumont # 5 pinças de dissecação. </li></ol> Parte 2: Preparando-se para dissecção (dia de dissecção) - (demonstrado em vídeo) Todos os seguintes procedimentos são realizados em uma capa de cultura de tecidos, a menos que observou. <ol><li> Limpe a área de dissecação com etanol 70%. Aquecer a mídia para 37 ° C em banho-maria ou em um 5% CO 2 37 ° C incubadora. </li><li> Ao criar um novo sistema de papaína dissociação Kit (Worthington), preparar a solução de albumina-ovomucoid inibidor. Adicionar 32 mlde EBSS (solução salina balanceada de Earle, fornecido no kit) para a mistura de inibidor de albumina ovomucoid e permitir que o conteúdo para dissolver enquanto prepara os outros componentes. Reconstituir para o primeiro uso, em seguida, armazenar o restante solução a 2-8 ° C e seu uso até os cinco isolamentos permitido por cada kit estão concluídas. </li><li> Adicionar 5 ml de EBSS para um frasco papaína do Kit dissociação (cada frasco é suficiente para a dissociação de 4-15 cerebelos de ratos pós-natais dia 5). Coloque o frasco papaína em 5% de CO 2 37 ° C incubadora ou 37 ° C banho-maria por 5 a 10 minutos até que a papaína é completamente dissolvido ea solução aparece clara. Manter a solução em temperatura ambiente durante a dissecção. </li><li> Adicionar 500 mL de EBSS para um frasco DNase do Kit dissociação. Misture delicadamente tocando no frasco desde DNase é sensível a desnaturação de cisalhamento. Adicionar 250 mL desta solução para o frasco contendo a papaína (concentração final é de 20 unidades / ml papaína e DNase 0,005%). Salve o frasco DNase restante para utilização na etapa 5.1 ou 6.1. </li></ol> Parte 3: Dissecção e remoção Meninges <ol><li> A idade ideal para a cultura de células de grânulos de camundongos C57BL/6J é dia pós-natal 4-6, quando o número de células progenitoras grânulo na EGL peaks1, 10. Dissecar filhotes de cada vez e como você se torna mais familiarizado com a dissecção cerebelar tentar reduzir o tempo de dissecação para não mais de 6 minutos por filhote. Velocidade é da essência. Se o passo gradiente Percoll é ignorada, oito filhotes dias pós-natal do rato-5 pode produzir células suficientes para uma placa de cultura de 6 poços (ou seis de 25 mm lamelas) ou por seis pratos quatro bem-cultura (ou 24 12 - lamínulas mm). Rendimento aproximado é de 4 a 5x106 células por densidades das crias e revestimento pode variar entre 1 e 5X105 cells/cm2. Como as células de 15-20% são perdidos durante o step4 Percoll, mais animais são necessários para obter a densidade mesma célula desejada. </li><li> Pipetar 15 ml de HBSS glicose em uma placa de cultura de 60 mm de plástico e tecido 10 ml em uma estéril 15 ml Falcon tubo plástico cônico. Coloque sobre o gelo. </li><li> Fora a capa, limpe a cabeça do cachorro com etanol 70%. Use uma tesoura Permaset para decapitar o filhote. (Decapitação não será mostrado no vídeo.) </li><li> No bairro, segure a cabeça com uma pinça Dumont para que você possa ver claramente a parte de trás do crânio. Acesso ao cérebro através da inserção de uma tesoura microdissecting no forame magno e corte reto em direção aos olhos. Utilizando uma pinça, descascar a pele e levante a caveira para expor o cérebro. Utilizando uma pinça Dumont, belisque o cerebelo eo mesencéfalo circundante e transferi-lo para o prato com HBSS glicose. (É mais fácil manipular o cerebelo e remover as meninges se o cerebelo é ainda ligado ao tecido circunvizinho). </li><li> Sob o microscópio de dissecação, descascar delicadamente as meninges fora do cerebelo e também entre os lobos com uma fina Dumont # 5 forceps durante o uso do fórceps, inseri-baixo do cerebelo para a chapa. Você vai notar vasos sanguíneos na superfície do cerebelo. Estes vasos sanguíneos são uma boa maneira de identificar as meninges. Remove as meninges até o cerebelo assume uma aparência branca emaranhada. Separar o cerebelo do resto do mesencéfalo. Ligá-lo ao seu lado ventral e remover o plexo coróide, que se parece com uma fita vermelha entre o cerebelo e mesencéfalo ventral adjacente. Coloque cada cerebelo no frio HBSS glicose em um tubo de 15 ml cônico no gelo logo dissecado. Mudar a solução de dissecação a fresco HBSS glicose após dissecar três cérebros. </li></ol> Parte 4: suspensão de células <ol><li> Depois de todas as dissecções terminar, remova o HBSS glicose do tubo e substituí-lo com a solução de papaína feita no passo 2.4. Embora o kit recomenda cortar o tecido em pedaços pequenos, descobrimos que não é necessário cortar ou picar o cerebelos nesta idade. Coloque o tecido solução papaína + (em um tubo cônico de 15 ml) a 37 ° C banho-maria ou 5% de CO 2 37 ° C incubadora por 15 a 20 minutos. Para 4-8 cerebelos, 15 minutos a 37 ° C é suficiente, pois um número maior de cerebelos 20 a 30 minutos é melhor. Agite suavemente o tubo a cada 3 a 4 minutos. </li><li> Triturar a mistura com uma ponta de pipeta estéril p1000 aerossol que foi revestido com FBS. Fazer este passo com cuidado para evitar qualquer formação de bolhas de ar. Pipetas de vidro polido fogo pode ser usado, mas nós achamos que o soro revestido estéril p1000 dicas aerosol funcionar tão bem. Para revestir a ponta da pipeta com FBS, pipeta FBS cima e para baixo duas vezes imediatamente antes da utilização. Cerca de 10 movimentos para cima e para baixo com a pipeta é suficiente para dissociar o tecido. A solução irá tornar-se turva. Permitir a suspensão para se sentar durante 30-60 segundos, para que todos os pedaços grandes de tecido não dissociado vai assentar no fundo do tubo. </li><li> Remover as células em suspensão (cuidado para não remover os pedaços de tecido não dissociado na bottom) em um novo tubo de 15 ml com uma ponteira de soro revestido. Centrifugar a aproximadamente 200xg por 5 minutos em temperatura ambiente. Prepare re-suspensão médio. Para fazer isso, misturar 2,7 ml EBSS com 300 ml de solução reconstituída inibidor albumina ovomucoid em um tubo estéril. Adicionar 150 ml de solução DNase a partir do passo 2.4. </li><li> Após a centrifugação, desprezar o sobrenadante e ressuspender imediatamente o pellet celular na DNase diluído / solução inibidora de albumina preparada no passo 4.3 com um soro revestido p1000 aerosol pipeta ponta. </li><li> Prepare um gradiente de densidade descontínua como se segue. Adicionar 5 ml de albumina-ovomucoid solução inibidora para um tubo de 15 ml. Cuidadosamente camada de suspensão da célula na parte superior. Centrifugar a aproximadamente 70xg por 6 minutos em temperatura ambiente. Células dissociadas pellet no fundo do tubo, fragmentos de membrana permanecer na interface. </li><li> Se você deseja obter culturas que são ricos em células granulares, ignorar o Percoll etapa de separação de gradiente (que produz culturas puras de células granulares do cerebelo), e prosseguir para a Parte 6. Se você deseja isolar ainda mais as células grânulo da glia e interneurônios grande por separação por gradiente de Percoll, vá para a Parte 5. Uso do gradiente de Percoll passo vai reduzir o rendimento das células. Em nossas mãos, a redução no rendimento é de aproximadamente 20-35%. No entanto, há um aumento no enriquecimento de neurônios granulares e células progenitoras de cerca de 90% para 95-99%. </li></ol> Parte 5: Separação Gradiente de Percoll <ol><li> Desprezar o sobrenadante e imediatamente ressuspender o sedimento em 2 ml de HBSS glicose com 50 ul de DNase a partir do passo 2.4. Filtrar a suspensão de células através de uma malha de nylon (tamanho dos poros 70 mm) pela gravidade. Esta etapa irá remover grandes células não-neuronais e prevê uma suspensão melhor única célula. </li><li> Prepare-fogo duas pipetas de vidro polido Pasteur. Para fazer isso, gentilmente chama a ponta de uma pipeta de vidro até a borda é alisado eo levou pipeta é de 40-50% do tamanho original. Tome cuidado para não fazer a abertura muito pequena. </li><li> Prepare gradiente de Percoll. Coloque 10 ml de solução de Percoll 35% em um tubo estéril 50 ml. Percoll 60% (10 ml) é carregado para uma seringa de 10 ml estéril com uma agulha estéril espinhal anexado. Suavemente a camada de solução de Percoll 60% abaixo da solução de 35%, adicionando a solução de 60% no fundo do tubo com a agulha espinhal. Tome o cuidado de manter uma interface nítida entre as duas camadas. Adicionar as células para o topo do gradiente utilizando uma pipeta-fogo polido, adicionando-os delicadamente ao longo do lado do tubo, sem perturbar a interface. </li><li> Coloque cuidadosamente o tubo na centrífuga e centrifugar a 1800xg. Rampa até a velocidade de um passo a cada 20 segundos (incrementos de velocidade são as seguintes: aproximadamente 18, 70, 200, 440, 850, 1100, 1800xg) para que ele leva cerca de 2 minutos para chegar à velocidade desejada. Iniciar o temporizador de 10 min, quando 1800xg é atingido. Quando terminar, diminua a velocidade gradualmente um passo a cada 20 segundos. </li><li> Remover a interface superior do gradiente (contendo glia grande, células de Purkinje, e interneurônios) e descarte. </li><li> Remova cuidadosamente as células na interface entre os 35% e Percoll 60%, com uma pipeta-fogo polido e transferir para um tubo de 50 ml. Ressuspender em 3 volumes de HBSS glicose e misturar por inversão várias vezes. Centrifugar durante 5 minutos a 1100xg. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 4 ml de 10% FBS médio com 50 ul de DNase. Ressuspender o sedimento delicadamente com uma pipeta-fogo polido para formar uma suspensão única célula. Avance para o passo 6.2. </li></ol> Parte 6: Pré-plating e Galvanização <ol><li> Desprezar o sobrenadante e imediatamente ressuspender o sedimento em 4 ml de 10% FBS médio com 50 ul de DNase a partir do passo 2.4. Filtrar a suspensão de células através de uma malha de nylon (tamanho dos poros 70 mm) pela gravidade. Esta etapa irá remover grandes células não-neuronais e prevê uma suspensão melhor única célula. </li><li> A placa de células coletadas em um poli-D-lisina prato pré-plating revestido por 20 minutos em 5% de CO 2 37 ° C incubadora. Repita com um prato de doce. As células astroglia e mais pesado vai sossegar e aderir aos pratos e deixar os neurônios de grânulos pequenos e células progenitoras neurônio flutuante. Após a incubação, os neurônios granulares frouxamente aderido e células progenitoras neuronais são facilmente desmontáveis ​​e afrouxou com toque suave do prato. </li><li> Recolher os neurônios granulares e células progenitoras neurônio em um tubo cônico de 15 ml e centrifugar a 200xg por 5 minutos. Ressuspender o sedimento em 1 ml de soro livre de médio e contar uma alíquota de 10 ml utilizando um hemocitômetro. </li><li> Adicionar soro livre de meio para alcançar a densidade de célula desejada. Directrizes gerais para números de células para a chapa de média densidade: por 6 bem-pratos, 3,5-4000000 células; para placas de quatro poços, 650.000 células. Para 6-bem placas de cultura, eu placa 1,5 ml / poço e para 4 bem-plates, eu chapa de 0,5 ml / poço. As células são mantidas em 5% de CO 2 37 ° C incubadora. Mudar o meio completamente 24 horas mais tarde, com alterações posteriores a cada dois ou três dias. </li></ol>

