A técnica que propomos aqui nos permite superar as limitações dos protocolos manuais de lesões, reduzindo os danos aos tecidos adjacentes e melhorando a reprodutibilidade, mesmo para operadores inexperientes. Esta técnica nos permite escolher precisamente onde induzir a lesão sem danificar os tecidos circundantes graças à capilaridade de vidro rotativa combinada com um laser UV direcionado. Muitas etapas estão envolvidas na operação do equipamento VAST, por isso recomendo marcar cada passo que você for, a fim de garantir que tudo seja feito corretamente.
Comece anestesiando as larvas usando o meio contendo o anestésico e, em seguida, transfira-as para uma placa de 96 poços contendo 300 microliters de médio por poço. Ligue todos os componentes do sistema, incluindo o laser para ablação. Em seguida, inicie a imagem automatizada de zebrafish, ou software VAST, escolha Placa na primeira janela e clique no botão Done.
Uma pequena janela aparecerá perguntando se o capilar está vazio e limpo. Verifique a imagem do capilar para obter bolhas de ar dentro. Se não houver bolhas de ar dentro, clique em Sim na janela estourada.
Em seguida, na janela Sampler LP, vá para o menu Arquivo e selecione a opção Abrir script. Escolha um arquivo contendo o script correspondente ao experimento a ser realizado. Em seguida, na janela principal do software VAST, vá para File e escolha o experimento Aberto.
Escolha o arquivo de experimento correspondente ao experimento planejado. Inicie o software ImageJ/Fiji, vá para o menu Arquivo e escolha novo script para abrir a janela do script. Em seguida, vá para o menu Arquivo e escolha Abrir para carregar o script de lesão a laser.
Em seguida, para lançar o Python IDE, vá para o menu Arquivo e escolha abrir arquivo para carregar o script para gerenciar o laser. Em seguida, clique no menu Executar e escolha Executar sem depuração para executar o script. Certifique-se de que uma sequência de mensagens no painel do terminal apareça junto com algum ruído enquanto o atenuante a laser é inicializado.
Na janela principal do software VAST, clique nos botões de seta para mover o palco e centralizar o capilar em relação ao objetivo do microscópio. Olhe através das oculares e foque na parte superior do capilar usando a luz transmitida do microscópio. Coloque uma placa de 96 poços contendo as larvas no porta-placas esquerdas do amostrador LP.
Em seguida, coloque outra placa para coleta no suporte da placa direita do sampler. Certifique-se de que o poço A1 da placa está no canto esquerdo dianteiro do suporte. Na janela LP Sampler do software VAST, clique no botão de modelo Placa e selecione todos os poços que contêm larvas.
Clique no botão OK para validar e fechar a janela. Em seguida, clique no botão Executar placa na janela Sampler LP para começar a carregar a larva. Em seguida, vá para o software de microscópio e clique no botão Live para imagem da larva.
Ligue o botão de foco do microscópio até que o canal central da medula espinhal esteja visível. Tire uma foto em fluorescência e salve a imagem em uma pasta. Abra a imagem no ImageJ e ajuste o contraste, se necessário.
Clique na ferramenta de linha região de interesse e desenhe uma linha curta centrada na medula espinhal. Mude o microscópio para uma posição espelhada 100%. Carregue o script ImageJ e defina Repetição para 2, Amostra para 1, Largura para 40 mícrons e Atenuação para 89.
Depois de definir todos os parâmetros, clique no botão OK. Quando a sequência de tiro laser estiver terminada, mude para imagens de fluorescência no software de imagem e ajuste o foco. Tire uma nova foto e salve-a.
Abra esta nova imagem no ImageJ e desenhe uma nova linha maior que a própria medula espinhal. Mude o microscópio para uma posição espelhada 100%. Vá para a janela de script ImageJ e defina Repetição para 2, Amostra para 1, Largura para 40 mícrons e Atenuação para 89.
Depois de definir todos os parâmetros, clique no botão OK. Quando a sequência de tiro a laser estiver concluída, verifique a qualidade da transeção por fluorescência de imagem e foco. Certifique-se de que nenhuma célula ou axônios permaneçam intactos no local da lesão.
Vá para a janela principal do software VAST e clique no botão Coletar para coletar as larvas lesionadas na placa vazia de 96 poços. Em seguida, clique na luz da bandeja da caixa de seleção para ligar a luz do sistema VAST. Retire a larva da placa de 96 poços o mais rápido possível, e transfira-as para uma placa de Petri limpa com água de peixe doce para a larva recuperar a pós-lesão.
Coloque a placa de Petri em uma incubadora a 28 graus Celsius. A imuno-coloração de tubulina acetilada e a imagem de cálcio indicam que a lesão a laser interrompe completamente a continuidade do tecido espinhal. Uma medula espinhal intacta é mostrada nesta imagem.
Uma interrupção completa dos axônios entre os lados caudal e rostral da lesão confirma a transeção completa da medula espinhal. Um exemplo de transeção incompleta é mostrado aqui. A medula espinhal transectada em uma larva NBTG cAMP 6-S é mostrada nesta imagem.
Os retângulos mostram os ROIs usados para quantificar a intensidade da fluorescência nos lados rostral e caudal das lesões. A imagem gráfica representa a mudança de intensidade de fluorescência ao longo do tempo nos ROIs de análise rostral e caudal. As imagens de fluorescência de projeção de intensidade máxima de uma larva NBT:dsRed antes da lesão do laser, após três horas, 24 horas e 48 horas da lesão laser são mostradas aqui.
Após 24 horas após a lesão, as feridas começaram a se fechar, levando a uma restauração parcial da estrutura inicial da medula espinhal após 48 horas. Uma reconexão funcional parcial foi confirmada após 48 horas após a lesão por meio de imagem de cálcio. A razão entre a amplitude dos picos na área caudal e na área rostral mostrou um aumento entre 3, 24 e 48 horas após a lesão.
O recrutamento de macrófagos foi observado após lesões a laser utilizando lesões laser NBT:dsRed mpeg1 GFP. Não foi observada diferença no número de células rotuladas entre lesões manuais e laser. Os peixes não-educulados apresentaram menos células de dupla rotulagem do que os peixes lesados em ambas as condições de lesão.
A lesão a laser induz menos dano muscular e de pele do que lesão manual. É fundamental verificar se a lesão está completa ou não. Nenhuma célula ou estrutura intacta deve ser visível na área da lesão, apenas um fundo escuro.
Para estudar a regeneração da medula espinhal, usamos muitos métodos, incluindo imuno-histoquímica e imagem de cálcio. É importante ressaltar que também podemos fazer eletrofisiologia, pois o tecido pode suportar a dissecção, ao contrário dos animais com lesões manuais. Esta nova técnica permite estudar quantitativamente a organização estrutural e funcional do tecido na medula espinhal após a lesão, permitindo lesões reprodutíveis e controladas.
