Funding for this work, GTK, TK, and JDM were provided by the Wisconsin Institute for Discovery and the Wisconsin Alumni Research Foundation.

1. Geração elastoméricos selos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Para gerar mestres de silício do selo PDMS, padrões de design característica da fotomáscara usando software de desenho assistido por computador. <ol><li> Design o primeiro padrão como uma matriz de 20 x 20 dos anéis com 300 mm de diâmetro interno (ID) e 600 mm OD com 1.200 mm de espaçamento de centro a centro. </li><li> Projetar o segundo padrão como 20 x 20 matriz de anéis com 600 mm ID e 900 mm OD com 1.200 mm de espaçamento de centro a centro. </li><li> Além disso, coloque 1 x 1 milímetro duas marcas de referência quadrados em todos os quatro cantos de cada projeto leque espaçados 1.200 mm de centro a centro do padrão de canto em um ângulo de 45 °. </li><li> Fabricar os mestres de silício para utilização neste experimento com 1: 1 proporções, correlacionando a uma profundidade de 300 mm característica usando técnicas de litografia padrão detalhados em outros lugares 15 ou em colaboração com uma fundição de microfluídica. NOTA: Característica profundidades menores do que 100 mm pode levar à deformação anormal de carimbos anteriores ao contacto com superfícies de substrato. NOTA: Este protocolo começa com ter mestres de silício já obtidos com os padrões descritos de fotorresiste, o que exige equipamento especializado e quartos limpos para criar. É melhor consultar com uma facilidade fabricante ou núcleo para criar esses mestres estampados. </li></ol></li><li> Mestres de silício silanizar O / N de incubação com (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) vapor trichlorosilane. NOTA: Silano vapor é altamente tóxico e só deve ser manipulado em uma coifa química. </li><li> Criar réplicas inversa dos mestres de silício por cura de uma proporção de 10: 1 de PDMS pré-polímero e agente de PDMS em cima dos mestres de silício silanizadas de cura numa placa de Petri S / N a 60 ° C. </li><li> Remover os selos de PDMS com os mestres de silício, e unir os selos para acrilonitrila-butadieno-estireno (ABS) backings ou qualquer outro material rígidos usando cola. NOTA: O material de escolha não necessita de ser transparente ou biocompatível. No entanto, ele deve fornecer uma superfície plana para a interface com o ferramental robótico e maior rigidez do que o PDMS. </li></ol> 2. Preparar Coverslides <ol style="margin-left: 40px;"><li> Coverslides microscópio de enxaguamento (24 milímetros x 50 mm # 1) em tolueno, metanol e sonicado em acetona durante 1 minuto antes da lavagem com etanol e secagem sob uma corrente de azoto suave. NOTA: Manusear tolueno e acetona apenas em uma coifa química. </li><li> Coverslides revestimento com ~ 3,5 nm de titânio (Ti), seguido de 18,0 nm de ouro (Au), utilizando um evaporador de feixe de electrões focado. NOTA: Este procedimento é compatível com uma variedade de substratos revestidos a ouro, incluindo silicone e poliestireno. Embora seja possível gerar estes no local, substratos revestidos a ouro, também estão disponíveis através de fornecedores comerciais. NOTA: As camadas de Ti deve ser de pelo menos 3 nm de espessura, enquanto Au camadas em substratos deve ser umt menos 5 nm de espessura e pode variar todo o caminho até um milímetro de espessura, dependendo das propriedades ópticas ideais do substrato final 16,17. Substratos não são obrigadas a ser opticamente transparente para a fabricação; no entanto, isso facilita a análise microscópica de substratos fabricados. </li><li> Lavar coverslides revestido de ouro com etanol e seco sob atmosfera de azoto suave imediatamente antes da utilização. </li></ol> 3. R-μCP do anel externo <ol style="margin-left: 40px;"><li> Antes R-μCP com o sistema compatível seletivamente braço robótico articulado (SCARA), calibrar os efetores