Name: cerebellar regional dissection for molecular analysis
Uploaded: 2020-12-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
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Somos gratos a Austin Ferro e Juao-Guilherme Rosa no laboratório de Cvetanovic por sua ajuda na solução de problemas e na extração de RNA e RTqPCR. Esta pesquisa é financiada por M. Cvetanovic, R01 NS197387; | HHS Instituto Nacional de Saúde (NIH).

1. Configuração
<ol><li>Reúna os equipamentos necessários, incluindo tesouras de decapitação, fórceps contundentes, tesoura de dissecção, tesoura vascular, microspatula, matriz cerebral do rato sagitário, lâminas de barbear, 200 pontas de tubulação de μL, placa de petri de vidro, lâmina de vidro e balde de gelo. Coloque todos os equipamentos em uma almofada absorvente.</li>
	<li>Coloque placa de petri, placa de vidro e matriz cerebral no gelo.</li>
	<li>Usando uma lâmina de barbear em um ângulo perpendicular, corte cerca de 5 mm da ponta de uma ponta de tubulação de 200 μL. Isso faz com que o tamanho da abertura no final da ponta de cerca de 1 mm de largura. Isso deve ser suficiente para socar o DCN. Mas isso também pode ser ajustado conforme necessário, dependendo da dissecção. Tenha muitas dicas prontas para fácil substituição e ajuste.</li>
	<li>Rotular tubos de microfuça de 1,5 mL com identificação animal e região cerebelar (quatro tubos por animal).</li>
	<li>Encha o recipiente de cryosafe com nitrogênio líquido para congelar o tecido após a extração.</li>
</ol>2. Extração e dissecção cerebral
Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes dos Comitês de Cuidados Com Animais da Universidade de Minnesota.
<ol><li>Eutanize o mouse usando 5% de exposição ao CO2. Uma vez que a respiração tenha cessado, realize a luxação cervical. Decapite o rato com a tesoura de decapitação e descarte a carcaça no recipiente apropriado.</li>
	<li>Faça uma incisão com uma lâmina de barbear ao longo da linha sagital medial da cabeça começando pelo nariz e continuando todo o caminho de volta. Separe a pele, separando-se para ambos os lados da linha média. Use a lâmina de barbear para cortar o músculo de cada lado, cortando os canais auditivos.</li>
	<li>Usando uma tesoura dissecando, corte todas as regiões da medula espinhal, até onde o tronco cerebral encontra o cerebelo, cuidado para não danificar o cerebelo.</li>
	<li>Insira uma das lâminas vasculares da tesoura no espaço entre o tronco cerebral e a coluna vertebral e corte em direção ao canal auditivo, levantando-se sobre a tesoura para cortar o osso limpamente, mas limitar danos ao tecido.</li>
	<li>Continue cortando ao longo da borda do crânio em direção às lâmpadas olfativas, continuando a levantar-se enquanto corta para limitar danos ao tecido cerebral.</li>
	<li>Usando os fórceps contundentes, retire suavemente a parte de trás do crânio descobrindo a região posterior do cérebro e do cerebelo.</li>
	<li>Usando os fórceps contundentes ao longo da borda do crânio que foi apenas cortado, descasque o resto do crânio para cima e sobre o cérebro. Esta etapa deve remover a maior parte da tampa do crânio, revelando o cérebro.</li>
	<li>Corte o resto do crânio com a tesoura vascular e fórceps contundentes, limpando a maior parte do crânio do topo do cérebro.</li>
	<li>Usando a microspatula, levante o cérebro ligeiramente e colher para baixo e deslize para cima para remover as lâmpadas olfativas do crânio restante e desconectar fibras do trato óptico. O cérebro deve sair livre facilmente neste momento.</li>
	<li>Coloque o cérebro na placa de petri sentada no gelo e remova qualquer crânio restante ou outros detritos.</li>
	<li>Usando a microspatula, coloque suavemente o cérebro na matriz cerebral com o lado dorsal para cima. Leve tempo para ter certeza de que está definido nível na matriz, especialmente que a linha média cai no centro da matriz. Esta matriz é projetada para tecido cerebral de camundongos adultos, tecido de animais mais jovens ou doentes pode ficar mais baixo na matriz, mas ainda deve ser possível alcançar resultados reprodutíveis entre as amostras.</li>
