We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.

1. Preparação de Células e Reagentes <ol><li> No dia antes do ensaio, placa de células hospedeiras apropriadas para o vírus em questão (Tabela 1 e 2) em 90 - 100% de confluência. </li><li> Preparar a solução de fixação de 10% de formaldeído em dH 2 O. No exemplo, misturar 5,56 ml de estoque 36% de formaldeído, com 14,44 mL de H 2 O destilada (dH2O). NOTA: Use as práticas de manuseio seguro adequado e ventilação quando se utiliza formaldeído. </li><li> Prepare a mancha violeta de cristal: 1% de cristal violeta (CV) em etanol a 20% e dH 2 O. </li><li> Prepare a mídia de placa 2x (tipo de célula dependente na concentração 2x; ver Tabela 2). Filtrar através de um filtro de 0,2 um, se quaisquer reagentes não são estéreis. </li><li> Preparação de sobreposições de imobilização (Tabela 3) <ol><li> Para sobreposições de líquidos, fazer uma solução estéril de 2,4% de Avicel em dH 2 O. Para evitar aglomeração, adicionar o pó a um balão contendo água tha mistura é rapidamente com uma barra de agitação, verter em Avicel lentamente e agita-se rapidamente à temperatura ambiente (RT). Quando a solução for muito viscoso para uma barra de agitação para homogeneizar, mudar para um shaker frasco para&gt; 30 min com agitação pesado para garantir uma homogeneização. NOTA: As soluções de reserva pode ser feita em concentrações mais baixas, mas as soluções podem separar-se e terá de ser remisturado para assegurar a homogeneização. As soluções de trabalho de Avicel pode ser utilizado variando 0,6-3%. </li><li> Após homogeneização, a solução autoclave selado e armazenar à temperatura ambiente. </li><li> Para agarose e carboximetilcelulose (CMC) sobreposições, preparar uma solução de reserva em dH2O de 2% de CMC ou 0,6% de agarose. Misture com uma barra de agitação e autoclave ou forno de microondas para trazer a solução. </li></ol></li></ol> 2. As diluições e Infecções <ol><li> No dia após o plaqueamento, verificar visualmente a confluência e viabilidade das células antes de se iniciar o ensaio. Certifique-se de um padrão celular morfologiand uma monocamada confluente ~ 90% está presente. </li><li> Realizar uma diluição em série de dez vezes das amostras infecciosas. Usar o meio de crescimento celular para a propagação viral como diluente (Tabela 2). Variar o número de diluições necessárias com base na titulação esperada do vírus em causa, e sempre usar uma amostra de controlo não infectado, independentemente, para assegurar a viabilidade celular e ajuda na identificação de placas. </li><li> A partir das diluições em série, infectar as células durante 45 min a 1 h (Tabela 1). Utilizar um volume suficiente de inoculo para cobrir as células, mantendo o volume tão baixo quanto possível para maximizar o contacto com a monocamada viral (Tabela 4). Placas rochosas suavemente a cada 20 min para garantir uma cobertura uniforme e evitar a monocamada celular de secagem. </li><li> Após a infecção, sobrepor um volume apropriado de meio de imobilizar directamente para os inóculos no poço (Tabela 2) usando uma mistura 1: 1 de 2 x media de placa e o immobilizing sobreposição de escolha (CMC, agarose ou Avicel). Agite suavemente para misturar. <ol><li> Para sobreposições de líquidos, misture 1: 1 com aquecido mídia chapa 2x e 1,2-2,4% da RT Avicel para obter uma solução de trabalho de 0,6-1,2% Avicel meio de cobertura. </li><li> Para obter uma camada de agarose, utilizar uma mistura 1: 1 de meios de placa 2x aquecido e uma solução de estoque de 0,6% de agarose aquecido, em lugar de um C num banho de água a 56 ° durante 30 minutos para equilibrar a temperatura a obtenção de uma concentração final de agarose / sobreposição de 0,3 %. </li><li> Para CMC, preparar uma solução stock de 2% e tratar como descrito para a sobrecamada de agarose. </li><li> Ao aplicar-se uma camada superior ao monocamada, sempre equilibrar agarose quente ou CMC numa água de 56 ° C para evitar danos na monocamada. Certifique-se de que a solução é quente, mas não quente ao toque para evitar a morte celular e reduzidos os títulos virais. A maioria das camadas de agarose vai começar a solidificar abaixo de 42 ° C, trabalhar rapidamente e / ou preparar pequenos lotes para evitar a solidificação durante o manuseio. </li></ol></li><li> Após a adição da sobreposição, incubar as placas para produzir chapas que são claramente distintos contáveis. A formação de placa pode demorar de 2-14 dias, dependendo do vírus a ser analisada, Tabela 1. NOTA: Uma vez que as placas sobrepostas líquidos são colocados na incubadora, não movê-los. Movimento das sobreposições de líquidos durante o período de incubação resultará em placas borratadas. Agarose e CMC sobreposições são semi-sólidas e podem ser movidos ou verificada periodicamente sob um microscópio de luz para monitorar o desenvolvimento da placa. </li></ol> 3. Fixação e coloração de células <ol><li> Para fixar as células, deitar fora ou aspirar o Avicel sobreposição, e fixar as células usando a solução de formaldeído a 10% durante 30 minutos a durante a noite (&lt;1 ml por poço para uma placa de 6 poços). <ol><li> Para agarose ou CMC, adicionar directamente a solução de formaldeído à sobreposição durante 1 hora a durante a noite. NOTA: As amostras podem ser mantidas por longos períodos de tempo no fixador desde que faznão evaporar e secar como isto pode falsear a monocamada. </li></ol></li><li> Antes da coloração e após a sua fixação, descartar o formaldeído e remover os bujões semi-sólidas para a agarose e CMC quer com água corrente ou manualmente com uma espátula. Lavar as placas Avicel com água para remover o residual de sobreposição / fixador antes da coloração. </li><li> Para a coloração, cobrir as células com uma quantidade mínima de solução de violeta de cristal durante ~ 15 min. Placas de rocha se necessário para garantir uma cobertura uniforme. </li><li> Delicadamente, lave a mancha violeta de cristal com água. Uma vez fixados, corados e seco, placas de loja por tempo indeterminado para análise futura. </li></ol> 4. Determinar virais Títulos <ol><li> Contar as placas em cada poço, considerando a média de todas as repetições técnicos da mesma diluição. Para grandes formatos de placas, poços de desconto com menos de 5 ou maior do que 100 placas. Tome nota do tamanho e morfologia de placas. O controle negativo deve ter uma monocamada uniforme epode ser usado como um controlo de referência. </li><li> Determinar o título viral da amostra stock tendo o número médio de placas para uma diluição e o inverso do factor de diluição total. </li></ol><img alt="Equação 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52065/52065eq1.jpg" width="300" /> NOTA: Como um exemplo, 30 e 32 para as placas foram contadas repetições do 1 x 10 -7 diluição [31 (média) / 10 -7 (diluição) x 0,4 ml (inoculo)] iria originar um título de 7,75 x 10 8 pfu / ml.