de ferramentas robóticas e sistemas de dupla câmara de acompanhamento, utilizando o software do sistema. NOTA: Estes instrumentos são retratados na Figura 1. </li></ol><img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/52186/52186fig1highres.jpg" /> Figura 1. R- μCP Sistema e Robotic Arm Tooling. </strong&gt; (A) vista em grande escala do sistema de R-μCP com todas as ferramentas e utensílios, (a) chuck vácuo, (b) banho de reagente, (c) para baixo da câmera, (d) fixação de nidificação selo, (e) robótica ferramenta. (B) Braço robótico ferramental retratando (f) ferramenta de gravura com ponta de diamante e (g) ferramenta de sucção pneumática segurando um (h) PDMS selo lastreados em ABS. <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> Colocar manualmente um carimbo de PDMS com 600 mm ID e 900 mm OD saliente anéis face para baixo no suporte de nidificação de selo. Colocar manualmente um coverslide revestido a ouro limpo de fresco no topo do mandril de vácuo, apresentado na Figura 1A, e imobilizá-lo utilizando o vácuo do laboratório ligado. </li><li> Usando os controles do robô, alinhe a câmera voltada para baixo sobre o ponto central da coverslide revestido de ouro, como na Figura 2A. NOTA: Este ponto pode, inicialmente, ser definida por inspecção visual e não requer grande precisão, como o selo PDMS é muito larger do que a lâmina revestida de ouro. </li><li> Instrua o braço robótico para gravar quatro referência &quot;X&quot; marcas nos vértices de um quadrado com dimensões 3,8 milímetros por 3,8 milímetros centradas no coverslide revestido de ouro usando a ferramenta de ataque com ponta de diamante preso ao braço robótico. (Ilustrado na figura 2B; processo automatizado) NOTA: Este garante que todas as quatro marcas de referência estão dentro de um quadro visual da câmera voltada para baixo. </li><li> Usando as ferramentas de sucção pneumática robôs, pick-up e mantenha os PDMS carimbar 1 mm acima da fixação do assentamento selo como na Figura 2C. (Processo automatizado) </li><li> Usando a câmera voltada para cima e anel de iluminação LED retratado na Figura 2D e E, visualizar marcas de referência quadrado do selo e identificá-los com o software da câmera 10 vezes, a fim de determinar média X do selo, Y, e angular deslocamento do centro da eixo robô ferramental. (Processo automatizado) </li><li> Como em <strong&gt; Figura 2A, usar a câmera virada para baixo para visualizar e detectar marcas de referência gravadas do coverslide 10 vezes para determinar média X do coverslide, locais de centro de Y e angular deslocado do centro do eixo robô ferramental. (Processo automatizado). NOTA: Um cálculo interno é realizado pelo software do sistema robótico para alinhar precisamente o X da lamela, locais de centro de Y e deslocamentos angulares em futuras etapas R-μCP do selo e. </li><li> 3.8) Coloque o selo em um banho de alcanotiol iniciador de PRTA, bromoisobutirato ω-mercaptoundecyl (2 mM em etanol) tal como representado na Figura 2F. (Processo automatizado) </li><li> Remova o selo da solução alcanotiol e colocá-lo sobre o córrego nitrogênio pressurizado para 0,48 bar (5 psi) para evaporar o etanol como na Figura 2G. Após 1 min aumentar a pressão da corrente de azoto é 1,03 bar (15 psi), para assegurar a secura uniforme. (Processo automatizado) NOTA: secagem incompleta irá resultar em perda total ou parcial do padrão de fidelidade. </li><li> Após a secagem, mover o selo através da posição de centro calculado da lâmina revestida de ouro e baixá-lo em incrementos de 100 mm, enquanto monitorar a força do motor no eixo Z como ilustrado na Figura 2H. NOTA: Este é comunicada como torque experimentado pelo motor do eixo Z e exibido no software de orientação do robô. (Processo automatizado) </li><li> Pare de baixar o selo uma vez conseguida a pressão predeterminada de 79,2 kPa, e manter contato com a lâmina revestida de ouro