	<li>Coloque uma lâmina de barbear ao longo da linha média sagital, certificando-se de que a lâmina empurra todo o caminho até a parte inferior da matriz(Figura 1B).</li>
	<li>Coloque outra lâmina de barbear 1 mm ao lado da primeira lâmina(Figura 1B). Coloque mais duas lâminas 1 mm de distância uma da outra. O resultado final deve ser três lâminas colocadas em um lado do cérebro, todas com 1mm de distância. Faça o mesmo com o outro lado. No total, 7 lâminas serão colocadas 1mm de distância(Figura 1C).</li>
	<li>Com cuidado, pegue as extremidades dianteira e traseira das lâminas de barbear e levante para fora da matriz. O tecido do lado de fora das lâminas de barbear pode ser descartado.</li>
	<li>Lentamente, separe uma lâmina de barbear de cada vez das outras, tomando cuidado para não danificar as seções teciduais.</li>
	<li>Deslize cuidadosamente a seção de tecido para fora da lâmina de barbear e sobre a lâmina de vidro com a microspatula. No total, haverá seis seções cerebrais sagiais(Figura 1D).</li>
	<li>As 4 seções mais laterais terão DCN visível (caixa roxa, Figura 1D). Para isolar o DCN, segure a ponta de tubulação de 200 μL aparada perpendicularmente sobre o DCN e empurre para baixo através do tecido firmemente, balançando em todas as direções para dissecar totalmente o DCN do tecido circundante. Levante-se para cima para remover o DCN de forma limpa e confirme visualmente a presença do tecido na ponta.</li>
	<li>Coloque um dedo na parte superior da ponta e empurre para baixo, fazendo com que o tecido se avolua. Coloque a ponta no tubo de microfuça corretamente rotulado e certifique-se de que o ponche de tecido seja colocado na parte inferior do tubo. Repita 2.17 para as três seções restantes, colocando os socos DCN no mesmo tubo. Coloque o tubo em nitrogênio líquido para congelar. Representação do tamanho de cada soco na Figura 1E.</li>
	<li>Seções que tiveram DCN extraída se qualificam como hemisfério cerebelar. Afaste o resto do tecido cerebral ao redor do cerebelo nestas seções. Use fórceps contundentes e pegue suavemente essas seções de córtex cerebelares do hemisfério e coloque em seu respectivo tubo de microfuge. Congelamento de flash.</li>
	<li>Para as duas últimas seções vermais (caixa azul claro, Figure1D), afaste o tecido cerebral circundante deixando apenas o cerebelo. Usando uma lâmina de barbear, faça um corte separando os lobulos anteriores dos lobos posteriores. O corte deve ser logo após a formação do lobule 6 e não deve incluir lobule 10 (Figura 1F).</li>
	<li>Usando fórceps contundentes, coloque cuidadosamente as seções anteriores do córtex cerebelar e as seções posteriores do córtex cerebelar em seus respectivos tubos de microfuge e congele os flashes deixando os tubos em nitrogênio líquido por 5 minutos. Daqui vá para a extração do RNA, ou pode armazenar os tubos a -80 °C.</li>
</ol>3. Extração de RNA 
NOTA: Este protocolo é modificado a partir do Protocolo cold spring harbor para extração de RNA com TRIzol20. TRIzol solubiliza material biológico, possibilitando a extração de RNA.
<ol><li>Coloque os tubos de microfuge no gelo para evitar que o tecido descongele muito rapidamente, aplique 150 μL de TRIzol frio no tubo de microfuge. Homogeneize-se com um pilão esterilizado. Uma vez homogeneizado o tecido, encotime a solução para cima e para baixo para garantir que não haja tecido restante intacto. Cada vez mais quebre qualquer pequeno pedaço de tecido puxando-o para cima em uma seringa de insulina algumas vezes.</li>
	<li>Adicione mais 350 μL de TRIzol e pipet para cima e para baixo para misturar bem. Deixe descansar na temperatura da sala por 5 minutos.</li>
	<li>Adicione 150 μL de clorofórmio ao tubo e agite vigorosamente e deixe descansar por 2-3 minutos. O clorofórmio separa a solução de tecido homogeneizado em fases (RNA, DNA e proteína).</li>
	<li>Centrifugar a 12.000 x g, a 15°C, por 10 minutos. Certifique-se de que todos os tubos estão na mesma orientação.</li>