<ol>
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Este protocolo é baseado em modificações de procedimentos que têm sido descritos na 3,7,11 passado. Há vários pontos importantes a considerar como discutido abaixo. Os neurônios granulares e células progenitoras aderir dentro de 2 horas de placas. Células saudáveis ​​têm uma morfologia redonda sob o microscópio de contraste de fase 4. Dentro de 24 horas após o plaqueamento, as células saudáveis ​​vai se espalhar uniformemente ao redor as lamelas ou o bem de plástico e formarão processos...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cell strainer with 70&mu;m mesh pore</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spinal Needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>405182</td>
<td>20G x 3-1/2 inches</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-Lysine mol wt>300,000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1024</td>
<td>Each new batch of Poly-D-Lysine must be tested. 
</td>
</tr>
<tr>
<td>Percoll</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-1644</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14175-103</td>
<td>Must be calcium and magnesium free.</td>
</tr>
<tr>
<td>Neurobasal A-Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10888-022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutamax I supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>35050-061</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B-27 Serum Free Supplement (50x)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>12-mm circle coverslips </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carolina Biological Supply</td>
<td>63-3029</td>
<td>These are made in Germany by Deckgluder.</td>
</tr>
<tr>
<td>25-mm circle coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carolina Biological Supply</td>
<td>63-3037</td>
<td>These are made in Germany by Deckgluder.</td>
</tr>
<tr>
<td>Papain Dissociation System </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
<td>LK 003150</td>
<td>Kit is good for five isolations.</td>
</tr>
<tr>
<td>Permaset scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS6782</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5 (Dumostar)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS4978</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4-well culture dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>176740</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well culture dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>140685</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons 