<ol>
	<li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li><li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+problems+of+animal+virology+as+studied+by+the+plaque+technique.">Some problems of animal virology as studied by the plaque technique.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).</li><li>Hartley, J. W., Rowe, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+cytopathic+and+plaque+assays+for+mouse+hepatitis+viruses.">Tissue culture cytopathic and plaque assays for mouse hepatitis viruses.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. Soc. Exp. Biol. Med. N. Y. 113, 403-406 (1963).</li><li>Juarez, D., Long, K. C., Aguilar, P., Kochel, T. J., Halsey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+plaque+assay+methods+for+alphaviruses.">Assessment of plaque assay methods for alphaviruses.</a> J. Virol. Methods. 187, 185-189 (2013).</li><li>Shurtleff, A., Keuhne, A., Biggins, J., Keeney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+alternative+overlays+in+plaque+assays.">Use of alternative overlays in plaque assays.</a> , (2011).</li><li>Shurtleff, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+the+Filovirus+Plaque+Assay+for+Use+in+Preclinical+Studies.">Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies.</a> Viruses. 4, 3511-3530 (2012).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virol. J. 3, 63 (2006).</li><li>Klebe, R. J., Harriss, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technically+simple+&#8216;non-lethal&#8217;+vital+staining+procedure+for+viral+plaque+and+cell+transformation+assays.">A technically simple &#8216;non-lethal&#8217; vital staining procedure for viral plaque and cell transformation assays.</a> Arch. Virol. 81, 359-362 (1984).</li><li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells.">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells.</a> Appl. Microbiol. 16, 588-594 (1968).</li><li>Abiko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+Human+Metapneumovirus+Detected+by+Use+of+the+Vero+E6+Cell+Line+in+Isolates+Collected+in+Yamagata,+Japan,+in+2004+and+2005.">Outbreak of Human Metapneumovirus Detected by Use of the Vero E6 Cell Line in Isolates Collected in Yamagata, Japan, in 2004 and 2005.</a> J. Clin. Microbiol. 45, 1912-1919 (2004).</li><li>Baer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+DNA+damage+signaling+upon+Rift+Valley+fever+virus+infection+results+in+cell+cycle+arrest+and+increased+viral+replication.">Induction of DNA damage signaling upon Rift Valley fever virus infection results in cell cycle arrest and increased viral replication.</a> J. Biol. Chem. 287, 7399-7410 (2012).</li><li>Austin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Activation+following+Rift+Valley+Fever+Virus+Infection+Contributes+to+Cell+Death+and+Viral+Production.">p53 Activation following Rift Valley Fever Virus Infection Contributes to Cell Death and Viral Production.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>B&#246;ttcher-Friebertsh&#228;user, E., Stein, D. A., Klenk, H. -. D., Garten, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+influenza+virus+infection+in+human+airway+cell+cultures+by+an+antisense+peptide-conjugated+morpholino+oligomer+targeting+the+hemagglutinin-activating+protease+TMPRSS2.">Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2.</a> J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).</li><li>Youil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+influenza+virus+replication+in+Vero+and+MDCK+cell+lines.">Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines.</a> J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).</li><li>Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+assay+and+primary+isolation+of+influenza+a+viruses+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells+(MDCK)+in+the+presence+of+trypsin.">Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin.</a> Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).</li></ol>

The authors have nothing to disclose and no competing or financial interests in the protocol or products described.

O factor mais crítico para um ensaio de placa de sucesso encontra-se na optimização do protocolo para a cultura viral particular em questão como condições podem variar significativamente. Pontos-chave a ter em conta são: sediar compatibilidade celular com o vírus em questão, as condições de crescimento virais apropriadas, faixas de diluição suficientes, a fim de diferenciar claramente placas e seleção sobreposição correta e coloração para as células e os vírus em questão. Enquanto VEEV e RVFV tanto crescer sob condições muito semelhantes, utilizando muitos dos mesmos tipos de células hospedeiras, as diferenças na cinética de crescimento e morfologia de placas variar significativamente. Ao usar células Vero para ensaios de placa, que têm sido usados ​​tradicionalmente como uma linha de células de propagação e indicador de vírus da febre hemorrágica e alphaviruses, VEEV tipicamente cresce para títulos mais altos do que RVFV e demonstra um aumento da cinética de replicação, o desenvolvimento de placas uniformes grandes às 48 hpi 4, 10-12. Em contraste com VEEV, RVFV requer 72 hpi e demonstra placas que são tipicamente muito menor e variável em tamanho. Em oposição a RVFV e VEEV, o vírus da gripe é altamente específico da célula hospedeira e pode ser difícil de propagar através de cultura de tecidos. Para o vírus da gripe, a entrada viral e fusão é normalmente iniciado pela ligação do receptor da superfície celular com a glicoproteína hamagglutinin viral (HA), que medeia a entrada na célula-alvo através da ligação com o receptor da superfície ácido siálico-α da célula hospedeira. HA trimérico é uma glicoproteína que está presente no envelope da membrana de todos os vírus Influenza e requer clivagem para a subunidades HA1 e HA2 por uma protease célula hospedeira específica. Para complicar ainda mais a questão, estes sítios de clivagem muitas vezes pode variar entre 13 cepas virais. À medida que a expressão de proteases capazes de clivar HA é restrita a tecidos específicos, proteases ARe frequentemente adicionadas ao meio de cultura de células, a fim de facilitar a fusão viral e a entrada na célula hospedeira seleccionada 13. TPCK-tripsina é um exemplo de uma protease vulgarmente utilizado que é usado em cultura de células MDCK com ambos e células Vero: facilitar a replicação multi-ciclo (na ausência de qualquer soro de inactivação da tripsina) por meio da activação proteolítica de HA viral 14,15. Como demonstrado neste estudo e outros, as diferenças no ciclo de vida viral pode influenciar seleções de sobreposição, formatos de placas, e tempos de coleta, com variações significativas entre as diferentes classes e espécies de vírus. Em nosso estudo, camadas de agarose demonstrou placas claras em títulos mais elevados do que qualquer CMC ou sobreposições de líquidos, tanto para RVFV e vírus Influenza B, reforçando sua utilidade entre uma ampla gama de vírus e tipos de células. Usando uma baixa concentração final de agarose muito auxiliado na remoção dos plugues sólidos e coloração simplificada. CMC global mostrou a poorest eficácia como uma cobertura para todos os três vírus testados e muito pequenas e indistintas placas produzidas para o vírus da Influenza B. Embora CMC global mostrou as características menos desejáveis, a sua utilização em rápido crescimento e extremamente virulentas vírus poderia revelar-se vantajoso, como o fez aparecer para reduzir o tamanho da placa com apenas uma redução mínima na titulação. A sobreposição de líquido provou ser o mais versátil na medida em que era extremamente simples de preparar, maior facilidade de utilização, e a agarose foi comparável em todos os vírus seleccionados. Num formato de placa de maior rendimento de 96 poços, aplicação e remoção não foi inibida devido à solidificação como com sobreposições tradicionais, e proporcionaram resultados precisos e consistentes. A consideração ao usar sobreposições de líquidos reside na coloração opaca e incapacidade de controlar a formação de placas como as placas não podem ser movidos até o ponto de coleta, limitando essa adaptação ao vírus com cinética de replicação anteriormente caracterizados. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Pequenas modificações nas condições de ensaio de placa pode alterar significativamente os resultados, bem como a avaliação e desempenho de qualquer novo sistema ou técnica é sempre garantido. Enquanto um protocolo de ensaio de placa otimizada e padronizada não existe para cada situação, o nosso relatório demonstram a versatilidade e facilidade de uso em tradicional, bem como sobreposições de líquidos para novos ensaios de placa, proporcionando um fundo suficiente para mais modificações do usuário.

O isolamento precisas e quantificação das amostras virais viáveis ​​tem sido consistentemente um objetivo a investigação em curso em virologia. Não era até o advento do ensaio de placa em 1952 que um meio para calcular quantitativamente e qualitativamente os títulos virais animais foi desenvolvido pela primeira vez 1,2. Esta técnica foi adaptada e modificada a partir de ensaios de fagos, os quais foram anteriormente utilizados para calcular os títulos de banco de bacteriófagos em planta biologia 1,2 primeiro. Enquanto meios alternativos para quantificação viral desde então têm sido desenvolvidos e adaptados, como imunoensaios, fluorescência e microscopia eletrônica de transmissão, ajustável de detecção de pulso resistiva (TRPS), citometria de fluxo, sistemas de repórter recombinantes, e reversa quantitativa reação em cadeia da polimerase com transcrição (qRT-PCR) , esses métodos não conseguem identificar e quantificar replicação virons competentes 1,3. Embora os avanços nas tecnologias e técnicas de continuar a aperfeiçoar e alterar a paisagem; PLAQUE os ensaios continuam a representar o padrão ouro na determinação das concentrações virais para virons líticas infecciosas 1,4. Durante um ensaio de placa, uma monocamada confluente de células hospedeiras está infectado com um vírus lítico de uma concentração desconhecida que foi diluída em série para uma gama contáveis, tipicamente entre 5-100 viriões. As monocamadas infectadas são então coberto com um meio de cobertura de imobilização para impedir a infecção viral a partir de indiscriminadamente, quer através de difusão do fluxo de convecção mecânica ou do meio líquido durante a propagação viral. Apesar da sobreposição sólidas ou semi-sólidas, tais como agarose, metilcelulose ou carboximetilcelulose (CMC) têm sido tradicionalmente utilizados, sobreposições de líquidos tornaram-se cada vez mais uma alternativa atraente, com o desenvolvimento de novas folhas de prova de líquidos, tais como Avicel 5- 7. Ensaios de placa utilizando líquido contra sobreposições tradicionais têm várias vantagens como a sobreposição pode ser applied à temperatura ambiente, e a aplicação e remoção é significativamente mais fácil. Como sobreposições líquidos não requerem aquecimento, vírus lábil delicados e de calor também pode revelar-se mais fácil de placa. Após a infecção inicial e aplicação da sobreposição imobilizante, placas individuais, ou zonas de morte celular, irá começar a desenvolver infecção como a replicação viral e são constrangidas para a monocamada circundante. As células infectadas irão continuar o ciclo de replicação de lise-infecção, mais de propagação da infecção, resultando em placas cada vez mais distintos e separados. Dependendo da cinética de crescimento viral e célula hospedeira utilizada, uma placa visível forma, normalmente, dentro de 2-14 dias. As monocamadas celulares podem então ser contadas com um microscópio de campo brilhante padrão, ou mais tipicamente fixo e contrastadas pelo vermelho ou cristal violenta neutro, a fim de identificar prontamente placas a olho nu. Há uma grande variedade de contra placa manchas disponíveis, cada oferta their vantagens e desvantagens específicas. O violeta de cristal é tipicamente adicionado na altura da recolha e após a fixação / remoção da cobertura, proporcionando um contador de mancha rápida e distinta, que permite a identificação de placas muito pequenas quando morfologia mista está presente. Vermelho neutro tem a vantagem de aplicação antecipada e constante contato com a sobreposição, permitindo o monitoramento ao vivo de desenvolver a formação de placas, o que é particularmente útil quando se trabalha com um desconhecido cinética de vírus ou de replicação. Nós descobrimos que a coloração no entanto não é geralmente tão distinta quando utilizando vermelho neutro. 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil (MTT) oferece diversas vantagens, como as manchas de cor amarelo vivo corantes células placas azuis escuras e virais podem ser contados, sem remoção da sobreposição quanto com vermelho neutro. O alto contraste entre as células vivas e mortas oferecidas pela MTT também permite a detecção de pequenas placas em uma hora mais cedo a infecção ponto pós, Apesar de armazenamento ainda exigiria a remoção da cobertura 8. Como violeta de cristal pode ser feita simplesmente em uma solução de água e álcool, e proporciona um elevado grau de sensibilidade para a morfologia da placa mista, optámos-lo como um contador de manchas preferido e simplificado para o protocolo como demonstrado que estamos utilizando várias famílias de bem vírus caracterizados. Após fixação e coloração da monocamada celular infectada, as placas são contadas no fim titule banco de amostras virais em termos de unidades formadoras de placas (pfu) por mililitro. Uma gota de registo deve ser observado entre diluições em série e, dependendo do tamanho da placa, entre as placas foram contadas 5-100, com um controlo negativo utilizado como uma referência. Amostras estatisticamente irá variar em 10% para cada 100 placas contados quando se compara amostra replica 3. A vantagem de usar ensaios de placas para determinar os títulos virais reside na sua capacidade para quantificar o número real de partículas virais infecciosas within a amostra. Como múltiplos viriões poderia potencialmente infectar uma célula única, a terminologia de unidades contra virons é utilizado durante as titulações em placa 1,2. Morfologia da placa pode variar drasticamente sob diferentes condições de crescimento e entre espécies virais. Tamanho da placa, a clareza, a definição das fronteiras, e distribuição devem todos ser notado como eles podem fornecer informações valiosas sobre o crescimento e fatores de virulência de vírus em questão. Os princípios básicos da placa de ensaio também pode ser adaptado e modificado num número de maneiras diferentes, tais como no uso de ensaios de formação de foco (FFAs). FFAs não dependem de lise celular e de contraste para detectar a formação de placa, mas sim empregar técnicas para detectar diretamente as proteínas virais intracelulares através de anticorpos marcados imunomarcação. O aumento da sensibilidade, diminuição dos tempos de incubação após a infecção, e mais importante a capacidade para quantificar os vírus não-líticos são todos distintosvantagens quando se emprega FFAs. Embora amplamente utilizados, os factores críticos que limitam FFAs em comparação com um ensaio de placa tradicional reside na necessidade de anticorpos apropriados e a capacidade de somente sonda para subunidades de proteínas virais contra viriões infecciosos 4 reais. Para o propósito deste estudo, vamos limitar nossa discussão para ensaios de placa clássicos e descrever o uso de sobreposições de sólidos e semi-sólidos tradicionais (agarose e CMC), juntamente com novas sobreposições de celulose líquido microcristalinas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:127px;">Company</td>
			<td style="width:129px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">6-well CellStar plate for tissue culture</td>
			<td style="width:127px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:129px;">658 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">12-well CellStar plate for tissue culture</td>
			<td style="width:127px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:129px;">665 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">96-well CellStar plate for tissue culture</td>
			<td style="width:127px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:129px;">655 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">96-2ml deep well plate</td>
			<td style="width:127px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:129px;">C15046314</td>
			<td>For serial dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">DMEM</td>
			<td style="width:127px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:129px;">112 013 101</td>
			<td>Cell Media/Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">2X EMEM for plaques</td>
			<td style="width:127px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:129px;">115 073 101</td>
			<td>Warm to 37 oC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">MEM 100X&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Cellgro</td>
			<td style="width:129px;">25 025 Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sodium Pyruvate&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Cellgro</td>
			<td style="width:129px;">25 000 Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:129px;">15140 122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:129px;">25030 081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:269px;">HyClone FBS&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:129px;">SH30910.03</td>
			<td>Heat inactivate before use at 62 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">A7030-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Trypsin TPCK</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">T1426-50mg</td>
			<td>Make aliquots/Avoid freeze thawing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HEPES&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:129px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DEAE-Dextran</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">D9885-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Crystal Violet</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">C3886-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Formaldehyde Solution</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">F8775-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Ethanol denatured Reagent Grade</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td>362808-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Avicel RC-591 NF</td>
			<td style="width:127px;">FMC BioPolymer USA</td>
			<td style="width:129px;">RC-591 NF</td>
			<td>Shake vigorously when reconsitiuting&#160; for &#62;30 min to homogenize</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">UltraPure Agarose&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">16500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">C4888</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems

Ensaios de placa continuam sendo um dos métodos mais precisos para a quantificação direta de virons infecciosas e substâncias antivirais através da contagem de placas discretas (unidades infecciosas e zonas mortas celulares) em cultura de células. Aqui demonstramos como realizar um ensaio básico placa, e como sobreposições e técnicas diferentes podem afetar a formação de placas e de produção. Tipicamente substratos sólidos ou semi-sólidos de sobreposição, tais como agarose ou carboximetil celulose, têm sido utilizados para restringir propagação viral, prevenindo a infecção indiscriminada através do meio de crescimento líquido. Sobreposições imobilizadas restringir a infecção celular para a monocamada imediatamente circundante, permitindo a formação de focos contáveis ​​discreta e subsequente formação de placa. Para superar as dificuldades inerentes ao uso de sobreposições tradicionais, uma sobreposição de líquido romance utilizando celulose microcristalina e carboximetilcelulose de sódio tem sido cada vez mais utilizado como um substituto no padrãoensaio de placas. Ensaios de placas de sobreposição líquidos podem ser prontamente realizada em qualquer padrão 6 ou 12 formatos de placas, bem como por técnicas tradicionais e não requerem equipamento especial. Devido ao seu estado líquido e subsequente facilidade de aplicação e remoção, formatos de placas de microcultura podem, alternativamente, ser utilizado como uma alternativa de transferência rápida, precisa e de alta para titulações virais maior escala. O uso de um polímero líquido viscoso aquecido não oferece a oportunidade de agilizar o trabalho, conserva reagentes, espaço incubadora, e aumenta a segurança operacional quando usado em laboratórios de contenção tradicionais ou altos como nenhum aquecimento do reagente ou das suas obras são necessárias. Sobreposições de líquidos podem também revelar-se mais sensível do que as sobreposições tradicionais para determinados calor vírus lábil.

A capacidade dos ensaios de placas para avaliar com precisão os títulos virais depende de numerosos factores: selecção da célula hospedeira apropriada, meios apropriados e condições de crescimento para a viabilidade celular e viral, a propagação viral imobilizada, e uma determinação exacta do período de incubação viral para permitir um tempo adequado para distinta e formação de placas contáveis. Para este estudo, os vírus de três famílias representativas foram escolhidas para demonstrar as diferenças de: seleção de sobreposição, períodos de incubação e morfologia da placa através de diferentes tipos de amostras. Encefalite Equina Venezuelana (VEEV) foi seleccionada como um modelo viral (+) ssRNA, o que pode causar doença significativa em equinos e humanos e representa a família Togaviridae. Influenza B tensão Taiwan, um segmentado (-) vírus ssRNA infectando principalmente os seres humanos, representa a família Orthomyxoviridae. Rift Valley vírus da febre (RVFV), a (-) ssRNA artrópode nascido vírus infectando principalmente artrópodes,ruminantes e humanos, foi escolhido como representante da família Bunyaviridae. Para RVFV (Figura 1), os títulos foram determinados a partir de uma solução de estoque de uma estirpe viva atenuada recombinante MP12 de RVFV em um formato de placa de 12 poços utilizando CMC, de agarose, ou sobreposições Avicel que foram incubadas lado-a-lado para a infecção de 72 h pós (IPH). Uma placa representativa mostrando diluições que variam de 10 -4 a 10 -7 pode ser visto no Painel A. As placas utilizando a CMC e camadas de agarose mostrou placas pequenas, claras e distintas com uma borda circular bem definido. As placas com uma sobreposição de líquido eram ligeiramente mais abundante e maior em comparação a agarose e as placas de CMC, e proporcionada uma fronteira menos distintas. Os títulos virais foram comparados no Painel B com todas as sobreposições de realização comparavelmente. A fim de obter uma comparação visual mais clara entre sobreposições para MP12, juntamente com uma amostra maior para determinar reproduçõeslidade, uma placa de 6 poços foi também testadas em triplicado (Figura 2). No formato de placa de 6 poços, a utilização de uma sobreposição de placas CMC apresentaram menores do que quer camadas de agarose ou líquidos, que eram comparáveis ​​em tamanho para o outro. Apesar de os títulos virais foram semelhantes entre todos os três sobreposições (Painel D), placas formadas em camadas de agarose e liquidas mostrou mais fáceis de contar, devido ao seu tamanho aumentado. Em contraste com RVFV, os títulos de VEEV e morfologia da placa entre as diferentes sobreposições variaram significativamente (Figura 3A). As placas formadas nas sobreposições CMC demonstraram uma morfologia clara e distinta quando se utiliza um formato de placa de 12, à custa do tamanho da placa e sensibilidade (Painel B). Em contraste com a CMC, a utilização de líquidos de agarose e sobreposições resultou em placas significativamente maiores, indicando menor inibição viral e aumento da sensibilidade à replicação VEEV. Isto foi confirmado anteriormente, quando apenas comparando agarose contra CMC em apaper publicado por Juarez et al. 4. Enquanto agarose e líquidos produzidos sobreposições placas maiores do CMC, as placas tinham fronteiras mal definidas e eram difíceis de contar em um formato bem 12, com sobreposições de líquidos que fornecem a maior difusão fronteira. Quando as placas foram testadas em placas de 6 poços (Figura 4), ​​o maior 6 formato bem negada a emissão de placas abertamente grandes que eram difíceis de diferenciar, no formato de 12 poços, com agarose e sobreposições líquidos provando superior às sobreposições CMC em termos de definição de placa bacteriana e sensibilidade (Figura 4D). Em comparação com RVFV ou VEEV, influenza oferece vários desafios quando da formação das placas, como a exigência de uma protease externa. A sensibilidade do vírus da gripe de diferentes selecções de sobreposição, também tem sido bem documentada no passado como alterações significativas foram notadas quando as modificações como menores, tal como as marcas de agarose ser diferentes têmen usado 9. Curiosamente para a estirpe de gripe B Taiwan, a utilização de CMC como uma sobreposição resultou em placas marcadamente menores que eram difíceis de contar e provou difícil de marcar de forma fiável (Figura 5A). A utilização de uma sobrecamada de agarose que proporcionaram os melhores placas (Painel C), e resultou em uma mancha mais escura do fundo (provavelmente devido ao aumento da viabilidade monocamada), e mostrou placas mais claras e nítidas em comparação directa com a utilização do líquido de sobreposição (Painel B ). Uma vantagem distinta de polímeros líquidos e sólidos mais de sobreposições semi-sólidas, tais como agarose e CMC, reside na facilidade de remoção e de aplicação. Sobreposições de semi-sólidos requerem aquecimento e solidificação pode revelar-se problemática quando o manuseio e remoção. A fim de aproveitar essas vantagens e para determinar a viabilidade de utilizar Avicel de uma forma de alto rendimento para RVFV, um formato de placa de 96 poços foi julgado em diferentes concentrati sobreposiçãoons (Figura 6). Para RVFV MP-12, diluições foram realizadas em quadruplicado em ambos os 0,6 e 1,2% concentrações finais de Avicel. Recobrimento e remoção provou simples, sem diferenças aparentes entre as repetições ou entre as concentrações observadas, demonstrando um alto grau de reprodutibilidade. Quando conseguir, as placas eram distintos e contáveis ​​a olho nu, o que demonstra a viabilidade de utilização de sobreposições de líquidos de um modo de elevado rendimento para RVFV. <img alt="A Figura 1" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig1highres.jpg" /> Figura 1:. RVFV comparações de placas de sobreposição utilizando placas de 12 poços Veros foram plaqueadas a 2,5 x 10 5 células em placas de 12 poços e infectadas com 200 ul usando a mesma amostra diluída em série a partir de MP12. Após a infecção de 1,5 ml sobreposições de 0,3% de agarose, 0,6% Avicel, ou 1% de CMC (c definitivaoncentrations), foram aplicados a fim de comparar directamente as sobreposições como demonstrado no Painel A. As placas foram contadas e titulados no Painel B. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig2highres.jpg" /> Figura 2:. RVFV comparações de placas de sobreposição utilizando placas de 6 cavidades Veros foram colocadas em placas a 5 x 10 5 células em placas de 6 alvéolos e infectadas com 400 ul usando a mesma amostra diluída em série a partir de MP12. Três ml de sobreposições de agarose a 0,3%, 0,6% Avicel, ou 1% de CMC, foram aplicados a fim de comparar directamente as sobreposições como demonstrado no Painel A, B, e C. As experiências separadas foram realizadas de forma idêntica à descrita para painéis de AC, com as placas foram contadas e titulam-se no Painel D (N = 3). <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig3highres.jpg" /> Figura 3: &lt;fortes&gt; VEEV placa comparações de sobreposição utilizando placas de 12 poços. Veros foram plaqueadas a 2,5 x 10 5 células em placas de 12 poços e infectadas com 200 ul usando a mesma amostra diluída em série a partir da estirpe de vacina VEEV TC-83. Após a infecção de 1,5 ml sobreposições de 0,3% de agarose, 0,6% Avicel, ou 1% de CMC, foram aplicados a fim de comparar directamente as sobreposições como demonstrado no Painel A. As placas foram contadas e titulados no Painel B. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig4highres.jpg" /> Figura 4:. V EEV comparações de sobreposição de placa, utilizando placas de 6 cavidades Veros foram colocadas em placas a 5 x 10 5 células em placas de 6 alvéolos e infectadas com 400 ul usando a mesma amostra diluída em série a partir de VEEV TC-83. Após a infecção, as sobreposições de 3 ml de agarose a 0,3%, 0,6% Avicel, ou uma CMC de 1%, foram aplicados a fim de comparar directamente as sobreposições como demonstradoem Painéis A, B e C. experiências separadas foram realizadas de forma idêntica à descrita para os Painéis A - C, com placas contadas e titulados no Painel D (N = 3). <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig5highres.jpg" /> Figura 5: Influenza comparações de placas de sobreposição células MDCK foram colocadas em placas a 5 x 10 5 células em placas de 6 alvéolos e infectadas com 400 ul de inoculo, utilizando a mesma amostra diluída em série a partir de Influenza B Taiwan.. Nenhum soro fetal bovino (FBS) foi utilizado no meio de crescimento ou sobreposições, como FBS pode inibir a propagação da gripe por meio da inibição de determinadas proteases que são necessários para a fusão viral. TPCK-tripsina foi adicionada a todas as folhas de prova antes da aplicação, a fim de facilitar a fusão e a entrada viral com as células hospedeiras. Após a infecção, as sobreposições de 3 ml de agarose a 0,3%, 0,6% Avicel, ou 1% de CMC foram aplicados a fim de comparar directamenteas sobreposições, tal como demonstrado no Painel A, B e C. As experiências separadas foram realizadas de forma idêntica à descrita no Painéis A - C, com placas contadas e titulados no Painel D (N = 3). Enquanto a média foi levado para placas CMC eles provaram difícil contar confiável como eles demonstraram fronteiras difusas e tamanhos de placas muito pequenas. <img alt="A Figura 6" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig6highres.jpg" /> Figura 6:. Sobreposições de placas High Throughput Uma placa de 96 poços de Veros colocadas em placas a 3 x 10 4 culas por po, foram infectados com 50 ul de inoculo, utilizando a mesma amostra diluída em série a partir de RVFV MP12 durante 1 hora, em quadruplicado. Para as sobreposições, 0,6 e 1,2% de Avicel concentrações finais foram testadas a fim de determinar a viabilidade de utilização de reprodutibilidade e sobreposições de líquidos de um modo de elevado rendimento, Painéis A e B. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Tipo de celular </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Período de infecção </td><td> 1 hr </td><td> 1 hr </td><td> 45 min </td></tr><tr><td> O tempo de incubação </td><td> 3 dias </td><td> 2 dias </td><td> 3 dias </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Placa condições do ensaio de inoculação e Celulares Tipos <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Tipo celular </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Tipo de Crescimento</td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 2 </td></tr><tr><td> Placa de mídia </td><td> A 2xEMEM </td><td> A 2xEMEM </td><td> 2xEMEM B </td></tr></tbody></table> 1. Dulbecco Modified Eagle Médium suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino, 1% de L-glutamina, 1% Penicllin / Estreptomicina. 2. Dulbecco Modified Eagle Médium suplementado com 1% de L-glutamina, 1% Penicllin / Estreptomicina, 0,2% Albumina de Soro Bovino, 0,025% de HEPES, DEAE-dextrano com 50 ug / ml. A. 2x Meios Essencial Mínimo (500 ml) suplementado com FBS a 5% (25 ml), 1% Mínimo essenciais Amino Acids (5 ml), 1% de piruvato de sódio (5 ml), 1% de L-Glutamina (5 ml), 2% de Pen / Strep (10 ml). B. 2x Meios Essencial Mínimo (500 ml) suplementado com 0,2% de albumina de soro bovino, 1% Minimum Essential Amino Acids (5 ml), com 50 ug / ml, 0,025% de HEPES, DEAE-Dextrano, Tripsina-TPCK * * Pouco antes da preparação, adicione 1 ml por cada 25ml de 2 mg / ml de TPCK-tripsina à alíquota que será utilizado para misturar com agarose para placas. Tabela 2: Placa e Viral / Cellular Crescimento Medias <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Tipo de celular </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Período de infecção </td><td> 1 hr </td><td> 1 hr </td><td> 45 min </td></tr><tr><td> O tempo de incubação </td><td> 3 dias </td><td> 2 dias </td><td> 3 dias </td></tr></tbody></table> Soluções de sobreposição não irá expirar quando feito desde que a esterilidade seja mantida. Tabela 3: Sobreposições da <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 6 bem </td><td> 12 bem </td><td> 96 bem </td></tr><tr><td> N ° de células / poço </td><td> 5 x 10 5 </td><td> 2,5 x 10 5 </td><td> 3 x 10 4 </td></tr><tr><td> Volume de inóculo (ul) </td><td> 400 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> volume de sobreposição (ml) </td><td> 3 </td><td> 1,5 </td><td> 0.100 </td></tr></tbody></table> Tabela 4: Formatos de Placa

Watch this Scientific Journal Video about Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems at JoVE.com

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Concentração Determinação Viral Através de placa Ensaios: Usando tradicionais e novos Sistemas de sobreposição

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

viral-concentration-determination-through-plaque-assays-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

110.1K visualizações.  George Mason University. Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Vídeo: Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Usando um ensaio Microarray Pan-Viral (Virochip) para Tela de amostras clínicas para patógenos virais

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Imunologia e Infecção

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Análise quantitativa de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas Virais e neuraminidases usando anticorpos Universal em Ensaios Blot simples slot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant limitations, viruses are more resistant to many inactivation processes and standard fecal indicators do not inform on the source of contamination. The development of cost-effective methods for the concentration of viruses from water and molecular assays facilitates the applicability of viruses as indicators of fecal contamination and as microbial source tracking (MST) tools. Adenoviruses and polyomaviruses are DNA viruses infecting specific vertebrate species including humans and are persistently excreted in feces and/or urine in all geographical areas studied. In previous studies, we suggested the quantification of human adenoviruses (HAdV) and JC polyomaviruses (JCPyV) by quantitative PCR (qPCR) as an index of human fecal contamination. Recently, we have developed qPCR assays for the specific quantification of porcine adenoviruses (PAdV) and bovine polyomaviruses (BPyV) as animal fecal markers of contamination with sensitivities of 1-10 genome copies per test tube. In this study, we present the procedure to be followed to identify the source of contamination in water samples using these tools. As example of representative results, analysis of viruses in ground water presenting high levels of nitrates is shown.
Detection of viruses in low or moderately polluted waters requires the concentration of the viruses from at least several liters of water into a much smaller volume, a procedure that usually includes two concentration steps in series. This somewhat cumbersome procedure and the variability observed in viral recoveries significantly hamper the simultaneous processing of a large number of water samples.
In order to eliminate the bottleneck caused by the two-step procedures we have applied a one-step protocol developed in previous studies and applicable to a diversity of water matrices. The procedure includes: acidification of ten-liter water samples, flocculation by skimmed milk, gravity sedimentation of the flocculated materials, collection of the precipitate and centrifugation, resuspension of the precipitate in 10 ml phosphate buffer. The viral concentrate is used for the extraction of viral nucleic acids and the specific adenoviruses and polyomaviruses of interest are quantified by qPCR. High number of samples may be simultaneously analyzed using this low-cost concentration method.
The procedure has been applied to the analysis of bathing waters, seawater and river water and in this study, we present results analyzing groundwater samples. This high-throughput quantitative method is reliable, straightforward, and cost-effective.

The study describes a cost-effective method for the identification of the source of fecal/urine contamination or contamination by nitrates in water using qPCR for the specific quantification of human/porcine/bovine DNA viruses, adenoviruses and polyomaviruses, proposed as MST tools.

Relação custo-benefício Método de Rastreamento Fonte microbiana, utilizando específicas Vírus Humano e Animal

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are observed during MNV-1 infection of murine dendritic cells or macrophages 1. This property of MNV-1 can be used to quantify the number of infectious particles in a given sample by performing a plaque assay 1. The plaque assay relies on the ability of MNV-1 to lyse cells and to form holes in a confluent cell monolayer, which are called plaques 3.
Multiple techniques can be used to detect viral infections in tissue culture, harvested tissue, clinical, and environmental samples, but not all measure the number of infectious particles (e.g. qRT-PCR). One way to quantify infectious viral particles is to perform a plaque assay 3, which will be described in detail below. A variation on the MNV plaque assay is the fluorescent focus assay, where MNV antigen is immunostained in cell monolayers 4. This assay can be faster, since viral antigen expression precedes plaque formation. It is also useful for titrating viruses unable to form plaques. However, the fluorescent focus assay requires additional resources beyond those of the plaque assay, such as antibodies and a microscope to count focus-forming units. Infectious MNV can also be quantified by determining the 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) 3. This assay measures the amount of virus required to produce CPE in 50% of inoculated tissue culture cells by endpoint titration 5. However, its limit of detection is higher compared to a plaque assay 4.
In this article, we describe a plaque assay protocol that can be used to effectively determine the number of infectious MNV particles present in biological or environmental samples 1, 4, 6. This method is based on the preparation of 10-fold serial dilutions of MNV-containing samples, which are used to inoculate a monolayer of permissive cells (RAW 264.7 murine macrophage cells). Virus is allowed to attach to the cell monolayer for a given period of time and then aspirated before covering cells with a mixture of agarose and cell culture media. The agar enables the spread of viral progeny to neighboring cells while limiting spread to distantly located cells. Consequently, infected cells are lysed and form holes in the monolayer known as plaques. Upon sufficient spread of virus, plaques become visible following staining of cells with dyes, like neutral red, methylene blue, or crystal violet. At low dilutions, each plaque originates from one infectious viral particle and its progeny, which spread to neighboring cells. Thus, counting the number of plaques allows one to calculate plaque-forming units (PFU) present in the undiluted sample 3.

Here we describe a method to quantify infectious particles of murine norovirus (MNV), which is the only norovirus that efficiently replicates in cell culture. The plaque assay takes advantage of MNV&#x2019;s tropism for murine macrophages and can be adapted for use with biological or environmental samples containing MNV.

Ensaio de placas para Norovirus Murine

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

Ensaios para a identificação de novos antivirais contra a febre catarral ovina vírus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Usando a sobreposição de ensaio para medir qualitativamente produção bacteriana e sensibilidade para pneumocócica Bacteriocinas

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Phenomics fago: Abordagens fisiológicas para Caracterizar Novel Proteínas Virais

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

No início virais Ensaios de entrada para a identificação e avaliação de compostos antivirais

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Medição de Inibição da Neuraminidase Influenza títulos de anticorpos por Enzyme-linked Lectina Ensaio

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.

Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.

Usando cristalografia de raios X, Biofísica, e os ensaios funcionais para determinar a célula T mecanismos que regem o reconhecimento do receptor de Câncer Antígenos