	<li>Remova cuidadosamente os tubos e coloque a temperatura da centrífuga para 4°C. Remova apenas a fase aquosa clara em um novo tubo (este é o RNA), cuidado para não interromper a interfase opaca (o DNA).  A fase mais baixa será vermelha e contém proteína. A solução restante nos tubos pode ser salva ou descartada.</li>
	<li>Adicione 100% de álcool isopropílico a uma proporção de 1:2 (se removido 200 ul de fase aquosa, adicione 100 μL de álcool isopropílico). Misture bem por pipetting para cima e para baixo. Deixe descansar em temperatura ambiente por 10 minutos. O álcool isopropílico precipita o RNA fora de solução.</li>
	<li>Centrifugar a 12.000 x g, a 4°C, por 10 minutos. Certifique-se de colocar todos os tubos na mesma orientação para facilitar a visualização da pelota. A pelota resultante será o RNA extraído.</li>
	<li>Remova cuidadosamente os tubos, remova o sobrenante com uma pipeta tomando cuidado para não interromper a pelota. A pelota é um pouco parecida com gel e será difícil de ver, mas deve ser capaz de estimar onde ela é baseada na orientação dos tubos na centrífuga.</li>
	<li>Depois de remover todo o supernascido, adicione 500 μL de 75% de etanol, vórtice brevemente, e centrífuga a 7500 x g, a 4°C, por 5 minutos. O etanol lava ainda mais a pelota.</li>
	<li>Remova o supernatante cuidadosamente, sem interromper a pelota. Deixe as tampas abertas para secar a amostra. Isso geralmente leva de 5 a 10 minutos, mas pode variar dependendo de quanto etanol foi deixado na pelota. Não seque demais.</li>
	<li>Uma vez seco, resuspenque a pelota em dNase água livre. Adicione 20 μL às amostras para DCN e 30 μL para todas as outras.</li>
	<li>Uma vez resuspended, as amostras podem ser armazenadas a -80 °C ou proceder para novos testes.</li>
</ol>4. Reação quantitativa da cadeia de polimerase em tempo real (RTqPCR)
<ol><li>Antes desta etapa será necessário dNase tratar o RNA para remover qualquer DNA genômico, e gerar cDNA utilizando iScript da BioRad. Certifique-se de normalizar a concentração de RNA antes de fazer o cDNA. Além disso, é importante otimizar primers para qPCR. Siga os métodos descritos aqui para completar esta etapa21. Breve descrição do qPCR abaixo.</li>
	<li>Os primers são todos comprados do IDT. As sequências dianteiras e inversas estão no mesmo tubo de amostra e armazenadas na concentração de 20x. Rps18 (gene de controle): Avanço – 5'-CCTGAGAAGTTCCAGCACAT-3' Reverso – 5'-ACACCACATGAGCATATCTCC-3' Parvalbumina (proteína de ligação de cálcio, células inibitórias): Atacante – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3' Reverso – '5-AGCGTCTTTTTCTTTAGCAG-3' KCNG4 (subunidade do canal de potássio): Atacante – 5'-CTGTCTCTCTCTGGTCAGTGA-3' Reverso – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3' Aldolase C (Zebrin II, expressa diferencialmente através do córtex cerebelar): Atacante – 5'-AGAGGACAAAGGGATAATGCTG-3' Reverso – 5'-TCAGTAGGGGTTGGC-3'</li>
	<li>qPCR condições foram as seguintes. Período de pré-incubação, 5 minutos, a 95°C. Período de amplificação, 50 ciclos: 10 minutos a 95°C, 10 minutos a 62°C e 10 minutos a 72°C. Período de curva de fusão, 5 segundos a 95°C, um minuto a 65°C, e definir a taxa de rampa para 0,07°C/segundo até a temperatura-alvo de 97°C. Em seguida, período de resfriamento por 10 minutos a 40°C.  Todas as reações qPCR foram realizadas em triplicado e a expressão genética foi analisada utilizando-se 2- ΔΔCt com Rps18 como um controle de carga para normalizar a expressão genética. Extrato cerebelar a granel foi usado como referência.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glia/neuron+ratio:+How+it+varies+uniformly+across+brain+structures+and+species+and+what+that+means+for+brain+physiology+and+evolution.">The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution.</a> Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).</li><li>Schmahmann, J. 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Os autores não têm nada a revelar.