por 15 s. (Processo automatizado) NOTA: Os valores de pressão aqui são otimizados para o projeto do selo e recurso de altura atual. Se o desenho de selo é alterada, especificamente em alta carimbos relação de aspecto, de acordo com estes sintonizar por um processo de tentativa e erro. </li><li> Lentamente, retire o selo da lâmina revestida de ouro e colocar o selo de volta no suporte de nidificação de selo. (Processo automatizado) </li></ol&gt; 4. SI-PRTA de PEGMEMA em micropatterned Coverslides <ol style="margin-left: 40px;"><li> Solte a pressão do vácuo segurando o coverslide micropadronadas, e transferi-lo para um frasco de 50 ml Schlenk. Seal e degas o frasco Schlenk utilizando uma bomba de vácuo. </li><li> Adicionar 5,5 ml de mistura de reacção contendo o macromonómero PRTA PEGMEMA (208,75 mmol), água (34,4 ml), metanol (43,8 ml), cobre (II), brometo de (1 mmol), e 2 &#39;, 2-bipiridina (3 mmol) de o balão de Schlenk. </li><li> Adicionar 0,5 ml de ascorbato de sódio-L (454,3 mM) em água para iniciar a reacção, e permitir que ele continue durante 16 horas à temperatura ambiente sob um gás inerte. NOTA: Após a adição de L-ascorbato de sódio, a cor da reacção irá mudar de verde-claro a castanho escuro, como mostrado na Figura 3A-B. NOTA: A reacção pode continuar para além de 16 horas, mas não vai aumentar de forma significativa o comprimento das escovas de PEG. </li></ol><imgalt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52186 / 52186fig3highres.jpg&quot; /&gt; Figura 3. Iniciação de SI-PRTA. (A) A iniciação da reacção e (B) subsequente mudança de cor após a adição de L-ascorbato de sódio. Imagem (C) Microscópio de superfície coverslide micropadronadas seguinte procedimento SI-ATRP. Barra de escala de 1 mm. <ol start="4" style="margin-left: 40px;"><li> Remover o coverslide micropadronadas a partir do balão de Schenk e enxagua-se com etanol, água e etanol e seco sob uma corrente suave de azoto. NOTA: Seguindo SI-PRTA, modificações de superfície deve ser visível a olho nu e podem ser visualizados e analisados ​​ao microscópio como na Figura 3C. NOTA: Este é o método mais simples para testar a precisão do ensaio, uma vez que elimina a necessidade de imunocoloração os substratos. </li></ol> 5. A funcionalização Azide das Cadeias micropatterned PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Coloque a coverslide micropadronadas num frasco de 20 ml de reacção de vidro. </li><li> Adicionar 6 ml de N, N-dimetilformamida (DMF) contendo 100 mM de azida de sódio para o frasco de reacção. Manter esta reacção a 37 ° C durante 24 h. NOTA: Manusear DMF apenas em uma coifa química. Tenha cuidado ao pesando azida de sódio. </li><li> Após a conclusão, remover o coverslide micropadronadas a partir do frasco de reacção e enxagua-se com etanol e depois com água e seco sob uma corrente de azoto. </li></ol> 6. Passivation das Cadeias Bromo funcionalizados PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Coloque coverslide micropatterned em 20 ml tubos de ensaio de vidro. </li><li> Adicionar 6 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) contendo 100 mM etanolamina 300 mM de trietilamina e para o frasco de reacção. Manter esta reacção a 40 ° C durante 24 h. NOTA: Manusear DMSO, etanolamina e trietilamina, apenas em uma coifa química. </li><li> Após a conclusão remover o coversl micropadronadaside a partir do frasco de reacção, lavar com etanol e depois com água e seco sob uma corrente de azoto. </li></ol> 7. R-μCP de Inner Annulus e SI-ATRP de PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Levar a cabo passos de R-μCP como anteriormente descrito nos Passos 3.2 e 3,6-3,12, substituindo um selo PDMS com 300 um e 600 um ID OD anéis salientes, de tal modo que as coroas circulares com características menores são colocados no interior dos anéis anteriormente micropadronadas. NOTA: O limite de pressão para este