O córtex cerebelar é uma estrutura bem descrito que oferece oportunidades únicas para o estudo das propriedades neuronais e 1,2 de desenvolvimento. Dos tipos cerebelar neuronal (células granulares, células de Purkinje e interneurônios inibitórios), neurônios granulares são de longe os mais numerosos e são o tipo mais abundante de neurônios no cérebro de mamíferos. Em roedores, os neurônios granulares do cerebelo são gerados durante as duas primeiras semanas pós-natal a partir de células progenitoras na camada mais externa do córtex cerebelar, a camada granular externa (EGL). O protocolo aqui apresentado descreve técnicas para enriquecer e neurônios granulares cultura e suas células progenitoras da pós-natal do cerebelo de rato. Iremos descrever os procedimentos para obter culturas de pureza aumentando 3,4, o que pode ser usado para estudar a diferenciação de proliferação de células progenitoras em neurônios granulares 5,6. Uma vez que as células progenitoras diferenciar, as culturas também proporcionam uma população homogênea de neurônios granulares para manipulação experimental e caracterização de fenômenos como a sinaptogênese, a função de receptor de glutamato 7, interação com outras células purificadas cerebelar 8,9 ou morte celular 7.

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Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons

Aqui apresentamos um método para isolar e cultivar células granulares do cerebelo e neurônio progenitor neurônios granulares do cerebelo de rato pós-natal.

Isolamento e Cultura de Pós-Natal do rato Cerebelar Granule Células Progenitoras Neuron e Neurônios

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

28.4K visualizações.  Columbia University. Aqui apresentamos um método para isolar e cultivar células granulares do cerebelo e neurônio progenitor neurônios granulares do cerebelo de rato pós-natal.

Vídeo: Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

Isolamento e expansão em grande escala de Adulto Humanos endotelial Colony Células Progenitoras Forming

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Biologia

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

Isolamento e Cultura da Avian embrionárias Células Progenitoras Valvular

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

Isolamento e cultura de células da zona nefrogênica do rim do rato embrionárias

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Isolamento e cultura primária de células hepáticas de ratos

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly the lifetime of the animal. While the precise mechanisms that govern self-renewal and differentiation in vivo are challenging to study, various systems have been developed previously to propagate murine SSCs in vitro using a combination of specialized culture media and feeder cells1-3.
Most in vitro forays into the biology of SSCs have derived cell lines from neonates, possibly due to the difficulty in obtaining adult cell lines4. However, the testis continues to mature up until ~5 weeks of age in most mouse strains. In the early post-natal period, dramatic changes occur in the architecture of the testis and in the biology of both somatic and spermatogenic cells, including alterations in expression levels of numerous stem cell-related genes. Therefore, neonatally-derived SSC lines may not fully recapitulate the biology of adult SSCs that persist after the adult testis has reached a steady state.
Several factors have hindered the production of adult SSC lines historically. First, the proportion of functional stem cells may decrease during adulthood, either due to intrinsic or extrinsic factors5,6. Furthermore, as with other adult stem cells, it has been difficult to enrich SSCs sufficiently from total adult testicular cells without using a combination of immunoselection or other sorting strategies7. Commonly employed strategies include the use of cryptorchid mice as a source of donor cells due to a higher ratio of stem cells to other cell types8. Based on the hypothesis that removal of somatic cells from the initial culture disrupts interactions with the stem cell niche that are essential for SSC survival, we previously developed methods to derive adult lines that do not require immunoselection or cryptorchid donors but rather employ serial enrichment of SSCs in culture, referred to hereafter as SESC2,3.
The method described below entails a simple procedure for deriving adult SSC lines by dissociating adult donor seminiferous tubules, followed by plating of cells on feeders comprised of a testicular stromal cell line (JK1)3. Through serial passaging, strongly adherent, contaminating non-germ cells are depleted from the culture with concomitant enrichment of SSCs. Cultures produced in this manner contain a mixture of spermatogonia at different stages of differentiation, which contain SSCs, based on long-term self renewal capability. The crux of the SESC method is that it enables SSCs to make the difficult transition from self-renewal in vivo to long-term self-renewal in vitro in a radically different microenvironment, produces long-term SSC lines, free of contaminating somatic cells, and thereby enables subsequent experimental manipulation of SSCs.

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

A simple method to derive and maintain spermatogonial stem and progenitor cell lines from adult mice is presented here. The method utilizes feeder cells originating from the somatic cell compartment of the adult mouse testis. This technique is applicable to common mouse strains, including transgenic, knock-out, and knock-in mice.

Enriquecimento de série-tronco de esperma e células progenitoras (SSC) em Cultura para Derivação de longo prazo Adultos Linhas rato SSC

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Isolamento e Cultura de Neonatais rato Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolamento, cultura e caracterização funcional de rato adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolamento e Cultura do mouse primárias células pancreáticas acinares

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

Isolamento, cultura e transplante de células musculares satélite

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolamento e Cultura da Dental epiteliais células-tronco do Adulto Rato Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...