O método descrito aqui permite avaliar a expressão genética subjacente e os mecanismos moleculares dentro de quatro regiões cerebelares distintas – os núcleos cerebelares profundos (DCN), o córtex cerebelar anterior dos vermis (CCaV), o córtex cerebelar posterior dos vermis (CCPV) e o córtex cerebelar dos hemisférios (CCH). A capacidade de avaliar essas regiões separadamente ampliará nosso conhecimento da heterogeneidade de regiões cerebelares específicas e possivelmente lançará luz sobre sua contribuiç...

O cerebelo contém mais da metade dos neurônios do cérebro e tem sido historicamente referido como um centro de controle e equilíbrio motor no cérebro1. Mais recentemente, estudos demonstraram que o cerebelo desempenha um papel fundamental em várias outras funções, incluindo cognição, processamento de recompensas e afeto2,3,4,5.
O cerebelo tem anatomia bem descrita: a região do córtex é composta de granulo, Purkinje e camadas moleculares. As células de grânulo formam a camada celular do grânulo e enviam entrada através de fibras paralelas aos dendritos celulares Purkinje da camada molecular que também recebem entrada de fibras de escalada que se originaram na azeitona inferior. As células purkinje enviam projeções inibitórias para as células nos núcleos cerebelares profundos (DCN), que serve como a principal saída do cerebelo. A saída deste circuito cerebelar é ainda mais modulada pela atividade dos interneurônios inibitórios no córtex cerebelar, incluindo Golgi, stellate e células cesta4. Esta unidade funcional cerebelar é distribuída por todos os lobules do córtex cerebelar. Apesar deste circuito relativamente uniforme em todo o cerebelo, evidências da literatura de neuroimagem humana e estudos de pacientes indicam heterogeneidade funcional do cerebelo6,7.
O córtex cerebelar pode ser dividido em duas regiões principais: os vermis definidos pela linha média e os hemisférios laterais. Os vermis podem ser ainda divididos em lobulos anteriores e posteriores. Essas regiões distintas do cerebelo foram implicadas em contribuir para diferentes comportamentos. Padrões de atividade evocados por tarefas ou sem tarefas implicaram que as regiões anteriores dos vermis contribuem mais para a função motora, enquanto vermis posteriores contribuem mais para a cognição6,7. Os vermis também estão ligados ao afeto e às emoções, enquanto os hemisférios cerebelares contribuem para funções executivas, visuais-espaciais, linguísticas e outras funções mnemônicas8. Além disso, estudos anatômicos forneceram evidências de que regiões cerebelares funcionalmente distintas estão conectadas com diferentes regiões corticais9. O mapeamento de lesões-sintomas revelou que pacientes com derrames que afetam os lobulos anteriores (estendendo-se ao lobule VI) apresentaram pior desempenho em tarefas motoras finas, enquanto pacientes com danos em regiões posteriores do lobo e hemisférios apresentaram déficits cognitivos na ausência da síndrome motor cerebelar10. Por fim, a patologia cerebelar regional em doença indica que as regiões cerebelares funcionalmente distintas também são diferentemente suscetíveis à doença11,12.
Embora muito menos exploradas, evidências preliminares demonstram distintas assinaturas de expressão genética em regiões corticais cerebelares. A expressão celular purkinje de Zebrin II mostra a padronização específica da região nos vermímis de tal forma que há mais células positivas zebrin II nos lobulos posteriores e menos nos lobulos anteriores13. Isso também se correlaciona com a função fisiológica regionalmente distinta, pois as células Purkinje negativas zebrin II apresentam maior frequência de disparo tônico do que as células Purkinje que são Zebrin II positiva14.
Além do córtex cerebelar, o cerebelo inclui os núcleos cerebelares profundos (DCN) que servem como a saída primária para o cerebelo. Os núcleos são compostos pelos núcleos medial (MN), interposto (IN) e núcleos laterais (LN). Imagens funcionais e estudos de pacientes demonstraram que o DCN também participa de vários comportamentos15, mas pouquíssimos estudos examinam a mudança da expressão genética no DCN.
Os avanços nas técnicas moleculares permitiram avaliar a expressão genética regional no cérebro e descobriram a heterogeneidade em diferentes regiões cerebrais nos estados fisiológicos e dedoenças 16. Tais estudos implicam que o cerebelo é diferente de outras regiões cerebrais. Por exemplo, a proporção de neurônios para células gliais é invertida no cerebelo em comparação com outras regiões cerebrais1. Mesmo em condições fisiológicas normais, a expressão de genes proinflamatórios é regulada no cerebelo em comparação com as outras regiões cerebrais17. Técnicas moleculares também têm sido muito úteis na identificação dos caminhos que contribuem para a patogênese das doenças cerebelares. Por exemplo, o sequenciamento de RNA de todos os extratos cerebelares identificou genes alterados em um modelo de rato transgênico específico da célula Purkinje de ataxia spinocerebellar tipo 1 (SCA1) em comparação com seus controles de tipo selvagem. Tais evidências revelaram as principais vias moleculares subjacentes à patogênese nas células cerebelares Purkinje e ajudaram a identificar potenciais alvos terapêuticos18. No entanto, estudos recentes sugerem que há diferenças na vulnerabilidade às doenças nas regiões cerebelares11,12,19. Isso pode indicar que há mudanças-chave ocorrendo em regiões cerebelares distintas, que podem ser mascaradas ou não detectadas com extratos cerebelares inteiros. Assim, é necessário desenvolver técnicas que permitam aos pesquisadores examinar perfis moleculares em diferentes regiões cerebelares.
A técnica aqui proposta descreve um método reprodutível para dissecar quatro regiões distintas do cerebelo do camundongo, a fim de isolar o RNA dessas regiões e explorar diferenças regionais na expressão genética. O esquema do cerebelo do rato na Figura 1A destaca os vermísis em azul, e hemisférios em amarelo. Especificamente, esta técnica permite isolar quatro regiões: núcleos cerebelares profundos (DCN) (caixas pontilhadas vermelhas na Figura 1A), o córtex cerebelar de vermis anterior (CCaV) (azul escuro em Figura 1A), o córtex cerebelar dos vermis posteriores (CCpV) (azul claro na Figura 1A), e o córtex cerebelar dos hemisférios (CCH) (amarelo na Figura 1A). Ao avaliar a expressão genética dessas regiões separadamente, será possível investigar mecanismos moleculares subjacentes a funções discretas dessas diferentes regiões, bem como potenciais diferenças em sua vulnerabilidade na doença.

