Somos gratos a Austin Ferro e Juao-Guilherme Rosa no laboratório de Cvetanovic por sua ajuda na solução de problemas e na extração de RNA e RTqPCR. Esta pesquisa é financiada por M. Cvetanovic, R01 NS197387; | HHS Instituto Nacional de Saúde (NIH).

1. Configuração
<ol><li>Reúna os equipamentos necessários, incluindo tesouras de decapitação, fórceps contundentes, tesoura de dissecção, tesoura vascular, microspatula, matriz cerebral do rato sagitário, lâminas de barbear, 200 pontas de tubulação de μL, placa de petri de vidro, lâmina de vidro e balde de gelo. Coloque todos os equipamentos em uma almofada absorvente.</li>
	<li>Coloque placa de petri, placa de vidro e matriz cerebral no gelo.</li>
	<li>Usando uma lâmina de barbear em um ângulo perpendicular, corte cerca de 5 mm da ponta de uma ponta de tubulação de 200 μL. Isso faz com que o tamanho da abertura no final da ponta de cerca de 1 mm de largura. Isso deve ser suficiente para socar o DCN. Mas isso também pode ser ajustado conforme necessário, dependendo da dissecção. Tenha muitas dicas prontas para fácil substituição e ajuste.</li>
	<li>Rotular tubos de microfuça de 1,5 mL com identificação animal e região cerebelar (quatro tubos por animal).</li>
	<li>Encha o recipiente de cryosafe com nitrogênio líquido para congelar o tecido após a extração.</li>
</ol>2. Extração e dissecção cerebral
Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes dos Comitês de Cuidados Com Animais da Universidade de Minnesota.
<ol><li>Eutanize o mouse usando 5% de exposição ao CO2. Uma vez que a respiração tenha cessado, realize a luxação cervical. Decapite o rato com a tesoura de decapitação e descarte a carcaça no recipiente apropriado.</li>
	<li>Faça uma incisão com uma lâmina de barbear ao longo da linha sagital medial da cabeça começando pelo nariz e continuando todo o caminho de volta. Separe a pele, separando-se para ambos os lados da linha média. Use a lâmina de barbear para cortar o músculo de cada lado, cortando os canais auditivos.</li>
	<li>Usando uma tesoura dissecando, corte todas as regiões da medula espinhal, até onde o tronco cerebral encontra o cerebelo, cuidado para não danificar o cerebelo.</li>
	<li>Insira uma das lâminas vasculares da tesoura no espaço entre o tronco cerebral e a coluna vertebral e corte em direção ao canal auditivo, levantando-se sobre a tesoura para cortar o osso limpamente, mas limitar danos ao tecido.</li>
	<li>Continue cortando ao longo da borda do crânio em direção às lâmpadas olfativas, continuando a levantar-se enquanto corta para limitar danos ao tecido cerebral.</li>
	<li>Usando os fórceps contundentes, retire suavemente a parte de trás do crânio descobrindo a região posterior do cérebro e do cerebelo.</li>
	<li>Usando os fórceps contundentes ao longo da borda do crânio que foi apenas cortado, descasque o resto do crânio para cima e sobre o cérebro. Esta etapa deve remover a maior parte da tampa do crânio, revelando o cérebro.</li>
	<li>Corte o resto do crânio com a tesoura vascular e fórceps contundentes, limpando a maior parte do crânio do topo do cérebro.</li>
	<li>Usando a microspatula, levante o cérebro ligeiramente e colher para baixo e deslize para cima para remover as lâmpadas olfativas do crânio restante e desconectar fibras do trato óptico. O cérebro deve sair livre facilmente neste momento.</li>
	<li>Coloque o cérebro na placa de petri sentada no gelo e remova qualquer crânio restante ou outros detritos.</li>
	<li>Usando a microspatula, coloque suavemente o cérebro na matriz cerebral com o lado dorsal para cima. Leve tempo para ter certeza de que está definido nível na matriz, especialmente que a linha média cai no centro da matriz. Esta matriz é projetada para tecido cerebral de camundongos adultos, tecido de animais mais jovens ou doentes pode ficar mais baixo na matriz, mas ainda deve ser possível alcançar resultados reprodutíveis entre as amostras.</li>
	<li>Coloque uma lâmina de barbear ao longo da linha média sagital, certificando-se de que a lâmina empurra todo o caminho até a parte inferior da matriz(Figura 1B).</li>
	<li>Coloque outra lâmina de barbear 1 mm ao lado da primeira lâmina(Figura 1B). Coloque mais duas lâminas 1 mm de distância uma da outra. O resultado final deve ser três lâminas colocadas em um lado do cérebro, todas com 1mm de distância. Faça o mesmo com o outro lado. No total, 7 lâminas serão colocadas 1mm de distância(Figura 1C).</li>
	<li>Com cuidado, pegue as extremidades dianteira e traseira das lâminas de barbear e levante para fora da matriz. O tecido do lado de fora das lâminas de barbear pode ser descartado.</li>