selo é 132,0 kPa. Como mencionado anteriormente, esses ajustes de pressão são otimizados para as características de selo a ser utilizado neste experimento. </li><li> Realizar passos SI-ATRP como anteriormente descrito nos passos 4,1-4,4. </li></ol> 8. O acetileno funcionalização das Cadeias micropatterned PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Coloque coverslide micropadronadas em um frasco de 20 ml reação vidro. </li><li> Adicionar 6 ml de DMSO contendo 100 mMpropargilamina para o frasco de reacção. Manter esta reacção à temperatura ambiente durante 24 horas. NOTA: Manusear DMSO e propargilamina apenas em uma coifa química. </li><li> Após a conclusão remover o coverslide micropadronadas a partir do frasco de reacção e enxagua-se com etanol e depois com água e seco sob uma corrente de azoto. </li></ol> 9. catalisada por cobre &quot;Clique em&quot; Biotinilaï¿½o de acetileno Encerrado Chains PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Coloque coverslide micropadronadas em um frasco de 20 ml reação vidro. </li><li> Adicionar 6 ml de sulfato de cobre (15 mM) / Tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amina (TBTA, 30 mM) (1: / v de água 1 v / DMF) contendo 562 uM de azida de PEG-4 biotina conjugado ao frasco de reacção. Adicionar 1,2 ml de ácido L-ascórbico (0,15 mM) em água à mistura para iniciar a reacção. </li><li> Bolha de azoto através da solução de reacção durante 10 seg, selar o frasco com Parafilm e reagir durante 24 horas à temperatura ambiente. </li><li> Após completion remover coverslide micropadronadas do frasco de reação, lave com água e coloque-o em um de 12 poços de poliestireno prato. </li></ol> 10. Detecção de imunofluorescência de Biotinylated acetileno Grupos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Bloquear coverslide micropadronadas em DPBS (3% Donkey Soro) durante 1 h à TA. Mancha para grupos de acetileno biotinilados com estreptavidina-546 conjugado (2 ug / ml) em DBPS (3% Donkey Soro em PBS) durante 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Lavar coverslide micropadronadas 5 vezes com DPBS durante 10 min com agitação suave. NOTA: A Figura 4B representa uma imagem da corrediça depois desta etapa é concluída. </li></ol> 11. Cobre-livre &quot;Clique em&quot; Biotinilaï¿½o de Azide Encerrado Chains PEGMEMA NOTA: Se se desejar, esta modificação passo substrato pode ser realizada in situ durante a cultura de células. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Deixe coverslide micropadronadas em 12 poços pprato olystyrene seguinte DBPS lavagens. </li><li> Adicionar 2 ml de DBPS (ou meios de cultura de células) contendo 20 uM DBCO PEG-4 biotina, e permitir que esta reacção continue durante 24 horas à temperatura ambiente (ou a 37 ° C em uma incubadora). </li><li> Após a conclusão, lavar coverslide micropadronadas 5 vezes com DPBS (ou simplesmente realizar uma mudança de mídia). </li></ol> 12. Detecção de imunofluorescência de Biotinylated azídicos Grupos <ol style="margin-left: 40px;"><li> Mancha para grupos azida biotinilados com estreptavidina-488 conjugado (2 ug / ml) em 2 ml de DPBS (3% Donkey Soro) durante 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Lavar coverslide micropadronadas 5 vezes em DPBS durante 10 minutos com agitação suave. </li><li> Imagem micropatterned coverslide utilizando microscópio de fluorescência confocal. 4A-C mostra imagens do slide após essa etapa for concluída. NOTA: Quando utilizar substratos para ensaios de cultura de tecidos, pule seções 10 e 12 do presente protocolo. Após o desejado degree de funcionalização, esterilizar o coverslide manipulado por lavagem ambos os lados com etanol a 100% e a secagem sob uma corrente de azoto. Transferir as lâminas para uma estéril cabine de segurança biológica e lavar a lâmina com PBS cinco vezes antes de prosseguir com a semeadura e cultura de células. </li></ol>