<table><tbody><tr><td>1.5 Microcentrifuge tubes</td><td>ThermoScietific</td><td>3456</td><td></td></tr><tr><td>100% Isopropyl Alcohol</td><td>VWR Life sciences</td><td>1106C361</td><td></td></tr><tr><td>200 ul Pipet tips</td><td>GeneMate</td><td>P-1237-200</td><td></td></tr><tr><td>Adult Mouse Brain Matrix Sagittal</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>RBMA-200S</td><td></td></tr><tr><td>Blunt forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Macron</td><td>220905</td><td></td></tr><tr><td>Decapitation Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Glass Slide (for electrophoresis)</td><td>BIORAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer</td><td>Kimble</td><td>6HAZ6</td><td></td></tr><tr><td>Ice Bucket</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulin Syringe (.5ml)</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR</td><td>BIORAD</td><td>1725037</td><td></td></tr><tr><td>Micro Spatula</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needle Nose forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primetime Primer for Aldolase C</td><td>IDT</td><td>Mm.PT.58&gt;43415246</td><td></td></tr><tr><td>Primetime Primer for Kcng4</td><td>IDT</td><td>Mm.PT.56a.9448518</td><td></td></tr><tr><td>Primetime Primer for Parvalbumin</td><td>IDT</td><td>Mm.PT.58.7596729</td><td></td></tr><tr><td>Primetime Primer Rps18&amp;nbsp;</td><td>IDT</td><td>Mm.PT.58.12109666</td><td></td></tr><tr><td>Single Edge Rzor Blades</td><td>Personna GEM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile, sigle-use pestles</td><td>FisherScientific</td><td>12141364</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Ambion by Life technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Vascular Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cerebellar regional dissection for molecular analysis

O cerebelo desempenha um papel importante em várias funções-chave, incluindo controle de movimento, equilíbrio, cognição, recompensa e afeto. Estudos de imagem indicam que regiões cerebelares distintas contribuem para essas diferentes funções. Estudos moleculares que examinam as diferenças cerebelares regionais estão defasando, pois são feitos principalmente em extratos cerebelares inteiros, mascarando assim quaisquer distinções em regiões cerebelares específicas. Aqui descrevemos uma técnica para dissecar de forma reproduzivelmente e rápida quatro regiões cerebelares diferentes: os núcleos cerebelares profundos (DCN), o córtex cerebelar vermal anterior e posterior, e o córtex cerebelar dos hemisférios. Dissecar essas regiões distintas permite a exploração de mecanismos moleculares que possam fundamentar suas contribuições únicas para o equilíbrio, o movimento, o afeto e a cognição. Esta técnica também pode ser usada para explorar diferenças na suscetibilidade patológica dessas regiões específicas em vários modelos de doenças de camundongos.

Para esses experimentos, foram utilizados quatro camundongos fêmeas de onze semanas de idade, tipo C57/Black6. Um rato foi usado para realizar uma dissecção cerebelar completa que é referida como "cerebelo a granel" e permitiu a comparação dos níveis de RNA em regiões dissecadas a uma dissecção completa. Os outros três camundongos foram usados para conduzir a dissecção cerebelar descrita neste protocolo. O uso de três camundongos torna possível garantir que as tendências d...

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Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

Diferentes regiões cerebelares foram implicadas a desempenhar um papel em distintas saídas comportamentais, mas os mecanismos moleculares subjacentes permanecem desconhecidos. Este trabalho descreve um método para dissecar de forma reproduzivelmente e rápida o córtex cerebelar dos hemisférios, regiões anteriores e posteriores dos vermímis, e os núcleos cerebelares profundos, a fim de sondar as diferenças moleculares isolando o RNA e testando diferenças na expressão genética.