	<li>Lentamente, separe uma lâmina de barbear de cada vez das outras, tomando cuidado para não danificar as seções teciduais.</li>
	<li>Deslize cuidadosamente a seção de tecido para fora da lâmina de barbear e sobre a lâmina de vidro com a microspatula. No total, haverá seis seções cerebrais sagiais(Figura 1D).</li>
	<li>As 4 seções mais laterais terão DCN visível (caixa roxa, Figura 1D). Para isolar o DCN, segure a ponta de tubulação de 200 μL aparada perpendicularmente sobre o DCN e empurre para baixo através do tecido firmemente, balançando em todas as direções para dissecar totalmente o DCN do tecido circundante. Levante-se para cima para remover o DCN de forma limpa e confirme visualmente a presença do tecido na ponta.</li>
	<li>Coloque um dedo na parte superior da ponta e empurre para baixo, fazendo com que o tecido se avolua. Coloque a ponta no tubo de microfuça corretamente rotulado e certifique-se de que o ponche de tecido seja colocado na parte inferior do tubo. Repita 2.17 para as três seções restantes, colocando os socos DCN no mesmo tubo. Coloque o tubo em nitrogênio líquido para congelar. Representação do tamanho de cada soco na Figura 1E.</li>
	<li>Seções que tiveram DCN extraída se qualificam como hemisfério cerebelar. Afaste o resto do tecido cerebral ao redor do cerebelo nestas seções. Use fórceps contundentes e pegue suavemente essas seções de córtex cerebelares do hemisfério e coloque em seu respectivo tubo de microfuge. Congelamento de flash.</li>
	<li>Para as duas últimas seções vermais (caixa azul claro, Figure1D), afaste o tecido cerebral circundante deixando apenas o cerebelo. Usando uma lâmina de barbear, faça um corte separando os lobulos anteriores dos lobos posteriores. O corte deve ser logo após a formação do lobule 6 e não deve incluir lobule 10 (Figura 1F).</li>
	<li>Usando fórceps contundentes, coloque cuidadosamente as seções anteriores do córtex cerebelar e as seções posteriores do córtex cerebelar em seus respectivos tubos de microfuge e congele os flashes deixando os tubos em nitrogênio líquido por 5 minutos. Daqui vá para a extração do RNA, ou pode armazenar os tubos a -80 °C.</li>
</ol>3. Extração de RNA 
NOTA: Este protocolo é modificado a partir do Protocolo cold spring harbor para extração de RNA com TRIzol20. TRIzol solubiliza material biológico, possibilitando a extração de RNA.
<ol><li>Coloque os tubos de microfuge no gelo para evitar que o tecido descongele muito rapidamente, aplique 150 μL de TRIzol frio no tubo de microfuge. Homogeneize-se com um pilão esterilizado. Uma vez homogeneizado o tecido, encotime a solução para cima e para baixo para garantir que não haja tecido restante intacto. Cada vez mais quebre qualquer pequeno pedaço de tecido puxando-o para cima em uma seringa de insulina algumas vezes.</li>
	<li>Adicione mais 350 μL de TRIzol e pipet para cima e para baixo para misturar bem. Deixe descansar na temperatura da sala por 5 minutos.</li>
	<li>Adicione 150 μL de clorofórmio ao tubo e agite vigorosamente e deixe descansar por 2-3 minutos. O clorofórmio separa a solução de tecido homogeneizado em fases (RNA, DNA e proteína).</li>
	<li>Centrifugar a 12.000 x g, a 15°C, por 10 minutos. Certifique-se de que todos os tubos estão na mesma orientação.</li>
	<li>Remova cuidadosamente os tubos e coloque a temperatura da centrífuga para 4°C. Remova apenas a fase aquosa clara em um novo tubo (este é o RNA), cuidado para não interromper a interfase opaca (o DNA).  A fase mais baixa será vermelha e contém proteína. A solução restante nos tubos pode ser salva ou descartada.</li>
	<li>Adicione 100% de álcool isopropílico a uma proporção de 1:2 (se removido 200 ul de fase aquosa, adicione 100 μL de álcool isopropílico). Misture bem por pipetting para cima e para baixo. Deixe descansar em temperatura ambiente por 10 minutos. O álcool isopropílico precipita o RNA fora de solução.</li>
	<li>Centrifugar a 12.000 x g, a 4°C, por 10 minutos. Certifique-se de colocar todos os tubos na mesma orientação para facilitar a visualização da pelota. A pelota resultante será o RNA extraído.</li>
	<li>Remova cuidadosamente os tubos, remova o sobrenante com uma pipeta tomando cuidado para não interromper a pelota. A pelota é um pouco parecida com gel e será difícil de ver, mas deve ser capaz de estimar onde ela é baseada na orientação dos tubos na centrífuga.</li>
	<li>Depois de remover todo o supernascido, adicione 500 μL de 75% de etanol, vórtice brevemente, e centrífuga a 7500 x g, a 4°C, por 5 minutos. O etanol lava ainda mais a pelota.</li>