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J., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials.">Biomaterials.</a> Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).</li><li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening.">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li><li>Meitl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+printing+by+kinetic+control+of+adhesion+to+an+elastomeric+stamp.">Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp.</a> Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

Substratos ideal para a engenharia de tecidos seriam bioinspirado e, assim, recapitular a distribuição espacial dos ligandos bioactivos críticos encontrados dentro dos tecidos nativos. Eles também possuem propriedades dinâmicas que permitem ajustes temporais dos ligandos e os padrões espaciais, em que são apresentados para permitir a morfogénese do tecido e dirigida espacialmente restritos a indução de destino celular. Fabricação de tais substratos requer a imobilização de várias pistas bioquímicas nas o...

A capacidade de superfícies PEG-enxertadas para exibir ligantes bioquímicos ligados covalentemente, mantendo simultaneamente propriedades inerentes não sujar torná-los uma escolha ideal para ambientes personalizados microescala engenharia em substratos de cultura 1,2,3. As interacções bioespecíficas mediadas por ligando conjugado PEG escovas permite a análise minimizam os efeitos de sinais bioquímicos encontrados dentro do complexo em tecidos microambiente in vivo com fenótipos de células individuais. Além disso, a bio-ortogonal &quot;click&quot; químicas pode ser usada para facilitar a imobilização de ligandos direccional de modo a que eles estão apresentados na conformações nativas 4-6. Assim, a modelagem espacial em microescala de PEG escovas é uma ferramenta versátil para criar projetista em nichos in vitro para investigar a sinalização celular induzida por sinais bioquímicos imobilizados 6,7. Um método comum para a geração de padrões espaciais de cu bioquímicaes implica impressão microcontact (μCP) substratos revestidos a ouro com padrões de PEG alcanotióis conjugados. Em seguida, as monocamadas auto-montadas micropatterned (MCS) de PEG-alcanotiois ylated restringe a adsorção física de moléculas bioquímicas, por exemplo, proteínas, apenas para as regiões não modelado do substrato 8,9. No entanto, as SAM gerados por esta técnica são sensíveis à oxidação a longo prazo em meio de cultura celular. Assim, μCP&#39;d alcanotiol SAMs são muitas vezes mais enxertado com escovas de polímero PEG utilizando a transferência de átomo iniciou-superfície polimerização radical (SI-ATRP) para aumentar a estabilidade não-incrustantes da região 10. Especificamente, μCP do iniciador de polimerização alcanotiol, bromoisobutirato ω-meraptoundecyl, sobre superfícies revestidas com ouro seguido pela SI-PRTA de poli (etileno-glicol), éter metil metacrilato (PEGMEMA) monómeros gera superfícies com micropadronadas longo prazo, estável e não- incrustação PEG escovas. Além disso, estes<html> são capazes de ser ainda modificado para apresentar diversas porções químicas 11. Aproveitando essa propriedade, Sha et. ai. desenvolveu um método para projetar substratos de cultura com escovas PEGMEMA multicomponentes apresentando ortogonais &quot;clique&quot; químicas. Neste método, que utilizam uma série de passos μCP / SI-ATRP intercaladas com azida de sódio sequencial, etanolamina, e propargilamina substituições nucleófilas para criar substratos de cultura apresentam padrões de microescala de múltiplos ligandos imobilizados 6. Embora o potencial de utilização de tais produtos químicos, em conjugação com μCP manual para engendrar novos substratos de cultura é imensa, que é limitada pela precisão e exactidão com que múltiplos passos μCP podem ser alinhadas num único substrato. Um elevado nível de precisão e exactidão seria necessário para fabricar reprodutivelmente complexo em nichos in vitro que utilizam estas técnicas versáteis. e_content &quot;&gt; Para resolver esta limitação, vários sistemas μCP automatizados e semi-automatizados foram gerados. Chakra et. al. desenvolveu um sistema em que μCP selos personalizados são colocados em um sistema de transporte ferroviário e colocada em contato conformada com lâminas revestidas de ouro, utilizando um atuador pneumático, controlado por computador. No entanto, este método requer a fabricação precisa de selo projetos personalizados e relata uma precisão de 10 mm sem relatório da precisão obtida ao executar múltiplos μCP etapas 12. Mais recentemente, um método que utiliza um sistema de acoplamento cinemático integrado precisão relatado abaixo de 1 mm usando um único padrão, mas foram incapazes de alinhar com precisão múltiplos padrões, devido a uma falta de controlo preciso de características selo de molde para moldar a 13. Além disso, ambos os métodos anteriores requerem o substrato para permanecer fixo entre os passos de modelação , assim, limitando significativamente a diversidade de produtos químicos de modificação de superfície que pode serutilizado. Aqui, nós descrevemos um sistema R-μCP automatizado capaz de alinhamento exato e preciso de várias etapas μCP, permitindo flexibilidade máxima em design e fabricação de selo. Além disso, os substratos modelado pode ser repetidamente removida do sistema entre estampadas, permitindo assim a utilização de diversos produtos químicos de modificação do substrato, incluindo substituições nucleófilas sequenciais. Substratos manipuladas usando tais produtos químicos têm sido usados ​​anteriormente para a cultura de células por ambos os nós e os outros 7 6,14. Assim, fundiram-se R-μCP e reacções de substituição nucleofílica sequenciais de desenvolver um método para a fabricação de substratos de cultura escalonável com sinais bioquímicos complexos e micropatterned.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">Name</td>
