Agradecemos a membros do laboratório Wobus para comentários críticos e sugestões. Trabalhar no laboratório de CEW foi financiado por fundos de arranque da Universidade de Michigan, uma bolsa de desenvolvimento de carreira a partir do Centro NIH / NIAID Regional de Excelência para a Bio-defesa e Emergentes de Pesquisa de Doenças Infecciosas (RCE) Programa, Região V &#39;Grande RCE Lakes &#39;(NIH prêmio 1-U54-AI-057153) e NIH R01 AI080611. MBG-H. foi financiado pelo Imunologia Experimental (NIH T32 A1007413-16) e os Mecanismos moleculares em Patogênese Microbiana (NIH T32 A1007528) bolsas de formação para a Universidade de Michigan. JBC foi financiado pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Brasília, Brasil.

1. A cultura da linha celular de macrófagos RAW 264.7 <ol><li> Manter células RAW 264.7 (ATCC, catálogo # TIB-71) em meio DMEM-10 media, que consiste em glucose alta DMEM com 10% (v / v) de endotoxina baixa de soro fetal bovino (&lt;10 EU / ml), Hepes 10 mM , 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 1 mM de não-aminoácidos essenciais, 2 mM de L-glutamina. As células são normalmente mantidas em 175 cm 2 frascos de cultura de tecidos contendo 35 ml de meio por frasco e incubaram-se a 37 ° C e 5% de CO 2 num incubador de cultura de tecido. Contudo, qualquer tamanho de balão pode ser usado com um volume de meio que seja apropriado para o tamanho do frasco. </li><li> Para dividir células: aspirar os meios velhos, adicionam-se 10 ml de DMEM fresco-10 media para as células e, em seguida, raspar as células a partir do fundo do balão, utilizando um raspador de células. Em seguida, voltar a suspender as células em uma solução homogénea através da elaboração de células para uma pipeta de 10 ml e com força pressionando as células através da ponta de pipeta prEssed contra o fundo do frasco. Repetir esta acção, pelo menos, 3 vezes de modo que as células já não clump juntos. Verificar por microscopia óptica que a suspensão de célula única foi gerada. Em seguida, transferir 1 ml (diluição de 1:10, ou ~ 1x10 7 células) - 2 ml (diluição 1:5 ou ~ 2x10 7 células) de suspensão de células para um novo 2 175 centímetros frasco, e perfazer um volume final de meio até 35 ml. </li><li> Dividir células quando elas são quase confluente (~ 1x10 8 células total/175 cm 2 frascos): de três em três dias, se começando com uma diluição de 1:10, ou de dois em dois dias, se começando com uma diluição de 1:5. Use microscopia de luz para verificar a morfologia das células antes de divisão de células. A maioria das células deve olhar em volta e não ativado. Células ativadas têm grânulos e / ou prolongado, espigado morfologia com apêndices. Não deixe overgrow células como essas células não costumam formar placas. Mantenha o controle do número de passagens e freqüentemente começar de descongelamento por uma alíquota menor passagem de células. (Usamos passagem 30 como um ponto de corte). </li></ol> 2. Infectar células RAW 264.7 com MNV inóculo <ol><li> Semente células RAW 264.7 em placas de 6 poços (3,5 cm de diâmetro) a uma densidade de 1x10 6 células viáveis ​​/ ml em DMEM-10 media, e adicionar 2 ml desta suspensão a cada poço. É importante para distribuir uniformemente as células nos poços de placas, quer por balançar à mão, pelo menos, 10 vezes ou utilizando um aparelho de balanço para ~ 10 min. Não redemoinho as placas como isso vai fazer com que as células de agrupamento, no centro do poço. Colocar em placas de cultura de tecido (incubadora a 37 ° C e 5% CO 2). Permitir que as células fixar durante a noite ou durante pelo menos 4 horas a 37 ° C. As células devem ser 60 - 80% confluentes para o ensaio de placa e distribuídos uniformemente por todo o poço. </li><li> No dia seguinte, preparar o inoculo de vírus, o que pode ser a partir de células infectadas com MNV em cultura de tecidos ou a partir de tecidos homogeneizados ou amostras de fezes de MNV camundongos infectados. Ao utilizar amostras de tecido, pi do tamanho de ervilhaECEs de tecidos são homogeneizados em 2 ml com tampa de rosca contendo contas de tubos estéreis de sílica em 1 mL de DMEM-10, utilizando um homogeneizador de tecidos (por exemplo, MagnaLyser; Roche). Para as amostras de fezes, não mais do que três pelotas fecais devem ser homogeneizadas em uma mídia ml. Todas as amostras são então congeladas (a -80 ° C) e descongelado uma vez antes de realizar o ensaio de placas fágicas. </li><li> Preparar diluições de 10 vezes do inoculo de vírus em DMEM completo meio-5, que consiste em DMEM / concentração elevada de glucose, 5% (v / v) de endotoxina baixa de soro fetal bovino (&lt;10 EU / ml), 10 mM de HEPES, 100 U / ml de penicilina, estreptomicina 100 ug / mL, 1 mM não-aminoácidos essenciais, 2 mM de L-glutamina. </li><li> Dez diluições em série são preparados em placas de 24 poços: A pipeta repetidora é usada para dispensar 1,35 ml de meio em poços múltiplos, a diluição 10 -1 é feita por mistura de 1,35 ml de meio e 0,15 ml de vírus contendo amostra, e em seguida, 0,15 ml de uma diluição 10 -1 é adicionado 1,35 ml de meios para fazer a 10 -2 dilution e assim por diante. É importante mudar dicas cada vez que você faz uma nova diluição. Uma pipeta multicanal pode ser usado para fazer as diluições de amostras múltiplas de cada vez com duas pontas encaixe para um poço de uma placa de 24 poços a transferência de um volume total de 0,15 ml por poço (ver Figura 3A). </li><li> Uma gama de diluição típico para homogenatos de tecido e conteúdos fecais é de 10 -1 a 10 -3. No entanto, as placas a partir dessas amostras tendem a ser menores em comparação com aqueles a partir de amostras de cultura de tecidos. Além disso, em alguns casos, uma diluição de 1:100 das amostras fecais é necessária para diluir suficientemente para fora quaisquer componentes tóxicos das fezes que podem perturbar a monocamada de células, impedindo assim a possibilidade de contar placas. A gama de diluição de lisados ​​de cultura de tecidos depende do ponto de tempo de interesse durante o ciclo de vida viral. Diluições que vão até 10 -9 pode ser necessária no pico da infecção. </li><li> Após as diluições em série são preparados, rotular a placa de 6 poçoss contendo RAW 264,7 monocamadas (da seção 2.1) com o nome da amostra e diluições sendo banhado. Uma placa de cada vez, remova todas as mídias sacudindo-o ou aspirar ele. Imediatamente depois adicionar 0,5 ml de uma amostra diluída para um poço, em seguida, repita com uma duplicata bem, antes de proceder à diluição seguinte. Uma vez que todos os três diluições são adicionados a uma placa de inclinação da placa, e para trás com a mão para garantir que todas as células foram cobertas. Manipular uma placa de cada vez para assegurar que as células não sequem. </li><li> Após a adição de 0,5 ml das diluições de cada poço, a pilha de placas de pé e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. Uma vez que o volume adicionado a cada poço, não é suficiente para cobrir completamente a monocamada, as placas têm de ser suavemente inclinada para trás e para a frente com a mão cada 10-15 minutos ou colocada num aparelho de balanço (~ 18 oscilações por minuto). Isso evita que as células de secagem. </li></ol> 3. Baixo ponto de fusão de agarose (SeaPlaque) Preparação Overlay <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Nota: é aconselhável ter várias garrafas com autoclavado SeaPlaque agarose preparado antes do tempo. De agarose podem ser re-fundidas num forno de microondas antes de usar. <ol><li> Calcular a quantidade de sobreposição necessário para o volume total de placas, antes de 1 h de incubação estiver completa. O volume necessário é de 2 ml / cavidade ou 12 ml/6-well placa. Prepare agarose (ver secção 3.2) e media (ver secção 3.3) separadamente. </li><li> Para preparar a agarose, suspender 3 g de agarose SeaPlaque, num volume total de 100 ml de água destilada (3% w / v) num frasco de vidro. Autoclave por 20-30 min. (Se agarose foi já preparado de antemão, re-fundida de agarose em microondas.) É importante equilibrar SeaPlaque agarose a 42 ° C num banho de água antes da sua utilização, porque se a agarose é muito quente, que vai matar as células. Certifique-se o nível de água é igual a ou superior ao nível de agarose a fim de evitar a solidificação indesejável. </li><li> Para preparar os meios de comunicação: fazer 100 ml de 2x MEM mídia, que consiste em2x MEM, 10% (v / v) de endotoxina de soro fetal bovino baixo (&lt;10 EU / ml), 10 mM de HEPES, 100 U / ml de penicilina, 100 ug de estreptomicina / ml, 4 mM de L-glutamina. Equilibre media a 37 ° C num banho de água. </li><li> Misturar ambas a agarose SeaPlaque e os meios de comunicação MEM 2x juntos em um frasco estéril a uma razão de 1:1 imediatamente antes de sobrepor as monocamadas de células infectadas. Se houver mais do que 200 ml de sobreposição é necessário, o volume de divisão em várias garrafas e manter-se em 37 ° C banho de água até que esteja pronto para uso. </li><li> No final da incubação de 1 hora (ver secção 2.7), aspirar o inoculo a partir de cada poço. Lentamente, adicionar 2 ml de sobreposição para a extremidade de cada poço, colocando a ponta da pipeta contra a parede de cada poço. Até 5 placas podem ser tratadas simultaneamente, sem células secar. </li><li> Permitir a sobreposição de solidificar durante aproximadamente 10 min à temperatura ambiente, antes de colocar as placas na vertical para o tecido incubadora de cultura. Incubar as placas durante 48 horas a 37 ° C em 5% de CO 2. </li><li> Depoiso período de incubação, as placas são fracamente visíveis a olho nu, de modo a verificar as placas não coradas para a presença de placas. Se não houver placas são visíveis, incubar por um adicional de 4 horas e verifique novamente. No entanto, o tempo máximo de incubação não deve exceder 72 horas. </li></ol> 4. A visualização das placas por coloração com vermelho neutro <ol><li> Para visualizar as placas, a solução de coloração de vermelho neutro é preparada por adição de 3 ml de vermelho neutro (0,33% w / v em DPBS; Sigma, catálogo # N2889) a cada ml 97 de 1x PBS (grau de cultura de tecidos, Mg 2 + -, Ca 2 + - livre; Gibco, catalogo 10010). Calcula-se o volume da solução de coloração de vermelho neutro necessário para a experiência: 12 ml de solução de coloração de vermelho neutro são necessários para cada placa de 6 poços. Em seguida, adicionar 2 ml a cada poço. Apesar de alguns protocolos de ensaio em placa requer a tomada de agarose para ser removido dos poços, neste protocolo a solução de coloração de vermelho neutro é adicionado