Dissecção Regional Cerebelr para Análise Molecular

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies ...

cerebellar-regional-dissection-for-molecular-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

4.0K visualizações.  University of Minnesota. Diferentes regiões cerebelares foram implicadas a desempenhar um papel em distintas saídas comportamentais, mas os mecanismos moleculares subjacentes permanecem desconhecidos. Este trabalho descreve um método para dissecar de forma reproduzivelmente e rápida o córtex cerebelar dos hemisférios, regiões anteriores e posteriores dos vermímis, e os núcleos cerebelares profundos, a fim de sondar as diferenças moleculares isolando o RNA e testando diferenças na expre...

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Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its relatively uniform cytoarchitecture is a complex array of parasagittal domains of gene and protein expression. The molecular compartmentalization of the cerebellum is mirrored by the anatomical and functional organization of afferent fibers. To fully appreciate the complexity of cerebellar organization we previously refined a wholemount staining approach for high throughput analysis of patterning defects in the mouse cerebellum. This protocol describes in detail the reagents, tools, and practical steps that are useful to successfully reveal protein expression patterns in the adult mouse cerebellum by using wholemount immunostaining. The steps highlighted here demonstrate the utility of this method using the expression of zebrinII/aldolaseC as an example of how the fine topography of the brain can be revealed in its native three-dimensional conformation. Also described are adaptations to the protocol that allow for the visualization of protein expression in afferent projections and large cerebella for comparative studies of molecular topography. To illustrate these applications, data from afferent staining of the rat cerebellum are included.

Neural circuits are topographically organized into functional compartments with specific molecular profiles. Here, we provide the practical and technical steps for revealing global brain topography using a versatile wholemount immunohistochemical staining approach. We demonstrate the utility of the method using the well-understood cytoarchitecture and circuitry of cerebellum.

Imuno-histoquímica para Topografia Wholemount cerebrais, Complexo

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

Neurociência

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. This method was first utilized in the study of Nestin-expressing progenitors (NEPs), a newly identified population of cells in the cerebellar external germinal layer (EGL). Using microdissection in combination with fluorescent-activated cell sorting (FACS), a pure population of NEPs was collected separately from conventional granule neuron precursors in the EGL and from other contaminating Nestin-expressing cells in the cerebellum. Without microdissection, functional analyses of NEPs would not have been possible with the current methods available, such as Percoll gradient centrifugation and laser capture microdissection. This technique can also be applied for use with various tissues that contain either recognizable regions or fluorescently-labeled cells. Most importantly, a major advantage of this microdissection technique is that isolated cells are living and can be cultured for further experimentation, which is currently not possible with other described methods.

Nestin-expressing&#160;progenitors are a newly identified population of neuronal progenitors in the developing cerebellum. Using the microdissection technique presented here in combination with fluorescent-activated cell sorting, this cell population can be purified with no contamination from other cerebellar regions and can be cultured for further studies.

O isolamento de populações de células distintas do cerebelo em desenvolvimento por Microdissecção

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of intellectual disability and account for 20-40% of drug-resistant epilepsy in childhood. High-resolution brain imaging has facilitated in vivo identification of a large group of MCD phenotypes. Despite the advances in brain imaging, genomic analysis and generation of animal models, a straightforward workflow to systematically prioritize candidate genes and to test functional effects of putative mutations is missing. To overcome this problem, an experimental strategy enabling the identification of novel causative genes for MCD was developed and validated. This strategy is based on identifying candidate genomic regions or genes via array-CGH or whole-exome sequencing and characterizing the effects of their inactivation or of overexpression of specific mutations in developing rodent brains via in utero electroporation. This approach led to the identification of the C6orf70 gene, encoding for a putative vesicular protein, to the pathogenesis of periventricular nodular heterotopia, a MCD caused by defective neuronal migration.

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Periventricular nodular heterotopia (PNH) is the most common form of malformation of cortical development (MCD) in adulthood but its genetic basis remains unknown in most sporadic cases. We have recently developed a strategy to identify novel candidate genes for MCDs and to directly confirm their causative role in vivo.

Uma nova estratégia combinando Array-CGH, todo-exome sequenciamento e eletroporação no Utero em roedores para identificar Genes causadores de malformações do cérebro

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex (mPFC) or nucleus accumbens. The challenge in this work is to dissect the correct area while preserving the microenvironment to be examined. In this paper, we describe a simple, low-cost method using resources readily available in most labs. This method preserves nucleic acid and proteins by keeping the tissue frozen throughout the process. Brains are cut into 0.5&#8211;1.0 mm sections using a brain matrix and arranged on a frozen glass plate. Landmarks within each section are compared to a reference, such as the Allen Mouse Brain Atlas, and regions are dissected using a cold scalpel or biopsy punch. Tissue is then stored at -80 &#176;C until use. Through this process rat and mouse mPFC, nucleus accumbens, dorsal and ventral hippocampus and other regions have been successfully analyzed using qRT-PCR and Western assays. This method is limited to brain regions that can be identified by clear landmarks.