			<td style="width:185px;">Company</td>
			<td style="width:185px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:185px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">SCARA&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Epson</td>
			<td style="width:185px;">LS3-401ST</td>
			<td style="width:185px;">Higher end models with increased precision are available if desired.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:185px;">(TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL)TRICHLOROSILANE</td>
			<td style="width:185px;">Gelest</td>
			<td style="width:185px;">SIT8174.0</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:185px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:185px;">Ellsworth Adhesive Co</td>
			<td style="width:185px;">NC9020938</td>
			<td style="width:185px;">Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:185px;">24mm X 50 mm #1 Cover Glass Slides</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">48393106</td>
			<td style="width:185px;">These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator</td>
			<td style="width:185px;">Telemark</td>
			<td style="width:185px;">SEC-600-RAP</td>
			<td style="width:185px;">Requries specialized training.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">EPSON LS3 SCARA</td>
			<td style="width:185px;">EPSON</td>
			<td style="width:185px;">LS3-401ST</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:185px;">&#969;-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate</td>
			<td style="width:185px;">Prochimia</td>
			<td style="width:185px;">FT 015-m11-0.2</td>
			<td style="width:185px;">Store at -20&#176;C. Other ATRP initiators may be used as this R-&#956;CP platform is applicable to all micropatterning modalities.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Schlenk Tube Flask 50 mL</td>
			<td style="width:185px;">Synthware</td>
			<td style="width:185px;">60003-078</td>
			<td style="width:185px;">Requires rubber stoppers with diaphram.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">447943</td>
			<td style="width:185px;">Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Methanol (Certified ACS)</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">A412-4</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Copper(II) Bromide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">437867</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">2&#39;,2-Bipyridine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">D216305</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">Sodium L-Ascorbate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">A4034</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">20mL Borosilicate Glass Scintillation Vials</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">03-340-4E</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">S2002</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">N,N-dimethyformamide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">227056</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">398136</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Triethylamine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">T0886</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">276855</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Propargylamine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P50900</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">200 Proof Ethanol</td>
			<td style="width:185px;">University of Wisconsin Material Distribution Services</td>
			<td style="width:185px;">2292</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">Azide-PEG3-Biotin</td>
			<td style="width:185px;">ClickChemistryTools</td>
			<td style="width:185px;">AZ104-100</td>
			<td style="width:185px;">Solubilized in DMF</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Copper(II) Sulfate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">C1297</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">678937</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">L-Ascorbic Acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">A7506</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">Phosphate Buffer Saline</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:185px;">14190144</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:185px;">Donkey Serum</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">D9663</td>
			<td style="width:185px;">Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">12-Well Polystyrene Plate</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientifit - NUNC</td>
			<td style="width:185px;">07-200-81</td>
			<td style="width:185px;">Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">DBCO-PEG4-Biotin</td>
			<td style="width:185px;">Clickchemistytools</td>
			<td style="width:185px;">A105P4-10</td>
			<td style="width:185px;">Solubilized in DMF</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td style="width:185px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:185px;">S-11223</td>
			<td style="width:185px;">Solubilized in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate</td>
			<td style="width:185px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:185px;">S-11225</td>
			<td style="width:185px;">Solubilized in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:185px;">Nikon A1-R Confocal Microscope</td>
			<td style="width:185px;">Nikon</td>
			<td style="width:185px;">Nikon Eclipse Ti, A1R</td>
			<td style="width:185px;">An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating complex culture substrates using robotic microcontact printing (r-&#181;cp) and sequential nucleophilic substitution