directamente sobre a cobertura. </li><li> Depois de uma hora um emcubation a 37 ° C, verifica se as placas são visíveis com solução de coloração de vermelho neutro ainda em poços. Se as placas não são facilmente visíveis, permita a coloração para continuar por mais um hora. Continuar a incubação até que as placas são visíveis. (Nota:. Staining durante mais de 3 horas não é o ideal e, se não placas são visíveis na amostra de controlo positivo, após 3 horas de coloração, o ensaio de placa não funcionar adequadamente) Após a coloração for completa, aspirar a solução de coloração de vermelho neutro , garantindo a ficha de agarose não é perturbada, e então proceder à contagem das placas. </li><li> Conte placas colocando placa de cabeça para baixo em uma caixa de luz e marcando um ponto em placas contados para evitar contagens duplicadas. Escolher a diluição para contar placas em poços de placas, onde estão claramente separados (isto é, sem evidência visual de fusão placas em conjunto). Se possível, a contagem de placas, duas diluições. É importante notar que o tamanho da placa pode variar entre estirpes MNV, inoculo de vírus, e depende docondição das células RAW 264.7, durante o ensaio de placas fágicas. </li><li> Se não houver placas são visíveis num poço, não houve qualquer vírus presente na amostra ou a quantidade de vírus foi abaixo do limite de detecção do ensaio de placas. Neste caso, os poços mancha vermelha com uma cor semelhante como outros placa contendo poços. Alternativamente, a ausência de placas é também observada quando existem demasiados partículas virais presentes em uma dada diluição. Isto leva à lise da monocamada inteiro e poços aparecer laranja / amarelo. </li><li> Calcular os títulos virais. Adicionar o número de placas em ambos os poços com uma diluição única e multiplicar pelo factor de diluição (isto é, se 1 ml 2 poços estão infectados com 0,5 ml). O resultado será a quantidade de unidades formadoras de placas (PFU) no seu volume de inoculo de 1 ml. Por exemplo, na Figura 4, na diluição 10 -2, um poço (marcado &quot;II&quot;) possui 14 placas e o outro bem (marcado &quot;V&quot;) possui 17 placas. Assim, o título viral será de 14x10 2 + 2 = 17x10 3100 (3.1x10 3) pfu / ml. </li></ol> 5. Resultados representativos Infecciosas MNV-1 partículas pode ser quantificada utilizando um ensaio de placas como descrito esquematicamente na Figura 1. Figura 2A mostra um poço com monocamada de células RAW 264.7 imediatamente antes da infecção, enquanto que a Figura 2B mostra três placas visíveis indicadas por números romanos I, II e III em um poço. Passos individuais do ensaio estão representados nas Figuras 3A a F. A Figura 3A mostra a preparação de diluições em série de 10 vezes de uma amostra contendo vírus. Figura 3B mostra a transferência de diluições em duplicado de uma placa de 6 poços. Figura 3C mostra o aparelho de balanço usado para incubar células RAW 264.7 com o inoculo à temperatura ambiente durante 1 hr a Figura 3D mostra células sendo sobreposto com o SeaPlaque:. MEMmistura. Figura 3E mostra uma placa à temperatura ambiente para permitir a sobreposição de solidificar, enquanto que a Figura 3F mostra células a ser coradas com uma solução de 0,01% de vermelho neutro 48 h mais tarde. Depois da coloração das células para hr 1-3 e aspirando a solução de coloração de vermelho neutro, placas são visíveis e podem ser contadas (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemática do protocolo de ensaio em placa MNV. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig2.jpg" /> Figura 2. Imagens representativas de um poço de uma monocamada antes da infecção e depois da formação de placas. A) células RAW 264.7 foram cultivadas durante a noite e fotografada com um microscópio de luz com ampliação de 20x. B) As células foram coradas com uma solução de 0,01% de vermelho neutro ao fim de 48 hr de infecção e visualizados sob um microscópio de luz com uma ampliação de 4x. Números romanos I, II, e III indicam três placas visíveis. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig3.jpg" /> Figura 3. Imagens representativas das diferentes etapas do ensaio de placa. A) MNV-1 inóculo é preparado em diluições de 10 vezes. B) O inoculo é adicionado a monocamadas de células em cavidades duplicadas. C) As células e de inoculo são incubadas por balançar durante 1 h à temperatura ambiente. D) As células são revestidas com uma mistura 1:1 de agarose SeaPlaque e MEM 2x media. E) As placas são incubadas durante 10 min à temperatura ambiente para permitir a sobreposição de solidificar. F) A coloração das células com a solução de coloração de vermelho neutro 48 h pós-infecção. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig4.jpg" /> Placas Figura 4. MNV-1 formas na célula monolAyers. Mostrado aqui é uma placa de ensaio representativo da placa 48 horas pós-infecção, mostrando as placas coradas com solução de coloração de vermelho neutro, após 1 h de incubação. A placa apresenta cavidades em duplicado de três diluições de 10 vezes. Wells rotulados com números romanos I e IV correspondem à diluição 10-1; II e V correspondem à diluição 10-2; III e VI correspondem à diluição 10-3. O título viral da amostra é indicado abaixo (ver Seção 4.5 para obter detalhes sobre o cálculo).

<ol>
	<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages.">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432 (2004).</li><li>Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+norovirus:+a+model+system+to+study+norovirus+biology+and+pathogenesis.">Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis.</a> Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).</li><li>Condit, R. C., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Fields Virology. 1, 25-58 (2007).</li><li>Thackray, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+noroviruses+comprising+a+single+genogroup+exhibit+biological+diversity+despite+limited+sequence+divergence.">Murine noroviruses comprising a single genogroup exhibit biological diversity despite limited sequence divergence.</a> Journal of virology. 81, 10460-10473 (2007).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+estimating+50%+endpoints.">A simple method for estimating 50% endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1932).</li><li>Chachu, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+is+critical+for+the+clearance+of+murine+norovirus+infection.">Antibody is critical for the clearance of murine norovirus infection.</a> Journal of virology. 82, 6610-6617 (2008).</li><li>Barron, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+murine+norovirus+strains+isolated+from+asymptomatic+mice+of+different+genetic+backgrounds+within+a+single+U.S.+research+institute.">Diversity of murine norovirus strains isolated from asymptomatic mice of different genetic backgrounds within a single U.S. research institute.</a> PLoS ONE. 6, e21435 (2011).</li><li>Cox, C., Cao, S., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+and+study+of+murine+norovirus-1+using+a+more+efficient+microglial+cell+line.">Enhanced detection and study of murine norovirus-1 using a more efficient microglial cell line.</a> Virology journal. 6, 196 (2009).</li><li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li><li>Hyde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+norovirus+replication+is+associated+with+virus-induced+vesicle+clusters+originating+from+membranes+derived+from+the+secretory+pathway.">Mouse norovirus replication is associated with virus-induced vesicle clusters originating from membranes derived from the secretory pathway.</a> Journal of virology. 83, 9709-9719 (2009).</li><li>Simmonds, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+and+functional+analysis+of+RNA+secondary+structure+elements+among+different+genera+of+human+and+animal+caliciviruses.">Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among different genera of human and animal caliciviruses.</a> Nucleic acids research. 36, 2530-2546 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método de ensaio de placa para MNV-1 aqui apresentado é uma forma de quantificar partículas infecciosas MNV. Seguindo os passos de ensaio ilustrado na Figura 3, pode-se obter títulos virais reprodutíveis. O limite de detecção do ensaio depende da diluição de partida utilizado. Ao iniciar com uma diluição de 1:10 da amostra, tal como descrito acima, o limite de detecção do ensaio de placa é de 10 pfu (isto é, uma placa visível na diluição 10 -1). Uma vez que cada placa representa um único vírus, o ensaio de placa pode também ser utilizado para purificar as populações clonais de MNV escolhendo placas isoladas e propagando-los conforme descrito anteriormente 1. Além disso, a purificação de placas também pode ser usado para separar uma população de vírus individuais a partir de populações mistas de vírus. Uma limitação do uso de um ensaio de placas para a detecção de infecção MNV é que nem todas as estirpes mnv formar placas 4. No entanto, pode ser possível ultrapassar o inabilidade de algumas estirpes de MNV, isolados a partir de animais, para formar placas em série passaging destes vírus em cultura de tecido 7. Uma alternativa para o ensaio de placa é o de medir partículas infecciosas por meio da técnica de TCID 50 3, 4. Este ensaio quantifica a quantidade de vírus necessária para produzir CPE em 50% das células de cultura de tecidos inoculadas seguintes diluições de ponto de extremidade e leva 1 semana para completar para MNV 4. Além de ser mais lento do que um ensaio de placa, o ensaio de TCID 50 também não é tão sensível (limite de detecção = 200 TCID 50 / ml), devido à toxicidade de amostras de tecido de células RAW 264.7 4. Embora passos críticos no âmbito do protocolo foram descritos ao longo do protocolo, a seção seguinte apresenta um resumo para facilitar a resolução de problemas. Os passos mais importantes do protocolo é o de assegurar que as células RAW 264.7 permanecem viáveis ​​ao longo do ensaio para suportar a replicação do vírus. Isto podeser monitorizado em cada fase do ensaio por meio de microscopia de luz. A viabilidade celular é assegurada de duas maneiras. Primeiro, deve ser tomado cuidado para não deixar secar as células durante o manuseio de placas. Assim, as placas são inoculadas um de cada vez, agitou durante o período de infecção, e devem permanecer fechadas quando não estão a ser tratadas. Em segundo lugar, as soluções adicionado em células devem ser equilibradas para ~ 37 ° C. Além disso, é essencial para a saúde geral das células RAW 264.7 de mantê-las em meio contendo soro de endotoxina baixa (&lt;10 EU / ml), o que limita a activação de células. Além disso, observou-se uma maior taxa de falha do teste de placa quando são usadas células de passagem 30 ou superior. Embora isso provavelmente irá variar de laboratório para laboratório, é importante incluir um controlo positivo (por exemplo, uma amostra com um título conhecido viral) para assegurar títulos reprodutíveis, especialmente quando se utiliza mais elevadas de passagem células RAW 264.7. Para limitar a utilização de células mais elevadas de passagem, é aconselhável congelar frascos de Passa precocecélulas ge após o recebimento de células RAW 264.7 e iniciar uma nova cultura dos frascos congelados freqüência. Começando por cima, com culturas de células de passagem baixa também será útil quando as células apresentam características alteradas, tais como a incapacidade de aderir, as alterações na morfologia celular (por exemplo, de volta para espigado e espalhar-se), ou quando a contaminação por micoplasma foi detectado. Outro ponto importante a prestar atenção é para garantir que ponteiras são trocadas entre as amostras e durante diluições. Isto irá assegurar precisas diluições seriadas e evitar a contaminação cruzada entre as amostras. O primeiro passo no protocolo em que a ponta da pipeta mesmo pode ser utilizado de novo, quando é diluições em série de uma mesma amostra são adicionados aos poços. Nesse caso, a pessoa deve começar a partir do inóculo mais diluído para o mínimo, e vigorosamente pipetar cima e para baixo ao elaborar uma nova diluição. O protocolo de ensaio de placa pode ser alterada a várias modificações. Uma modificação que pode ser feita quando taqui não são suficientes para a inoculação de células de poços em duplicado é apenas para inocular um único poço de cada diluição. No entanto, uma vez que o volume de inoculo é de 0,5 ml, o número de placas, em seguida, tem de ser multiplicado por um factor de 2 para normalizar a pfu / ml. O ensaio de placa pode também ser adaptado para utilização com qualquer linha celular aderente outro que é capaz de suportar a replicação de MNV, e esta tem sido descrita para a linha microglial murino BV-2 de 8 células. Outras modificações que podem ser aplicadas são as adaptações que foram descritas para os protocolos de ensaio de placas desenvolvidas em outros vírus. Em caso de MNV, as seguintes modificações já foram implementadas com sucesso, a utilização de celulose de metilo em vez de agarose Sea Plaque 9, e coloração das células com violeta de cristal ou azul de metileno em vez de vermelho neutro 10, 11. No geral, este protocolo pode ser facilmente adaptado, conforme necessário para quantificar outros formadoras de placas de vírus ou utilizados para other vírus que causam infecções líticas em RAW 264,7 células, tornando-se uma ferramenta útil para quantificar partículas virais infecciosas em geral.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> DMEM / glicose alta </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.02 </td></tr><tr><td> 2x MEM </td><td> Gibco </td><td> 11935 </td></tr><tr><td> 100x penicilina e estreptomicina </td><td> Hyclone </td><td> SV30010 </td></tr><tr><td> 10 mM não-aminoácidos essenciais </td><td> Hyclone </td><td> SH30238.01 </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> Hyclone </td><td> SH30237.01 </td></tr><tr><td> 200 mM (100x), L-glutamina </td><td> Hyclone </td><td> SH30034.01 </td></tr><tr><td> Soro Fetal Bovino </td><td> Gibco, Hyclone </td><td> 10437, SH30070.02 </td></tr><tr><td> Mar Plaque Agarose </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> Neutral Red 0,33% </td><td> Sigma </td><td&gt; N2889 </td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010 </td></tr><tr><td> 1,0 milímetros de zircônia / sílica contas </td><td> Produtos Biospec </td><td> 11079110z </td></tr><tr><td> Modelo Rocker Velocidade 35 </td><td> Labnet </td><td> S2035 </td></tr><tr><td> Instrumento Lyser Magna </td><td> Roche </td><td> 03358968001 </td></tr><tr><td> Linha de células RAW 264.7 </td><td> ATCC </td><td> TIB-71 </td></tr><tr><td> De cultura de tecidos incubadora </td><td> Sanyo </td><td> MCO-18AIC </td></tr></tbody></table>

plaque assay for murine norovirus

Norovirus murino (MNV) é o único membro do género Norovirus que cresce de forma eficiente em cultura de tecido 1, 2. A lise celular e efeito citopático (CPE), são observados durante MNV-1 infecção de células dendríticas ou macrófagos murinos 1. Esta propriedade de MNV-1 pode ser utilizado para quantificar o número de partículas infecciosas de uma amostra dada pela realização de um ensaio de placas 1. O ensaio de placa depende da capacidade de MNV-1 para lisar as células e para formar buracos em uma monocamada confluente de células, as quais são chamadas placas 3. Várias técnicas podem ser usadas para detectar infecções virais em culturas de tecidos, o tecido colhido, clínicas e amostras ambientais, mas não toda a medida do número de partículas infecciosas (por exemplo, qRT-PCR). Uma forma de quantificar partículas virais infecciosas é realizar um ensaio de placa 3, que será descrita em detalhe abaixo. Uma variação no ensaio de placa é o flúor MNVensaio de focagem escent, onde o antigénio é MNV imunocoradas em monocamadas de células 4. Este ensaio pode ser mais rápido, uma vez que a expressão do antigénio viral precede a formação de placa. Também é útil para a titulação de vírus incapazes de formar placas. No entanto, o ensaio de foco fluorescente exige recursos adicionais para além dos do ensaio de placa, tais como anticorpos e um microscópio para contagem de unidades formadoras de foco. Infecciosa MNV pode também ser quantificada por meio da determinação dos 50% Dose infecciosa em cultura de tecidos (TCID 50) 3. Este ensaio mede a quantidade de vírus necessária para produzir CPE em 50% das células de cultura de tecidos inoculadas por titulação de ponto de extremidade 5. No entanto, o seu limite de detecção é maior em comparação com um ensaio de placa 4. Neste artigo, descreve-se um protocolo de ensaio de placa que podem ser usados ​​para determinar de forma eficaz o número de partículas infecciosas mnv presentes nas amostras biológicas ou ambientais 1, 4, 6. Este método é based sobre a preparação de diluições de 10 vezes em série de amostras contendo MNV, que são utilizados para inocular uma monocamada de células permissivas (células RAW 264.7 de macrófagos murinos). Vírus é permitido para anexar a monocamada de células durante um determinado período de tempo e, em seguida, aspirado antes de cobrir as células com uma mistura de agarose e meio de cultura celular. O agar permite a propagação da descendência virai de células vizinhas, enquanto limita a propagação de células distantemente localizado. Em consequência, as células infectadas são lisadas e os furos formam na monocamada conhecidos como placas. Após a propagação de vírus suficiente, as placas tornam-se visíveis após a coloração das células com corantes, como o vermelho neutro, azul de metileno ou violeta de cristal. Em diluições baixas, cada placa origina de uma partícula infecciosa viral e sua descendência, que se espalhou para as células vizinhas. Assim, a contagem do número de placas permite calcular unidades formadoras de placas (PFU) presentes na amostra não diluída 3.

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Plaque Assay for Murine Norovirus

Descrevemos aqui um método para quantificar a partículas infecciosas de norovirus murino (MNV), que é o único que norovirus replica eficientemente em cultura celular. O ensaio de placas aproveita tropismo MNV por macrófagos murinos e pode ser adaptado para utilização com amostras biológicas ou ambientais que contenham MNV.

Ensaio de placas para Norovirus Murine

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

54.5K visualizações.  University of Michigan, Ann Arbor. Descrevemos aqui um método para quantificar a partículas infecciosas de norovirus murino (MNV), que é o único que norovirus replica eficientemente em cultura celular. O ensaio de placas aproveita tropismo MNV por macrófagos murinos e pode ser adaptado para utilização com amostras biológicas ou ambientais que contenham MNV.

Vídeo: Plaque Assay for Murine Norovirus

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água por cultura e RT-qPCR. Parte III. Detecção de vírus por RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Ambiente

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close person-to-person contact cannot be avoided 1, 2. During the last few years an increase in the incidence of outbreaks in hospitals has been reported, causing significant disruptions to their operational capacity as well as large economic losses. The identification of new antiviral approaches has been limited due to the inability of human noroviruses to complete a productive infection in cell culture 3. The recent isolation of a murine norovirus (MNV), closely related to human norovirus 4 but which can be propagated in cells 5 has opened new avenues for the investigation of these pathogens 6, 7. 
MNV replication results in the synthesis of new positive sense genomic and subgenomic RNA molecules, the latter of which corresponds to the last third of the viral genome (Figure 1). MNV contains four different open reading frames (ORFs), of which ORF1 occupies most of the genome and encodes seven non-structural proteins (NS1-7) released from a polyprotein precursor. ORF2 and ORF3 are contained within the subgenomic RNA region and encode the capsid proteins (VP1 and VP2, respectively) (Figure 1). Recently, we have identified that additional ORF4 overlapping ORF2 but in a different reading frame is functional and encodes for a mitochondrial localised virulence factor (VF1) 8.
Replication for positive sense RNA viruses, including noroviruses, takes place in the cytoplasm resulting in the synthesis of new uncapped RNA genomes. To promote viral translation, viruses exploit different strategies aimed at recruiting the cellular protein synthesis machinery 9-11. Interestingly, norovirus translation is driven by the multifunctional viral protein-primer VPg covalently linked to the 5' end of both genomic and subgenomic RNAs 12-14. This sophisticated mechanism of translation is likely to be a major factor in the limited efficiency of viral recovery by conventional reverse genetics approaches. 
Here we report two different strategies based on the generation of murine norovirus-1 (referred to as MNV herewith) transcripts capped at the 5' end. One of the methods involves both in vitro synthesis and capping of viral RNA, whereas the second approach entails the transcription of MNV cDNA in cells expressing T7 RNA polymerase. The availability of these reverse genetics systems for the study of MNV and a small animal model has provided an unprecedented ability to dissect the role of viral sequences in replication and pathogenesis 15-17.

Noroviruses are a major cause of gastroenteritis yet molecular techniques for their characterisation are still relatively new. Here we report two different reverse genetics approaches for the efficient recovery of murine norovirus (MNV), the only member of this genus which can be propagated in cell culture.

Recuperação de reversão genética mediada por norovírus Murina Infecciosas

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

Imunologia e Infecção

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Concentração Determinação Viral Através de placa Ensaios: Usando tradicionais e novos Sistemas de sobreposição

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

Optimização de um Micro-quantitativa Ensaio de neutralização

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Swab método de amostragem para a detecção do norovírus Humano em Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine detection of the virus. The current detection and quantification techniques, which rely primarily on nucleic acid amplification, do not discriminate infectious from non-infectious viral particles. The purpose of this article is to present specific details on recent advances in techniques used together in order to acquire further information on the infectivity status of viral particles. One technique involves assessing binding of a norovirus ssDNA aptamer to capsids. Aptamers have the advantage of being easily synthesized and modified, and are inexpensive and stable. Another technique, dynamic light scattering (DLS), has the advantage of observing capsid behavior in solution. Electron microscopy allows for visualization of the structural integrity of the viral capsids. Although promising, there are some drawbacks to each technique, such as non-specific aptamer binding to positively-charged molecules from sample matrices, requirement of purified capsid for DLS, and poor sensitivity for electron microscopy. Nonetheless, when these techniques are used in combination, the body of data produced provides more comprehensive information on norovirus capsid integrity that can be used to infer infectivity, information which is essential for accurate evaluation of inactivation methods or interpretation of virus detection. This article provides protocols for using these methods to discriminate infectious human norovirus particles.

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Routine detection methods utilizing viral genome amplification are limited by their inability to discriminate infectious from non-infectious particles. The purpose of this article is to provide detailed protocols for alternative methods to aid in discrimination of infectious norovirus particles using aptamer binding, dynamic light scattering, and transmission electron microscopy.

Métodos de alternativas In Vitro para a determinação da integridade estrutural do capsídeo Viral

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known as quasispecies, owing to their high mutation rate. Here, we describe how to measure the specific growth rate and the cell-binding ability of rotavirus as its phenotypes. Rotavirus is treated with trypsin to recognize the cell receptor and then inoculated into MA104 cell culture. The supernatant, including viral progenies, is collected intermittently. The plaque assay is used to confirm the virus titer (plaque-forming unit: pfu) of each collected supernatant. The specific growth rate is estimated by fitting time-course data of pfu/mL to the modified Gompertz model. In the assay of cell-binding, MA104 cells in a 24-well plate are infected with rotavirus and incubated for 90 min at 4 &#176;C for rotavirus adsorption to cell receptors. A low temperature restrains rotavirus from invading the host cell. After washing to remove unbound virions, RNA is extracted from virions attached to cell receptors followed by cDNA synthesis and reverse-transcription quantitative PCR (RT-qPCR). These protocols can be applied for investigating the phenotypic differences among viral strains.

Here we present two protocols, one for measuring the specific growth rate and the other for the cell-binding ability of rotavirus using the plaque assay and RT-qPCR. These protocols are available for confirming the differences in phenotypes between rotavirus strains.

Ensaios para a taxa de crescimento específico e a capacidade de ligação de celular de rotavírus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is responsible for altering infection for many of these viruses. Thus, characterizing the nature of virus-bacteria binding is a foundational step needed for elucidating the mechanism(s) by which bacteria alter viral infection. For human norovirus, commensal bacteria enhance B cell infection. The virus directly binds to these bacteria, indicating that this direct interaction is involved in the mechanism of infection enhancement. A variety of techniques can be used to quantify interactions between bacteria and viruses including scintillation counting of radiolabeled viruses and polymerase chain reaction (PCR). Both methods require the use of live virus, which may need to be generated in the laboratory. Currently, none of the established in vitro culture systems available for human norovirus are robust enough to allow for generation of highly concentrated viral stocks. In lieu of live virus, virus-like particles (VLPs) have been used to characterize the interactions between norovirus and bacteria. Herein a flow cytometry method is described with uses virus specific antibodies to quantify VLP binding to gram-negative and gram-positive bacteria. Inclusion of both bacteria only and isotype controls allowed for optimization of the assay to reduce background antibody binding and accurate quantification of VLP attachment to the bacteria tested. High VLP:bacterium ratios result in VLPs binding to large percentages of the bacterial population. However, when VLP quantities are decreased, the percent of bacteria bound also decreases. Ultimately, this method can be employed in future experiments elucidating the specific conditions and structural components that regulate norovirus:bacterial interactions.

The goal of this protocol is to quantify binding of the eukaryotic pathogen human norovirus to bacteria. After performing an initial virus-bacterium attachment assay, flow cytometry is used to detect virally-bound bacteria within the population.

Quantificando partículas semelhantes a vírus norovírus humanos ligando-se a bactérias commensal usando citometria de fluxo

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

Plaque Assay: A Method to Determine Viral Titer as Plaque Forming Units (PFU)

Source: Tilde Andersson1, Rolf Lood1 
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 Lund, Sweden
Viruses that infect prokaryotic organisms, called bacteriophages or simply phages, were identified in the early 20th century by Twort (1) and d&#39;H&#233;relle (2) independently. Phages have since been widely recognized for their therapeutic value (3) and their influence on human (4), as well as global, ecosystems (5). Current concerns have fueled a renewed interest in the use of phages as an alternative to modern antibiotics in treatment of infectious disease (6). Essentially all phage research relies on the ability to purify and quantify viruses, also known as a viral titer. Initially described in 1952, this was the purpose of the plaque assay (7). Decades and multiple technological advancements later, the plaque assay remains one of the most reliable methods for determination of viral titer (8).
Bacteriophages subsist by injecting their genetic material into host cells, hijacking the machineries for production of new phage particles, and eventually causing the host to release numerous progeny virions through cell lysis. Because of their minute size, bacteriophages cannot be observed using solely light microscopy; therefore, scanning electron microscopy is required (Figure 1). Additionally, phages cannot be cultivated on nutritional agar plates like bacteria, as they need host cells to prey on.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig1.jpg" /> 
Figure 1: The morphology of a bacteriophage, here exemplified by an E. coli phage, can be studied using scanning electron microscopy. Most bacteriophages belong to Caudovirales (tailed bacteriophages). This particular phage has a very short tail structure and an icosahedral head, placing it in the family of Podoviruses.
The plaque assay (Figure 2) is based on incorporation of host cells, preferentially in log-phase growth, into the medium. This creates a dense, turbid layer of bacteria able to sustain viral growth. An isolated phage can subsequently infect, replicate within, and lyse one cell. With each lysed cell, multiple adjacent ones become immediately infected. Several cycles in, a clear zone (a plaque) can be observed in the otherwise turbid plate (Figure 2B/Figure 3A), indicating the presence of what was initially a single bacteriophage particle. The number of plaque forming units per volume (i.e. PFU/mL) of a sample, can thus be determined from the number of plaques generated.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig2.jpg" /> 
Figure 2: Testing for plaque forming units (PFU) is a common method for determining the number of bacteriophages in a sample. (A) The base of a sterile Petri dish is covered with an appropriate solid nutrient medium, followed by a mixture of soft media, susceptible host cells and a dilution of the original bacteriophage sample. Note that the phage-suspension could, in some cases, also be evenly spread-out across the surface of already solidified soft agar. (B) Growth of the host bacteria forms a lawn of cells in the top agar layer. Bacteriophage replication generates clear zones, or plaques, caused by host cell lysis.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig3.jpg" /> 
Figure 3: Results from PFU-testing show multiple plaques generated by bacteriophages. Due to lysis of susceptible host cells, plaques can be seen as clearing zones in the bacterial lawn, either with (A) full clearance, or (B) partial re-growth caused by generation of resistant bacteria (or possibly by temperate phages in the lysogenic cycle).
Certain temperate phages can adopt what is referred to as a lysogenic lifecycle, in addition to the formerly described lytic growth. In lysogeny, the virus assumes a latent state through incorporation of its genetic material into the genome of the host cell (9), often conferring resistance to further phage infections. This is sometimes revealed through a slight clouding of the plaque (Figure 3B). It is worth noting however, that plaques can also appear blurred due to re-growth of bacteria that have evolved resistance to the phage independent of previous phage infections.
Viruses can attach, or adsorb, to only a limited range of host bacteria (10). Host ranges are further limited by intracellular anti-viral strategies such as the CRISPR-Cas system (11). The resistance/sensitivity towards specific phages displayed by bacterial subgroups has historically been used to categorize bacterial strains into different phage types (Figure 4). Although the effectiveness of this method has now been surpassed by novel sequencing techniques, phage typing can still provide valuable information about bacteria-phage interactions, for instance, facilitating the design of a phage cocktail for clinical usage.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig4.jpg" /> 
Figure 4: Phage sensitivity of different bacterial strains. Soft agar plates with Cutibacterium acnes strain (A) AD27 and (B) AD35, were spotted with 21 different C. acnes bacteriophages. Only phage 11 were able to infect and kill AD27 while strain AD35 showed sensitivity towards all phages. This technique, termed phage typing, can be used to divide bacterial species and strains into different subgroups based on phage susceptibility.

Determining Viral Titer as Plaque Forming Units PFU

Ensaio de placa: um método para determinar o título viral como unidades formadoras de placa (PFU)

Source: Tilde Andersson1, Rolf Lood1
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 ...

Education

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Biologia Avançada

Microbiologia

An Assay to Quantify the Binding of Human Norovirus VLPs to Intestinal Bacteria

Source: Madrigal, J. L., et al. <a href="https://app.jove.com/v/61048">Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates an assay for quantifying human norovirus virus-like particles (VLPs) binding to human intestinal bacteria. The bacterial suspensions are mixed with the VLPs and incubated to allow the formation of VLP-bacteria complexes. The complexes are then labeled with fluorophore-tagged VLP-specific antibodies, followed by flow cytometry-based visualization and quantification to identify the percentage of VLP-bound bacteria.

Um ensaio para quantificar a ligação de VLPs de norovírus humano a bactérias intestinais

1. VLP-bacteria Attachment Assay
CAUTION: Human norovirus VLPs are a biosafety level (BSL)-2 hazard, and all work involving VLPs should be performed in a ...