O protocolo ajuda os alunos a identificar infecções individuais de forma clara e realizar o ensaio facilmente, tornando-se mais eficiente quantificar o título viral. Este protocolo incorpora um simples procedimento de fixação e coloração que produz resultados confiáveis e reprodutíveis. Este método pode fornecer uma visão da precisão e eficácia dos tratamentos antivirais contra doenças.
Os obstáculos mais difíceis deste protocolo de plaquamento são a contagem de células para semeadura de placas, certificando-se de que as células não superlotam, secam ou são arranhadas durante todo o processo. Pode-se também encontrar dificuldade na natureza meticulosa geral deste protocolo. No entanto, a prática é um dos principais contribuintes do sucesso deste experimento.
Para começar, complete a diluição amostral na adição de vírus às células em uma sessão de laboratório. Diluir em série cada amostra de vírus sendo emplacida na PBS. Normalmente, use diluições de 10 vezes para o rastreamento mais preciso.
Mantenha todas as diluições virais no gelo até que estejam prontas para adicionar essas amostras de vírus diluídas às células. Remova o meio de cultura celular de um ou dois poços usando uma pipeta. Adicione cuidadosamente a amostra do vírus diluído dropwise a cada monocamada de células dropwise através do lado de cada poço.
Repita o processo para cada um ou dois poços até que toda a placa esteja preenchida com as amostras do vírus sendo emplacados. Balance suavemente a placa inteira à mão. Em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius por uma hora para permitir a adsorção do vírus.
Depois de 10 minutos, retire a placa da incubadora, balance-a suavemente novamente para espalhar o vírus mais uniformemente em cada poço, e depois coloque-a de volta na incubadora. Para diminuir a possibilidade de contar inadvertidamente o inóculo não absorvido, remova a amostra do vírus dos poços usando uma ponta de pipeta de 1000 microliter e descarte a amostra em um béquer de resíduos. Coloque 2,5 mililitros de uma sobreposição de metilcelulose na placa e coloque-a de volta na incubadora.
Desinfete o béquer de resíduos, tipicamente com a adição de alvejante, um iodophor, ou um virucida semelhante, antes de removê-lo do armário de biossegurança. Após a incubação de dois dias, remova a sobreposição de metilcelulose de um ou dois poços de cada vez usando uma pipeta e coloque-a em um béquer de resíduo. Adicione aproximadamente dois mililitros de 1% de violeta cristalina em 50% de etanol para cada poço.
Incubar a placa com todos os poços preenchidos com a mancha por 30 minutos a 37 graus Celsius. Neste ponto, desinfete o béquer de resíduos como demonstrado anteriormente. Lave as placas vigorosamente com água da torneira até que o escoamento esteja limpo.
Certifique-se de que há aproximadamente 10 vezes diferenças no número de placas em cada série de diluição. A figura retrata uma redução de 10 vezes na contagem de placas onde o número contável de placas caiu na faixa de 10 para menos quatro para todas as três réplicas. As três primeiras imagens na figura retratam placas na diluição de 10 a menos três.
No entanto, a linha inferior mostra resultados quando um ensaio de placa não é bem conduzido. Há muito poucas placas visíveis de qualquer diluição nas áreas visíveis ao redor do topo onde as células Vero foram totalmente levantadas do substrato. Da mesma forma, esta figura mostra problemas com células secando ou manipulando mal durante o ensaio da placa.
No entanto, este número mostra criticamente a pobre semeadura celular Vero. Cada poço mostra manchas roxas mais escuras, indicativas de células não se espalham bem pelo poço e empilhadas umas sobre as outras em aglomerados. Para obter melhores resultados, certifique-se de que o vírus se espalhe uniformemente pela placa para evitar placas agrupadas Os ensaios da placa são mais eficazes do que outros métodos quantitativos, pois ele só conta vírus vivo.
Dessa forma, a verdadeira eficácia antiviral pode ser estabelecida. Além disso, essa técnica nos permitiu quantificar a presença viral em fomites e explorar a eficácia da entrega de medicamentos a partir de novos dispositivos médicos dentro do nosso setor de pesquisa sobre vírus herpes.