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (&#956;CP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual &#956;CP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-&#956;CP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal &#8216;click&#8217; chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.

A utilização de técnicas de alinhamento μCP manuais para engenheiro substratos de cultura com matrizes de escovas de PEG-enxertados funcionalizados com ortogonal &quot;clique&quot; químicas tem sido demonstrada em trabalhos anteriores 6. No entanto, este oferece um controle mínimo de orientação padrão e muitas vezes resulta em sobreposição de áreas funcionalizados. Aqui, um novo sistema R-μCP é usado para superar esta limitação, e sua capacidade de precisão padrão de um conjunto de PEG escov...

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Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- &amp;#181;CP and Sequential Nucleophilic Substitution

Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.

Fabricando substratos de cultura complexos usando Robotic microcontact Printing (R-μCP) e substituição nucleofílica Sequential

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

fabricating-complex-culture-substrates-using-robotic-microcontact

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

10.4K visualizações.  University of Wisconsin, Madison. Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands. 

Vídeo: Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- &#181;CP and Sequential Nucleophilic Substitution

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Criando Two-Dimensional Substratos modelado para Confinamento de proteína e celular

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Bioengenharia

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge, arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle cells. Despite optimum drug therapy, heart failure represents a leading cause of mortality and morbidity in the developed world. A major challenge in drug development is the identification of cellular assays that accurately recapitulate normal and diseased human myocardial physiology in vitro. Likewise, the major challenges in regenerative cardiac biology revolve around the identification and isolation of patient-specific cardiac progenitors in clinically relevant quantities. These cells have to then be assembled into functional tissue that resembles the native heart tissue architecture. Microcontact printing allows for the creation of precise micropatterned protein shapes that resemble structural organization of the heart, thus providing geometric cues to control cell adhesion spatially. Herein we describe our approach for the isolation of highly purified myocardial cells from pluripotent stem cells differentiating in vitro, the generation of cell growth surfaces micropatterned with extracellular matrix proteins, and the assembly of the stem cell-derived cardiac muscle cells into anisotropic myocardial tissue.

The generation of aligned myocardial tissue is a key requirement for adapting the recent advances in stem cell biology to clinically useful purposes. Herein we describe a microcontact printing approach for the precise control of cell shape and function. Using highly purified populations of embryonic stem cell derived cardiac progenitors, we then generate anisotropic functional myocardial tissue.

Geração de Alinhados tecido funcional do miocárdio através de impressão microcontact

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Cartilagem Human Tissue Fabricação Usando tridimensional Inkjet Tecnologia de Impressão

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial applications. Here we describe how electrospinning or electrospraying a polymer mixture containing a biodegradable, biocompatible aliphatic polyester (e.g., polycaprolactone and poly(lactide-co-glycolide)), as the major component, doped with a hydrophobic copolymer composed of the polyester and a stearate-modified poly(glycerol carbonate) affords a superhydrophobic biomaterial. The fabrication techniques of electrospinning or electrospraying provide the enhanced surface roughness and porosity on and within the fibers or the particles, respectively. The use of a low surface energy copolymer dopant that blends with the polyester and can be stably electrospun or electrosprayed affords these superhydrophobic materials. Important parameters such as fiber size, copolymer dopant composition and/or concentration, and their effects on wettability are discussed. This combination of polymer chemistry and process engineering affords a versatile approach to develop application-specific materials using scalable techniques, which are likely generalizable to a wider class of polymers for a variety of applications.

Two- and three-dimensional superhydrophobic polymeric materials are prepared by electrospinning or electrospraying biodegradable polymers blended with a lower surface energy polymer of similar composition.

Fabricação de super-hidrofóbicas Materiais Poliméricos para aplicações biomédicas

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and provide information for follow-up treatment. Here, we demonstrate the development of a cotton-based urinalysis (i.e., nitrite, total protein, and urobilinogen assays) analytical device that employs a lateral flow-based format, and is inexpensive, easily fabricated, rapid, and can be used to conduct multiple tests without cross-contamination worries. