Agradecemos a membros do laboratório Wobus para comentários críticos e sugestões. Trabalhar no laboratório de CEW foi financiado por fundos de arranque da Universidade de Michigan, uma bolsa de desenvolvimento de carreira a partir do Centro NIH / NIAID Regional de Excelência para a Bio-defesa e Emergentes de Pesquisa de Doenças Infecciosas (RCE) Programa, Região V &#39;Grande RCE Lakes &#39;(NIH prêmio 1-U54-AI-057153) e NIH R01 AI080611. MBG-H. foi financiado pelo Imunologia Experimental (NIH T32 A1007413-16) e os Mecanismos moleculares em Patogênese Microbiana (NIH T32 A1007528) bolsas de formação para a Universidade de Michigan. JBC foi financiado pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Brasília, Brasil.

1. A cultura da linha celular de macrófagos RAW 264.7 <ol><li> Manter células RAW 264.7 (ATCC, catálogo # TIB-71) em meio DMEM-10 media, que consiste em glucose alta DMEM com 10% (v / v) de endotoxina baixa de soro fetal bovino (&lt;10 EU / ml), Hepes 10 mM , 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 1 mM de não-aminoácidos essenciais, 2 mM de L-glutamina. As células são normalmente mantidas em 175 cm 2 frascos de cultura de tecidos contendo 35 ml de meio por frasco e incubaram-se a 37 ° C e 5% de CO 2 num incubador de cultura de tecido. Contudo, qualquer tamanho de balão pode ser usado com um volume de meio que seja apropriado para o tamanho do frasco. </li><li> Para dividir células: aspirar os meios velhos, adicionam-se 10 ml de DMEM fresco-10 media para as células e, em seguida, raspar as células a partir do fundo do balão, utilizando um raspador de células. Em seguida, voltar a suspender as células em uma solução homogénea através da elaboração de células para uma pipeta de 10 ml e com força pressionando as células através da ponta de pipeta prEssed contra o fundo do frasco. Repetir esta acção, pelo menos, 3 vezes de modo que as células já não clump juntos. Verificar por microscopia óptica que a suspensão de célula única foi gerada. Em seguida, transferir 1 ml (diluição de 1:10, ou ~ 1x10 7 células) - 2 ml (diluição 1:5 ou ~ 2x10 7 células) de suspensão de células para um novo 2 175 centímetros frasco, e perfazer um volume final de meio até 35 ml. </li><li> Dividir células quando elas são quase confluente (~ 1x10 8 células total/175 cm 2 frascos): de três em três dias, se começando com uma diluição de 1:10, ou de dois em dois dias, se começando com uma diluição de 1:5. Use microscopia de luz para verificar a morfologia das células antes de divisão de células. A maioria das células deve olhar em volta e não ativado. Células ativadas têm grânulos e / ou prolongado, espigado morfologia com apêndices. Não deixe overgrow células como essas células não costumam formar placas. Mantenha o controle do número de passagens e freqüentemente começar de descongelamento por uma alíquota menor passagem de células. (Usamos passagem 30 como um ponto de corte). </li></ol> 2. Infectar células RAW 264.7 com MNV inóculo <ol><li> Semente células RAW 264.7 em placas de 6 poços (3,5 cm de diâmetro) a uma densidade de 1x10 6 células viáveis ​​/ ml em DMEM-10 media, e adicionar 2 ml desta suspensão a cada poço. É importante para distribuir uniformemente as células nos poços de placas, quer por balançar à mão, pelo menos, 10 vezes ou utilizando um aparelho de balanço para ~ 10 min. Não redemoinho as placas como isso vai fazer com que as células de agrupamento, no centro do poço. Colocar em placas de cultura de tecido (incubadora a 37 ° C e 5% CO 2). Permitir que as células fixar durante a noite ou durante pelo menos 4 horas a 37 ° C. As células devem ser 60 - 80% confluentes para o ensaio de placa e distribuídos uniformemente por todo o poço. </li><li> No dia seguinte, preparar o inoculo de vírus, o que pode ser a partir de células infectadas com MNV em cultura de tecidos ou a partir de tecidos homogeneizados ou amostras de fezes de MNV camundongos infectados. Ao utilizar amostras de tecido, pi do tamanho de ervilhaECEs de tecidos são homogeneizados em 2 ml com tampa de rosca contendo contas de tubos estéreis de sílica em 1 mL de DMEM-10, utilizando um homogeneizador de tecidos (por exemplo, MagnaLyser; Roche). Para as amostras de fezes, não mais do que três pelotas fecais devem ser homogeneizadas em uma mídia ml. Todas as amostras são então congeladas (a -80 ° C) e descongelado uma vez antes de realizar o ensaio de placas fágicas. </li><li> Preparar diluições de 10 vezes do inoculo de vírus em DMEM completo meio-5, que consiste em DMEM / concentração elevada de glucose, 5% (v / v) de endotoxina baixa de soro fetal bovino (&lt;10 EU / ml), 10 mM de HEPES, 100 U / ml de penicilina, estreptomicina 100 ug / mL, 1 mM não-aminoácidos essenciais, 2 mM de L-glutamina. </li><li> Dez diluições em série são preparados em placas de 24 poços: A pipeta repetidora é usada para dispensar 1,35 ml de meio em poços múltiplos, a diluição 10 -1 é feita por mistura de 1,35 ml de meio e 0,15 ml de vírus contendo amostra, e em seguida, 0,15 ml de uma diluição 10 -1 é adicionado 1,35 ml de meios para fazer a 10 -2 dilution e assim por diante. É importante mudar dicas cada vez que você faz uma nova diluição. Uma pipeta multicanal pode ser usado para fazer as diluições de amostras múltiplas de cada vez com duas pontas encaixe para um poço de uma placa de 24 poços a transferência de um volume total de 0,15 ml por poço (ver Figura 3A). </li><li> Uma gama de diluição típico para homogenatos de tecido e conteúdos fecais é de 10 -1 a 10 -3. No entanto, as placas a partir dessas amostras tendem a ser menores em comparação com aqueles a partir de amostras de cultura de tecidos. Além disso, em alguns casos, uma diluição de 1:100 das amostras fecais é necessária para diluir suficientemente para fora quaisquer componentes tóxicos das fezes que podem perturbar a monocamada de células, impedindo assim a possibilidade de contar placas. A gama de diluição de lisados ​​de cultura de tecidos depende do ponto de tempo de interesse durante o ciclo de vida viral. Diluições que vão até 10 -9 pode ser necessária no pico da infecção. </li><li> Após as diluições em série são preparados, rotular a placa de 6 poçoss contendo RAW 264,7 monocamadas (da seção 2.1) com o nome da amostra e diluições sendo banhado. Uma placa de cada vez, remova todas as mídias sacudindo-o ou aspirar ele. Imediatamente depois adicionar 0,5 ml de uma amostra diluída para um poço, em seguida, repita com uma duplicata bem, antes de proceder à diluição seguinte. Uma vez que todos os três diluições são adicionados a uma placa de inclinação da placa, e para trás com a mão para garantir que todas as células foram cobertas. Manipular uma placa de cada vez para assegurar que as células não sequem. </li><li> Após a adição de 0,5 ml das diluições de cada poço, a pilha de placas de pé e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. Uma vez que o volume adicionado a cada poço, não é suficiente para cobrir completamente a monocamada, as placas têm de ser suavemente inclinada para trás e para a frente com a mão cada 10-15 minutos ou colocada num aparelho de balanço (~ 18 oscilações por minuto). Isso evita que as células de secagem. </li></ol> 3. Baixo ponto de fusão de agarose (SeaPlaque) Preparação Overlay <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Nota: é aconselhável ter várias garrafas com autoclavado SeaPlaque agarose preparado antes do tempo. De agarose podem ser re-fundidas num forno de microondas antes de usar. <ol><li> Calcular a quantidade de sobreposição necessário para o volume total de placas, antes de 1 h de incubação estiver completa. O volume necessário é de 2 ml / cavidade ou 12 ml/6-well placa. Prepare agarose (ver secção 3.2) e media (ver secção 3.3) separadamente. </li><li> Para preparar a agarose, suspender 3 g de agarose SeaPlaque, num volume total de 100 ml de água destilada (3% w / v) num frasco de vidro. Autoclave por 20-30 min. (Se agarose foi já preparado de antemão, re-fundida de agarose em microondas.) É importante equilibrar SeaPlaque agarose a 42 ° C num banho de água antes da sua utilização, porque se a agarose é muito quente, que vai matar as células. Certifique-se o nível de água é igual a ou superior ao nível de agarose a fim de evitar a solidificação indesejável. </li><li> Para preparar os meios de comunicação: fazer 100 ml de 2x MEM mídia, que consiste em2x MEM, 10% (v / v) de endotoxina de soro fetal bovino baixo (&lt;10 EU / ml), 10 mM de HEPES, 100 U / ml de penicilina, 100 ug de estreptomicina / ml, 4 mM de L-glutamina. Equilibre media a 37 ° C num banho de água. </li><li> Misturar ambas a agarose SeaPlaque e os meios de comunicação MEM 2x juntos em um frasco estéril a uma razão de 1:1 imediatamente antes de sobrepor as monocamadas de células infectadas. Se houver mais do que 200 ml de sobreposição é necessário, o volume de divisão em várias garrafas e manter-se em 37 ° C banho de água até que esteja pronto para uso. </li><li> No final da incubação de 1 hora (ver secção 2.7), aspirar o inoculo a partir de cada poço. Lentamente, adicionar 2 ml de sobreposição para a extremidade de cada poço, colocando a ponta da pipeta contra a parede de cada poço. Até 5 placas podem ser tratadas simultaneamente, sem células secar. </li><li> Permitir a sobreposição de solidificar durante aproximadamente 10 min à temperatura ambiente, antes de colocar as placas na vertical para o tecido incubadora de cultura. Incubar as placas durante 48 horas a 37 ° C em 5% de CO 2. </li><li> Depoiso período de incubação, as placas são fracamente visíveis a olho nu, de modo a verificar as placas não coradas para a presença de placas. Se não houver placas são visíveis, incubar por um adicional de 4 horas e verifique novamente. No entanto, o tempo máximo de incubação não deve exceder 72 horas. </li></ol> 4. A visualização das placas por coloração com vermelho neutro <ol><li> Para visualizar as placas, a solução de coloração de vermelho neutro é preparada por adição de 3 ml de vermelho neutro (0,33% w / v em DPBS; Sigma, catálogo # N2889) a cada ml 97 de 1x PBS (grau de cultura de tecidos, Mg 2 + -, Ca 2 + - livre; Gibco, catalogo 10010). Calcula-se o volume da solução de coloração de vermelho neutro necessário para a experiência: 12 ml de solução de coloração de vermelho neutro são necessários para cada placa de 6 poços. Em seguida, adicionar 2 ml a cada poço. Apesar de alguns protocolos de ensaio em placa requer a tomada de agarose para ser removido dos poços, neste protocolo a solução de coloração de vermelho neutro é adicionado directamente sobre a cobertura. </li><li> Depois de uma hora um emcubation a 37 ° C, verifica se as placas são visíveis com solução de coloração de vermelho neutro ainda em poços. Se as placas não são facilmente visíveis, permita a coloração para continuar por mais um hora. Continuar a incubação até que as placas são visíveis. (Nota:. Staining durante mais de 3 horas não é o ideal e, se não placas são visíveis na amostra de controlo positivo, após 3 horas de coloração, o ensaio de placa não funcionar adequadamente) Após a coloração for completa, aspirar a solução de coloração de vermelho neutro , garantindo a ficha de agarose não é perturbada, e então proceder à contagem das placas. </li><li> Conte placas colocando placa de cabeça para baixo em uma caixa de luz e marcando um ponto em placas contados para evitar contagens duplicadas. Escolher a diluição para contar placas em poços de placas, onde estão claramente separados (isto é, sem evidência visual de fusão placas em conjunto). Se possível, a contagem de placas, duas diluições. É importante notar que o tamanho da placa pode variar entre estirpes MNV, inoculo de vírus, e depende docondição das células RAW 264.7, durante o ensaio de placas fágicas. </li><li> Se não houver placas são visíveis num poço, não houve qualquer vírus presente na amostra ou a quantidade de vírus foi abaixo do limite de detecção do ensaio de placas. Neste caso, os poços mancha vermelha com uma cor semelhante como outros placa contendo poços. Alternativamente, a ausência de placas é também observada quando existem demasiados partículas virais presentes em uma dada diluição. Isto leva à lise da monocamada inteiro e poços aparecer laranja / amarelo. </li><li> Calcular os títulos virais. Adicionar o número de placas em ambos os poços com uma diluição única e multiplicar pelo factor de diluição (isto é, se 1 ml 2 poços estão infectados com 0,5 ml). O resultado será a quantidade de unidades formadoras de placas (PFU) no seu volume de inoculo de 1 ml. Por exemplo, na Figura 4, na diluição 10 -2, um poço (marcado &quot;II&quot;) possui 14 placas e o outro bem (marcado &quot;V&quot;) possui 17 placas. Assim, o título viral será de 14x10 2 + 2 = 17x10 3100 (3.1x10 3) pfu / ml. </li></ol> 5. Resultados representativos Infecciosas MNV-1 partículas pode ser quantificada utilizando um ensaio de placas como descrito esquematicamente na Figura 1. Figura 2A mostra um poço com monocamada de células RAW 264.7 imediatamente antes da infecção, enquanto que a Figura 2B mostra três placas visíveis indicadas por números romanos I, II e III em um poço. Passos individuais do ensaio estão representados nas Figuras 3A a F. A Figura 3A mostra a preparação de diluições em série de 10 vezes de uma amostra contendo vírus. Figura 3B mostra a transferência de diluições em duplicado de uma placa de 6 poços. Figura 3C mostra o aparelho de balanço usado para incubar células RAW 264.7 com o inoculo à temperatura ambiente durante 1 hr a Figura 3D mostra células sendo sobreposto com o SeaPlaque:. MEMmistura. Figura 3E mostra uma placa à temperatura ambiente para permitir a sobreposição de solidificar, enquanto que a Figura 3F mostra células a ser coradas com uma solução de 0,01% de vermelho neutro 48 h mais tarde. Depois da coloração das células para hr 1-3 e aspirando a solução de coloração de vermelho neutro, placas são visíveis e podem ser contadas (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemática do protocolo de ensaio em placa MNV. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig2.jpg" /> Figura 2. Imagens representativas de um poço de uma monocamada antes da infecção e depois da formação de placas. A) células RAW 264.7 foram cultivadas durante a noite e fotografada com um microscópio de luz com ampliação de 20x. B) As células foram coradas com uma solução de 0,01% de vermelho neutro ao fim de 48 hr de infecção e visualizados sob um microscópio de luz com uma ampliação de 4x. Números romanos I, II, e III indicam três placas visíveis. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig3.jpg" /> Figura 3. Imagens representativas das diferentes etapas do ensaio de placa. A) MNV-1 inóculo é preparado em diluições de 10 vezes. B) O inoculo é adicionado a monocamadas de células em cavidades duplicadas. C) As células e de inoculo são incubadas por balançar durante 1 h à temperatura ambiente. D) As células são revestidas com uma mistura 1:1 de agarose SeaPlaque e MEM 2x media. E) As placas são incubadas durante 10 min à temperatura ambiente para permitir a sobreposição de solidificar. F) A coloração das células com a solução de coloração de vermelho neutro 48 h pós-infecção. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig4.jpg" /> Placas Figura 4. MNV-1 formas na célula monolAyers. Mostrado aqui é uma placa de ensaio representativo da placa 48 horas pós-infecção, mostrando as placas coradas com solução de coloração de vermelho neutro, após 1 h de incubação. A placa apresenta cavidades em duplicado de três diluições de 10 vezes. Wells rotulados com números romanos I e IV correspondem à diluição 10-1; II e V correspondem à diluição 10-2; III e VI correspondem à diluição 10-3. O título viral da amostra é indicado abaixo (ver Seção 4.5 para obter detalhes sobre o cálculo).

<ol>
	<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages.">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432 (2004).</li><li>Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+norovirus:+a+model+system+to+study+norovirus+biology+and+pathogenesis.">Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis.</a> Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).</li><li>Condit, R. C., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Fields Virology. 1, 25-58 (2007).</li><li>Thackray, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+noroviruses+comprising+a+single+genogroup+exhibit+biological+diversity+despite+limited+sequence+divergence.">Murine noroviruses comprising a single genogroup exhibit biological diversity despite limited sequence divergence.</a> Journal of virology. 81, 10460-10473 (2007).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+estimating+50%+endpoints.">A simple method for estimating 50% endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1932).</li><li>Chachu, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+is+critical+for+the+clearance+of+murine+norovirus+infection.">Antibody is critical for the clearance of murine norovirus infection.</a> Journal of virology. 82, 6610-6617 (2008).</li><li>Barron, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+murine+norovirus+strains+isolated+from+asymptomatic+mice+of+different+genetic+backgrounds+within+a+single+U.S.+research+institute.">Diversity of murine norovirus strains isolated from asymptomatic mice of different genetic backgrounds within a single U.S. research institute.</a> PLoS ONE. 6, e21435 (2011).</li><li>Cox, C., Cao, S., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+and+study+of+murine+norovirus-1+using+a+more+efficient+microglial+cell+line.">Enhanced detection and study of murine norovirus-1 using a more efficient microglial cell line.</a> Virology journal. 6, 196 (2009).</li><li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li><li>Hyde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+norovirus+replication+is+associated+with+virus-induced+vesicle+clusters+originating+from+membranes+derived+from+the+secretory+pathway.">Mouse norovirus replication is associated with virus-induced vesicle clusters originating from membranes derived from the secretory pathway.</a> Journal of virology. 83, 9709-9719 (2009).</li><li>Simmonds, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+and+functional+analysis+of+RNA+secondary+structure+elements+among+different+genera+of+human+and+animal+caliciviruses.">Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among different genera of human and animal caliciviruses.</a> Nucleic acids research. 36, 2530-2546 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método de ensaio de placa para MNV-1 aqui apresentado é uma forma de quantificar partículas infecciosas MNV. Seguindo os passos de ensaio ilustrado na Figura 3, pode-se obter títulos virais reprodutíveis. O limite de detecção do ensaio depende da diluição de partida utilizado. Ao iniciar com uma diluição de 1:10 da amostra, tal como descrito acima, o limite de detecção do ensaio de placa é de 10 pfu (isto é, uma placa visível na diluição 10 -1). Uma vez que cada placa representa um único vírus, o ensaio de placa pode também ser utilizado para purificar as populações clonais de MNV escolhendo placas isoladas e propagando-los conforme descrito anteriormente 1. Além disso, a purificação de placas também pode ser usado para separar uma população de vírus individuais a partir de populações mistas de vírus. Uma limitação do uso de um ensaio de placas para a detecção de infecção MNV é que nem todas as estirpes mnv formar placas 4. No entanto, pode ser possível ultrapassar o inabilidade de algumas estirpes de MNV, isolados a partir de animais, para formar placas em série passaging destes vírus em cultura de tecido 7. Uma alternativa para o ensaio de placa é o de medir partículas infecciosas por meio da técnica de TCID 50 3, 4. Este ensaio quantifica a quantidade de vírus necessária para produzir CPE em 50% das células de cultura de tecidos inoculadas seguintes diluições de ponto de extremidade e leva 1 semana para completar para MNV 4. Além de ser mais lento do que um ensaio de placa, o ensaio de TCID 50 também não é tão sensível (limite de detecção = 200 TCID 50 / ml), devido à toxicidade de amostras de tecido de células RAW 264.7 4. Embora passos críticos no âmbito do protocolo foram descritos ao longo do protocolo, a seção seguinte apresenta um resumo para facilitar a resolução de problemas. Os passos mais importantes do protocolo é o de assegurar que as células RAW 264.7 permanecem viáveis ​​ao longo do ensaio para suportar a replicação do vírus. Isto podeser monitorizado em cada fase do ensaio por meio de microscopia de luz. A viabilidade celular é assegurada de duas maneiras. Primeiro, deve ser tomado cuidado para não deixar secar as células durante o manuseio de placas. Assim, as placas são inoculadas um de cada vez, agitou durante o período de infecção, e devem permanecer fechadas quando não estão a ser tratadas. Em segundo lugar, as soluções adicionado em células devem ser equilibradas para ~ 37 ° C. Além disso, é essencial para a saúde geral das células RAW 264.7 de mantê-las em meio contendo soro de endotoxina baixa (&lt;10 EU / ml), o que limita a activação de células. Além disso, observou-se uma maior taxa de falha do teste de placa quando são usadas células de passagem 30 ou superior. Embora isso provavelmente irá variar de laboratório para laboratório, é importante incluir um controlo positivo (por exemplo, uma amostra com um título conhecido viral) para assegurar títulos reprodutíveis, especialmente quando se utiliza mais elevadas de passagem células RAW 264.7. Para limitar a utilização de células mais elevadas de passagem, é aconselhável congelar frascos de Passa precocecélulas ge após o recebimento de células RAW 264.7 e iniciar uma nova cultura dos frascos congelados freqüência. Começando por cima, com culturas de células de passagem baixa também será útil quando as células apresentam características alteradas, tais como a incapacidade de aderir, as alterações na morfologia celular (por exemplo, de volta para espigado e espalhar-se), ou quando a contaminação por micoplasma foi detectado. Outro ponto importante a prestar atenção é para garantir que ponteiras são trocadas entre as amostras e durante diluições. Isto irá assegurar precisas diluições seriadas e evitar a contaminação cruzada entre as amostras. O primeiro passo no protocolo em que a ponta da pipeta mesmo pode ser utilizado de novo, quando é diluições em série de uma mesma amostra são adicionados aos poços. Nesse caso, a pessoa deve começar a partir do inóculo mais diluído para o mínimo, e vigorosamente pipetar cima e para baixo ao elaborar uma nova diluição. O protocolo de ensaio de placa pode ser alterada a várias modificações. Uma modificação que pode ser feita quando taqui não são suficientes para a inoculação de células de poços em duplicado é apenas para inocular um único poço de cada diluição. No entanto, uma vez que o volume de inoculo é de 0,5 ml, o número de placas, em seguida, tem de ser multiplicado por um factor de 2 para normalizar a pfu / ml. O ensaio de placa pode também ser adaptado para utilização com qualquer linha celular aderente outro que é capaz de suportar a replicação de MNV, e esta tem sido descrita para a linha microglial murino BV-2 de 8 células. Outras modificações que podem ser aplicadas são as adaptações que foram descritas para os protocolos de ensaio de placas desenvolvidas em outros vírus. Em caso de MNV, as seguintes modificações já foram implementadas com sucesso, a utilização de celulose de metilo em vez de agarose Sea Plaque 9, e coloração das células com violeta de cristal ou azul de metileno em vez de vermelho neutro 10, 11. No geral, este protocolo pode ser facilmente adaptado, conforme necessário para quantificar outros formadoras de placas de vírus ou utilizados para other vírus que causam infecções líticas em RAW 264,7 células, tornando-se uma ferramenta útil para quantificar partículas virais infecciosas em geral.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> DMEM / glicose alta </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.02 </td></tr><tr><td> 2x MEM </td><td> Gibco </td><td> 11935 </td></tr><tr><td> 100x penicilina e estreptomicina </td><td> Hyclone </td><td> SV30010 </td></tr><tr><td> 10 mM não-aminoácidos essenciais </td><td> Hyclone </td><td> SH30238.01 </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> Hyclone </td><td> SH30237.01 </td></tr><tr><td> 200 mM (100x), L-glutamina </td><td> Hyclone </td><td> SH30034.01 </td></tr><tr><td> Soro Fetal Bovino </td><td> Gibco, Hyclone </td><td> 10437, SH30070.02 </td></tr><tr><td> Mar Plaque Agarose </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> Neutral Red 0,33% </td><td> Sigma </td><td&gt; N2889 </td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010 </td></tr><tr><td> 1,0 milímetros de zircônia / sílica contas </td><td> Produtos Biospec </td><td> 11079110z </td></tr><tr><td> Modelo Rocker Velocidade 35 </td><td> Labnet </td><td> S2035 </td></tr><tr><td> Instrumento Lyser Magna </td><td> Roche </td><td> 03358968001 </td></tr><tr><td> Linha de células RAW 264.7 </td><td> ATCC </td><td> TIB-71 </td></tr><tr><td> De cultura de tecidos incubadora </td><td> Sanyo </td><td> MCO-18AIC </td></tr></tbody></table>

plaque assay for murine norovirus

Norovirus murino (MNV) é o único membro do género Norovirus que cresce de forma eficiente em cultura de tecido 1, 2. A lise celular e efeito citopático (CPE), são observados durante MNV-1 infecção de células dendríticas ou macrófagos murinos 1. Esta propriedade de MNV-1 pode ser utilizado para quantificar o número de partículas infecciosas de uma amostra dada pela realização de um ensaio de placas 1. O ensaio de placa depende da capacidade de MNV-1 para lisar as células e para formar buracos em uma monocamada confluente de células, as quais são chamadas placas 3. Várias técnicas podem ser usadas para detectar infecções virais em culturas de tecidos, o tecido colhido, clínicas e amostras ambientais, mas não toda a medida do número de partículas infecciosas (por exemplo, qRT-PCR). Uma forma de quantificar partículas virais infecciosas é realizar um ensaio de placa 3, que será descrita em detalhe abaixo. Uma variação no ensaio de placa é o flúor MNVensaio de focagem escent, onde o antigénio é MNV imunocoradas em monocamadas de células 4. Este ensaio pode ser mais rápido, uma vez que a expressão do antigénio viral precede a formação de placa. Também é útil para a titulação de vírus incapazes de formar placas. No entanto, o ensaio de foco fluorescente exige recursos adicionais para além dos do ensaio de placa, tais como anticorpos e um microscópio para contagem de unidades formadoras de foco. Infecciosa MNV pode também ser quantificada por meio da determinação dos 50% Dose infecciosa em cultura de tecidos (TCID 50) 3. Este ensaio mede a quantidade de vírus necessária para produzir CPE em 50% das células de cultura de tecidos inoculadas por titulação de ponto de extremidade 5. No entanto, o seu limite de detecção é maior em comparação com um ensaio de placa 4. Neste artigo, descreve-se um protocolo de ensaio de placa que podem ser usados ​​para determinar de forma eficaz o número de partículas infecciosas mnv presentes nas amostras biológicas ou ambientais 1, 4, 6. Este método é based sobre a preparação de diluições de 10 vezes em série de amostras contendo MNV, que são utilizados para inocular uma monocamada de células permissivas (células RAW 264.7 de macrófagos murinos). Vírus é permitido para anexar a monocamada de células durante um determinado período de tempo e, em seguida, aspirado antes de cobrir as células com uma mistura de agarose e meio de cultura celular. O agar permite a propagação da descendência virai de células vizinhas, enquanto limita a propagação de células distantemente localizado. Em consequência, as células infectadas são lisadas e os furos formam na monocamada conhecidos como placas. Após a propagação de vírus suficiente, as placas tornam-se visíveis após a coloração das células com corantes, como o vermelho neutro, azul de metileno ou violeta de cristal. Em diluições baixas, cada placa origina de uma partícula infecciosa viral e sua descendência, que se espalhou para as células vizinhas. Assim, a contagem do número de placas permite calcular unidades formadoras de placas (PFU) presentes na amostra não diluída 3.

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Plaque Assay for Murine Norovirus

Descrevemos aqui um método para quantificar a partículas infecciosas de norovirus murino (MNV), que é o único que norovirus replica eficientemente em cultura celular. O ensaio de placas aproveita tropismo MNV por macrófagos murinos e pode ser adaptado para utilização com amostras biológicas ou ambientais que contenham MNV.

Ensaio de placas para Norovirus Murine

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

54.2K visualizações.  University of Michigan, Ann Arbor. Descrevemos aqui um método para quantificar a partículas infecciosas de norovirus murino (MNV), que é o único que norovirus replica eficientemente em cultura celular. O ensaio de placas aproveita tropismo MNV por macrófagos murinos e pode ser adaptado para utilização com amostras biológicas ou ambientais que contenham MNV.

Vídeo: Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

Modelo murino de CD40-ativação de células B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Imunologia e Infecção

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Análise por Citometria de fluxo das células imunológicas Dentro aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close person-to-person contact cannot be avoided 1, 2. During the last few years an increase in the incidence of outbreaks in hospitals has been reported, causing significant disruptions to their operational capacity as well as large economic losses. The identification of new antiviral approaches has been limited due to the inability of human noroviruses to complete a productive infection in cell culture 3. The recent isolation of a murine norovirus (MNV), closely related to human norovirus 4 but which can be propagated in cells 5 has opened new avenues for the investigation of these pathogens 6, 7. 
MNV replication results in the synthesis of new positive sense genomic and subgenomic RNA molecules, the latter of which corresponds to the last third of the viral genome (Figure 1). MNV contains four different open reading frames (ORFs), of which ORF1 occupies most of the genome and encodes seven non-structural proteins (NS1-7) released from a polyprotein precursor. ORF2 and ORF3 are contained within the subgenomic RNA region and encode the capsid proteins (VP1 and VP2, respectively) (Figure 1). Recently, we have identified that additional ORF4 overlapping ORF2 but in a different reading frame is functional and encodes for a mitochondrial localised virulence factor (VF1) 8.
Replication for positive sense RNA viruses, including noroviruses, takes place in the cytoplasm resulting in the synthesis of new uncapped RNA genomes. To promote viral translation, viruses exploit different strategies aimed at recruiting the cellular protein synthesis machinery 9-11. Interestingly, norovirus translation is driven by the multifunctional viral protein-primer VPg covalently linked to the 5' end of both genomic and subgenomic RNAs 12-14. This sophisticated mechanism of translation is likely to be a major factor in the limited efficiency of viral recovery by conventional reverse genetics approaches. 
Here we report two different strategies based on the generation of murine norovirus-1 (referred to as MNV herewith) transcripts capped at the 5' end. One of the methods involves both in vitro synthesis and capping of viral RNA, whereas the second approach entails the transcription of MNV cDNA in cells expressing T7 RNA polymerase. The availability of these reverse genetics systems for the study of MNV and a small animal model has provided an unprecedented ability to dissect the role of viral sequences in replication and pathogenesis 15-17.

Noroviruses are a major cause of gastroenteritis yet molecular techniques for their characterisation are still relatively new. Here we report two different reverse genetics approaches for the efficient recovery of murine norovirus (MNV), the only member of this genus which can be propagated in cell culture.

Recuperação de reversão genética mediada por norovírus Murina Infecciosas

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

Isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo murino

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Concentração Determinação Viral Através de placa Ensaios: Usando tradicionais e novos Sistemas de sobreposição

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Um modelo murino de Grupo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonização Vaginal

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Swab método de amostragem para a detecção do norovírus Humano em Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain insight into an ongoing disease state.
Here, a simple and efficient method is described to perform BAL on murine lungs without the need of special tools or equipment. BAL fluid is isolated by inserting a catheter in the trachea of terminally anesthetized mice, through which a saline solution is instilled into the bronchioles. The instilled fluid is gently retracted to maximize BAL fluid retrieval and to minimize shearing forces. This technique allows the viability, function, and structure of cells within the airways and BAL fluid to be preserved.
Numerous techniques may be applied to gain further understanding of the disease state of the lung. Here, a commonly used technique for the identification and enumeration of different types of immune cells is described, where&#160;flow cytometry is combined with a select panel of fluorescently labeled cell surface-specific markers. The BAL procedure presented here can also be used to analyze infectious agents, fluid constituents, or inhaled particles within murine lungs.

The health status of the lung is reflected by the type and number of immune cells that are present in the bronchioles of the lung. We describe a bronchoalveolar lavage technique that allows the isolation and study of nonadherent cells and soluble factors from the lower respiratory tract of mice.

Lavagem Broncoalveolar de Pulmões Murinos para Analisar a Infiltração de Células Inflamatórias

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, including cell biology, oncology, dentistry, and immunology. The SMG is an exocrine gland comprised of secretory epithelial cells, myofibroblasts, endothelial cells, nerves, and extracellular matrix. Dynamic cellular processes in the rat and mouse SMG have previously been imaged, mostly using inverted multi-photon microscope systems. Here, we describe a straightforward protocol for the surgical preparation and stabilization of the murine SMG in anesthetized mice for in vivo imaging with upright multi-photon microscope systems. We present representative intravital image sets of endogenous and adoptively transferred fluorescent cells, including the labeling of blood vessels or salivary ducts and second harmonic generation to visualize fibrillar collagen. In sum, our protocol allows for surgical preparation of mouse salivary glands in upright microscopy systems, which are commonly used for intravital imaging in the field of immunology.

We describe a protocol to surgically expose and stabilize the murine submandibular salivary gland for intravital imaging using upright intravital microscopy. This protocol is easily adaptable to other exocrine glands of the head and neck region of mice and other small rodents.

Preparação de murino das glândulas salivares Submandibular para microscopia Intravital vertical

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;

Methods Article

Ensaio de placas para Norovirus Murine