	<li>Remova o supernatante cuidadosamente, sem interromper a pelota. Deixe as tampas abertas para secar a amostra. Isso geralmente leva de 5 a 10 minutos, mas pode variar dependendo de quanto etanol foi deixado na pelota. Não seque demais.</li>
	<li>Uma vez seco, resuspenque a pelota em dNase água livre. Adicione 20 μL às amostras para DCN e 30 μL para todas as outras.</li>
	<li>Uma vez resuspended, as amostras podem ser armazenadas a -80 °C ou proceder para novos testes.</li>
</ol>4. Reação quantitativa da cadeia de polimerase em tempo real (RTqPCR)
<ol><li>Antes desta etapa será necessário dNase tratar o RNA para remover qualquer DNA genômico, e gerar cDNA utilizando iScript da BioRad. Certifique-se de normalizar a concentração de RNA antes de fazer o cDNA. Além disso, é importante otimizar primers para qPCR. Siga os métodos descritos aqui para completar esta etapa21. Breve descrição do qPCR abaixo.</li>
	<li>Os primers são todos comprados do IDT. As sequências dianteiras e inversas estão no mesmo tubo de amostra e armazenadas na concentração de 20x. Rps18 (gene de controle): Avanço – 5'-CCTGAGAAGTTCCAGCACAT-3' Reverso – 5'-ACACCACATGAGCATATCTCC-3' Parvalbumina (proteína de ligação de cálcio, células inibitórias): Atacante – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3' Reverso – '5-AGCGTCTTTTTCTTTAGCAG-3' KCNG4 (subunidade do canal de potássio): Atacante – 5'-CTGTCTCTCTCTGGTCAGTGA-3' Reverso – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3' Aldolase C (Zebrin II, expressa diferencialmente através do córtex cerebelar): Atacante – 5'-AGAGGACAAAGGGATAATGCTG-3' Reverso – 5'-TCAGTAGGGGTTGGC-3'</li>
	<li>qPCR condições foram as seguintes. Período de pré-incubação, 5 minutos, a 95°C. Período de amplificação, 50 ciclos: 10 minutos a 95°C, 10 minutos a 62°C e 10 minutos a 72°C. Período de curva de fusão, 5 segundos a 95°C, um minuto a 65°C, e definir a taxa de rampa para 0,07°C/segundo até a temperatura-alvo de 97°C. Em seguida, período de resfriamento por 10 minutos a 40°C.  Todas as reações qPCR foram realizadas em triplicado e a expressão genética foi analisada utilizando-se 2- ΔΔCt com Rps18 como um controle de carga para normalizar a expressão genética. Extrato cerebelar a granel foi usado como referência.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glia/neuron+ratio:+How+it+varies+uniformly+across+brain+structures+and+species+and+what+that+means+for+brain+physiology+and+evolution.">The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution.</a> Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).</li><li>Schmahmann, J. D., Caplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognition,+enotion,+and+the+cerebellum.">Cognition, enotion, and the cerebellum.</a> Brain. 129 (2), 290-292 (2006).</li><li>Badura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+cognitive+and+social+development+require+posterior+cerebellar+activity.">Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity.</a> eLife. 7, 36401 (2018).</li><li>Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+Transform+or+Multiple+Functionality?+Understanding+the+Contribution+of+the+Human+Cerebellum+across+Task+Domains.">Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains.</a> Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).</li><li>Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellum+and+Nonmotor+Function.">Cerebellum and Nonmotor Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).</li><li>King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+boundaries+in+the+human+cerebellum+revealed+by+a+multi-domain+task+battery.">Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery.</a> Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).</li><li>Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+the+human+cerebellum+estimated+by+intrinsic+functional+connectivity.">The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity.</a> Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).</li><li>Schmahmann, J. 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T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+Excitability+and+Parallel+Fiber+Synaptic+Properties+of+Zebrin-Positive+and+-Negative+Purkinje+Cells+in+Lobule+VIII+of+the+Mouse+Cerebellar+Slice.">Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513 (2019).</li><li>Manto, M., Oulad Ben Taib, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+nuclei:+Key+Roles+for+Strategically+Located+Structures.">Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures.</a> The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).</li><li>Driessen, T. M., Lee, P. 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Os autores não têm nada a revelar.