This procedure describes the collection of discrete frozen brain regions to obtain high-quality protein and RNA using inexpensive and commonly available tools.

Coleção de regiões cerebrais de roedores congelados para análises a jusante

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

Ex Vivo Myelination and Remyelination in Cerebellar Slice Cultures as a Quantitative Model for Developmental and Disease-Relevant Manipulations

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in vitro, although scalable,&#160;does not recapitulate axonal myelination. OPC-neuron cocultures and OPC-fiber cultures allow for the examination of in vitro myelination, but they lack additional cell types that are present in vivo, such as astrocytes and microglia. In vivo&#160;mouse models, however, are less amenable to chemical, environmental, and genetic manipulation and are much more labor intensive. Here, we describe&#160;an&#160;ex vivo mouse cerebellar slice culture (CSC) quantitative system that is useful for: 1) studying developmental myelination, 2) modeling demyelination and remyelination, and 3) conducting translational research. Sagittal sections of the cerebellum and hindbrain are isolated from postnatal day (P) 0&#8211;2 mice, after which they myelinate&#160;ex vivo&#160;for 12 days. During this period, slices can be manipulated in various ways, including the addition of compounds to test for an effect on developmental myelination. In addition, tissue can be fixed for electron microscopy to assess myelin ultrastructure and compaction. To model disease, CSC can be subjected to acute hypoxia to induce hypomyelination. Demyelination in these explants can also be induced by lysolecithin, which allows for the identification of factors that promote remyelination. Aside from chemical and environmental modifications, CSC can be isolated from transgenic mice and are responsive to genetic manipulation induced with Ad-Cre adenoviruses and tamoxifen. Thus, cerebellar slice cultures are a fast, reproducible, and quantifiable model for recapitulating myelination.

Presented is a protocol for an ex vivo quantitative model of demyelination and remyelination using mouse cerebellar slice cultures. This method closely recapitulates an in vivo model with its full complement of CNS cell types in intact tissue, while maintaining the chemical, genetic, and environmental amenability of an in vitro system.

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in ...

Microdissection of Mouse Brain into Functionally and Anatomically Different Regions

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain consists of an outer covering of grey matter over the hemispheres known as the cerebral cortex. Underneath this layer reside many other specialized structures that are essential for multiple phenomenon important for existence. Acquiring samples of specific gross brain regions requires quick and precise dissection steps.&#160;It is understood that at the microscopic level, many sub-regions exist and likely cross the arbitrary regional boundaries that we impose for the purpose of this dissection.
Mouse models are routinely used to study human brain functions and diseases. Changes in gene expression patterns may be confined to specific brain areas targeting a particular phenotype depending on the diseased state. Thus, it is of great importance to study regulation of transcription with respect to its well-defined structural organization. A complete understanding of the brain requires studying distinct brain regions, defining connections, and identifying key differences in the activities of each of these brain regions. A more comprehensive understanding of each of these distinct regions may pave the way for new and improved treatments in the field of neuroscience. Herein, we discuss a step-by-step methodology for dissecting the mouse brain into sixteen distinct regions. In this procedure, we have focused on male mouse C57Bl/6J (6-8 week old) brain removal and dissection into multiple regions using neuroanatomical landmarks to identify and sample discrete functionally-relevant and behaviorally-relevant&#160;brain regions. This work will help lay a strong foundation in the field of neuroscience, leading to more focused approaches in the deeper understanding of brain function.

We present a hands-on, step-by-step, rapid protocol for mouse brain removal and dissection of discrete regions from fresh brain tissue. Obtaining brain regions for molecular analysis has become routine in many neuroscience labs. These brain regions are immediately frozen to obtain high quality transcriptomic data for system level analysis.

Microdisseção do Cérebro de Camundongos em Regiões Funcional e Anatomicamente Diferentes

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain ...

Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone (SEZ) is a thin and distinct region exposed to the ventricles and cerebrospinal fluid. The isolation of this niche allows the analysis of a neurogenic stem cell microenvironment. However, extraction of small tissues for proteome analysis&#160;is challenging, especially for the maintenance of considerable measurement depth and the achievement of reliable robustness. A new method termed cryo-section-dissection (CSD), combining high precision with minimal tissue perturbation, was developed to address these challenges. The method is compatible with state-of-the-art mass spectrometry (MS) methods that allow the detection of low-abundant niche regulators. This study compared the CSD and its proteome data to the method and data obtained by laser-capture-microdissection (LCM) and a standard wholemount dissection. The CSD method resulted in twice the quantification depth in less than half the preparation time compared to the LCM and simultaneously clearly outperformed the dissection precision of the wholemount dissection. Hence, CSD is a superior method for collecting the SEZ for proteome analysis.

Cryo-section-dissection allows fresh, frozen preparation of the largest neurogenic niche in the murine brain for deep quantitative proteome analysis. The method is precise, efficient, and causes minimal tissue perturbation. Therefore, it is ideally suited for studying the molecular microenvironment of this niche, as well as other organs, regions, and species.

Dissecção crio-seção da zona subependímal adulta para análise proteome quantitativa precisa e profunda

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone ...

A Standardized Pipeline for Examining Human Cerebellar Grey Matter Morphometry using Structural Magnetic Resonance Imaging

Multiple lines of research provide compelling evidence for a role of the cerebellum in a wide array of cognitive and affective functions, going far beyond its historical association with motor control. Structural and functional neuroimaging studies have further refined understanding of the functional neuroanatomy of the cerebellum beyond its anatomical divisions, highlighting the need for the examination of individual cerebellar subunits in healthy variability and neurological diseases. This paper presents a standardized pipeline for examining cerebellum grey matter morphometry that combines high-resolution, state-of-the-art approaches for optimized and automated cerebellum parcellation (Automatic Cerebellum Anatomical Parcellation using U-Net Locally Constrained Optimization; ACAPULCO) and voxel-based registration of the cerebellum (Spatially Unbiased Infra-tentorial Template; SUIT) for volumetric quantification. 
The pipeline has broad applicability to a range of neurological diseases and is fully automated, with manual intervention only required for quality control of the outputs. The pipeline is freely available, with substantial accompanying documentation, and can be run on Mac, Windows, and Linux operating systems. The pipeline is applied in a cohort of individuals with Friedreich ataxia (FRDA), and representative results, as well as recommendations on group-level inferential statistical analyses, are provided. This pipeline could facilitate reliability and reproducibility across the field, ultimately providing a powerful methodological approach for characterizing and tracking cerebellar structural changes in neurological diseases.

A standardized pipeline is presented for examining cerebellum grey matter morphometry. The pipeline combines high-resolution, state-of-the-art approaches for optimized and automated cerebellum parcellation and voxel-based registration of the cerebellum for volumetric quantification.

Um pipeline padronizado para examinar morfometria de matéria cinzenta cerebelar humana usando ressonância magnética estrutural

Multiple lines of research provide compelling evidence for a role of the cerebellum in a wide array of cognitive and affective functions, going far beyond ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

A validação de um modelo de camundongo para Disrupt Complexos LINC de um modo específico de célula

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Biologia

<meta charset="utf8"></head><body>Células cerebelares de Purkinje: resposta a danos no DNA em culturas organotípicas

Visualizing the DNA Damage Response in Purkinje Cells Using Cerebellar Organotypic Cultures

Cerebellar Purkinje cells (PCs) exhibit a unique interplay of high metabolic rates, specific chromatin architecture, and extensive transcriptional activity, making them particularly vulnerable to DNA damage. This necessitates an efficient DNA damage response (DDR) to prevent cerebellar degeneration, often initiated by PC dysfunction or loss. A notable example is the genome instability syndrome, ataxia-telangiectasia (A-T), marked by progressive PC depletion and cerebellar deterioration. Investigating DDR mechanisms in PCs is vital for elucidating the pathways leading to their degeneration in such disorders. However, the complexity of isolating and cultivating PCs in vitro has long hindered research efforts. Murine cerebellar organotypic (slice) cultures offer a feasible alternative, closely mimicking the in vivo tissue environment. Yet, this model is constrained to DDR indicators amenable to microscopic imaging. We have refined the organotypic culture protocol, demonstrating that fluorescent imaging of protein-bound poly(ADP-ribose) (PAR) chains, a rapid and early DDR indicator, effectively reveals DDR dynamics in PCs within these cultures, in response to genotoxic stress.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: decifrando o papel da ATM na ataxia-telangiectasia e na degeneração cerebelar associada

Cerebellar Purkinje cells (PCs) are particularly sensitive to deficiencies in the DNA damage response. A protocol is presented for the visual evaluation of the dynamics of PC response to DNA damage, which involves staining protein-bound poly(ADP-ribose) chains within cerebellar organotypic cultures.