O método descrito aqui permite avaliar a expressão genética subjacente e os mecanismos moleculares dentro de quatro regiões cerebelares distintas – os núcleos cerebelares profundos (DCN), o córtex cerebelar anterior dos vermis (CCaV), o córtex cerebelar posterior dos vermis (CCPV) e o córtex cerebelar dos hemisférios (CCH). A capacidade de avaliar essas regiões separadamente ampliará nosso conhecimento da heterogeneidade de regiões cerebelares específicas e possivelmente lançará luz sobre sua contribuiç...

O cerebelo contém mais da metade dos neurônios do cérebro e tem sido historicamente referido como um centro de controle e equilíbrio motor no cérebro1. Mais recentemente, estudos demonstraram que o cerebelo desempenha um papel fundamental em várias outras funções, incluindo cognição, processamento de recompensas e afeto2,3,4,5.
O cerebelo tem anatomia bem descrita: a região do córtex é composta de granulo, Purkinje e camadas moleculares. As células de grânulo formam a camada celular do grânulo e enviam entrada através de fibras paralelas aos dendritos celulares Purkinje da camada molecular que também recebem entrada de fibras de escalada que se originaram na azeitona inferior. As células purkinje enviam projeções inibitórias para as células nos núcleos cerebelares profundos (DCN), que serve como a principal saída do cerebelo. A saída deste circuito cerebelar é ainda mais modulada pela atividade dos interneurônios inibitórios no córtex cerebelar, incluindo Golgi, stellate e células cesta4. Esta unidade funcional cerebelar é distribuída por todos os lobules do córtex cerebelar. Apesar deste circuito relativamente uniforme em todo o cerebelo, evidências da literatura de neuroimagem humana e estudos de pacientes indicam heterogeneidade funcional do cerebelo6,7.
O córtex cerebelar pode ser dividido em duas regiões principais: os vermis definidos pela linha média e os hemisférios laterais. Os vermis podem ser ainda divididos em lobulos anteriores e posteriores. Essas regiões distintas do cerebelo foram implicadas em contribuir para diferentes comportamentos. Padrões de atividade evocados por tarefas ou sem tarefas implicaram que as regiões anteriores dos vermis contribuem mais para a função motora, enquanto vermis posteriores contribuem mais para a cognição6,7. Os vermis também estão ligados ao afeto e às emoções, enquanto os hemisférios cerebelares contribuem para funções executivas, visuais-espaciais, linguísticas e outras funções mnemônicas8. Além disso, estudos anatômicos forneceram evidências de que regiões cerebelares funcionalmente distintas estão conectadas com diferentes regiões corticais9. O mapeamento de lesões-sintomas revelou que pacientes com derrames que afetam os lobulos anteriores (estendendo-se ao lobule VI) apresentaram pior desempenho em tarefas motoras finas, enquanto pacientes com danos em regiões posteriores do lobo e hemisférios apresentaram déficits cognitivos na ausência da síndrome motor cerebelar10. Por fim, a patologia cerebelar regional em doença indica que as regiões cerebelares funcionalmente distintas também são diferentemente suscetíveis à doença11,12.
Embora muito menos exploradas, evidências preliminares demonstram distintas assinaturas de expressão genética em regiões corticais cerebelares. A expressão celular purkinje de Zebrin II mostra a padronização específica da região nos vermímis de tal forma que há mais células positivas zebrin II nos lobulos posteriores e menos nos lobulos anteriores13. Isso também se correlaciona com a função fisiológica regionalmente distinta, pois as células Purkinje negativas zebrin II apresentam maior frequência de disparo tônico do que as células Purkinje que são Zebrin II positiva14.
Além do córtex cerebelar, o cerebelo inclui os núcleos cerebelares profundos (DCN) que servem como a saída primária para o cerebelo. Os núcleos são compostos pelos núcleos medial (MN), interposto (IN) e núcleos laterais (LN). Imagens funcionais e estudos de pacientes demonstraram que o DCN também participa de vários comportamentos15, mas pouquíssimos estudos examinam a mudança da expressão genética no DCN.
Os avanços nas técnicas moleculares permitiram avaliar a expressão genética regional no cérebro e descobriram a heterogeneidade em diferentes regiões cerebrais nos estados fisiológicos e dedoenças 16. Tais estudos implicam que o cerebelo é diferente de outras regiões cerebrais. Por exemplo, a proporção de neurônios para células gliais é invertida no cerebelo em comparação com outras regiões cerebrais1. Mesmo em condições fisiológicas normais, a expressão de genes proinflamatórios é regulada no cerebelo em comparação com as outras regiões cerebrais17. Técnicas moleculares também têm sido muito úteis na identificação dos caminhos que contribuem para a patogênese das doenças cerebelares. Por exemplo, o sequenciamento de RNA de todos os extratos cerebelares identificou genes alterados em um modelo de rato transgênico específico da célula Purkinje de ataxia spinocerebellar tipo 1 (SCA1) em comparação com seus controles de tipo selvagem. Tais evidências revelaram as principais vias moleculares subjacentes à patogênese nas células cerebelares Purkinje e ajudaram a identificar potenciais alvos terapêuticos18. No entanto, estudos recentes sugerem que há diferenças na vulnerabilidade às doenças nas regiões cerebelares11,12,19. Isso pode indicar que há mudanças-chave ocorrendo em regiões cerebelares distintas, que podem ser mascaradas ou não detectadas com extratos cerebelares inteiros. Assim, é necessário desenvolver técnicas que permitam aos pesquisadores examinar perfis moleculares em diferentes regiões cerebelares.
A técnica aqui proposta descreve um método reprodutível para dissecar quatro regiões distintas do cerebelo do camundongo, a fim de isolar o RNA dessas regiões e explorar diferenças regionais na expressão genética. O esquema do cerebelo do rato na Figura 1A destaca os vermísis em azul, e hemisférios em amarelo. Especificamente, esta técnica permite isolar quatro regiões: núcleos cerebelares profundos (DCN) (caixas pontilhadas vermelhas na Figura 1A), o córtex cerebelar de vermis anterior (CCaV) (azul escuro em Figura 1A), o córtex cerebelar dos vermis posteriores (CCpV) (azul claro na Figura 1A), e o córtex cerebelar dos hemisférios (CCH) (amarelo na Figura 1A). Ao avaliar a expressão genética dessas regiões separadamente, será possível investigar mecanismos moleculares subjacentes a funções discretas dessas diferentes regiões, bem como potenciais diferenças em sua vulnerabilidade na doença.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1.5 Microcentrifuge tubes</td>
			<td >ThermoScietific</td>
			<td >3456</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100% Isopropyl Alcohol</td>
			<td >VWR Life sciences</td>
			<td >1106C361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >200 ul Pipet tips</td>
			<td >GeneMate</td>
			<td >P-1237-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adult Mouse Brain Matrix Sagittal</td>
			<td >Kent Scientific Corporation</td>
			<td >RBMA-200S</td>
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			<td >Blunt forceps</td>
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			<td >Glass Slide (for electrophoresis)</td>
			<td >BIORAD</td>
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			<td >Homogenizer</td>
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			<td >Insulin Syringe (.5ml)</td>
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			<td >iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR</td>
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			<td >Needle Nose forceps</td>
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			<td >Petri Dish</td>
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			<td >Primetime Primer for Aldolase C</td>
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			<td >Mm.PT.58&#62;43415246</td>
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			<td >Primetime Primer for Kcng4</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.56a.9448518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer for Parvalbumin</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58.7596729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer Rps18&#160;</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58.12109666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Edge Rzor Blades</td>
			<td >Personna GEM</td>
			<td ></td>
			<td></td>
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		<tr >
			<td >Sterile, sigle-use pestles</td>
			<td >FisherScientific</td>
			<td >12141364</td>
			<td></td>
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		<tr >
			<td >TRIzol Reagent</td>
			<td >Ambion by Life technologies</td>
			<td >15596018</td>
			<td></td>
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			<td >Vascular Scissors</td>
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			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cerebellar regional dissection for molecular analysis

O cerebelo desempenha um papel importante em várias funções-chave, incluindo controle de movimento, equilíbrio, cognição, recompensa e afeto. Estudos de imagem indicam que regiões cerebelares distintas contribuem para essas diferentes funções. Estudos moleculares que examinam as diferenças cerebelares regionais estão defasando, pois são feitos principalmente em extratos cerebelares inteiros, mascarando assim quaisquer distinções em regiões cerebelares específicas. Aqui descrevemos uma técnica para dissecar de forma reproduzivelmente e rápida quatro regiões cerebelares diferentes: os núcleos cerebelares profundos (DCN), o córtex cerebelar vermal anterior e posterior, e o córtex cerebelar dos hemisférios. Dissecar essas regiões distintas permite a exploração de mecanismos moleculares que possam fundamentar suas contribuições únicas para o equilíbrio, o movimento, o afeto e a cognição. Esta técnica também pode ser usada para explorar diferenças na suscetibilidade patológica dessas regiões específicas em vários modelos de doenças de camundongos.

Para esses experimentos, foram utilizados quatro camundongos fêmeas de onze semanas de idade, tipo C57/Black6. Um rato foi usado para realizar uma dissecção cerebelar completa que é referida como "cerebelo a granel" e permitiu a comparação dos níveis de RNA em regiões dissecadas a uma dissecção completa. Os outros três camundongos foram usados para conduzir a dissecção cerebelar descrita neste protocolo. O uso de três camundongos torna possível garantir que as tendências d...

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Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

Diferentes regiões cerebelares foram implicadas a desempenhar um papel em distintas saídas comportamentais, mas os mecanismos moleculares subjacentes permanecem desconhecidos. Este trabalho descreve um método para dissecar de forma reproduzivelmente e rápida o córtex cerebelar dos hemisférios, regiões anteriores e posteriores dos vermímis, e os núcleos cerebelares profundos, a fim de sondar as diferenças moleculares isolando o RNA e testando diferenças na expressão genética.

Dissecção Regional Cerebelr para Análise Molecular

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.8K visualizações.  University of Minnesota. Diferentes regiões cerebelares foram implicadas a desempenhar um papel em distintas saídas comportamentais, mas os mecanismos moleculares subjacentes permanecem desconhecidos. Este trabalho descreve um método para dissecar de forma reproduzivelmente e rápida o córtex cerebelar dos hemisférios, regiões anteriores e posteriores dos vermímis, e os núcleos cerebelares profundos, a fim de sondar as diferenças moleculares isolando o RNA e testando diferenças na expre...

Vídeo: Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously published phenotype assessments in several disease models, including spinocerebellar ataxias, Huntington s disease and spinobulbar muscular atrophy. Measures include hind limb clasping, ledge test, gait and kyphosis. Each measure is recorded on a scale of 0-3, with a combined total of 0-12 for all four measures. The results effectively discriminate between affected and non-affected individuals, while also quantifying the temporal progression of neurodegenerative disease phenotypes. Measures may be analyzed individually or combined into a composite phenotype score for greater statistical power. The ideal combination of the four described measures will depend upon the disorder in question. We present an example of the protocol used to assess disease severity in a transgenic mouse model of spinocerebellar ataxia type 7 (SCA7).
Albert R. La Spada and Gwenn A. Garden contributed to this manuscript equally.

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebellar ataxia. Measures include hind limb clasping, ledge test, gait and kyphosis. This protocol effectively discriminates between affected and non-affected individuals, and detects the progression of affected individuals over time.

Um sistema simples de pontuação Composite Fenótipo para avaliar modelos de ratos de ataxia cerebelar

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously ...

Neurociência

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

Organotípicas Culturas Cerebelar: Desafios Apoptotic e Detecção

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

Único Drosophila Dissection omatídeo e Imagem

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Análise quantitativa de Reposição da vesícula sináptica Piscina em Cultured neurônios granulares do cerebelo usando Dyes FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualização e manipulação genética de dendritos e espinhas no córtex cerebral e hipocampo do rato usando<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Dissecção, Cultura, Análise e de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tecido embrionário da retina

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulação genética de Cerebelar Granule Neurônios<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudar Neuronal Morfologia e Migração

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Dissecção do Músculo Transversus Abdominis para Análise de Junção Neuromuscular de Montagem Integral

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Laser Nanocirurgia de cerebelo axônios<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Um de uma etapa simples protocolo de dissecação para Whole mount-Preparação do Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...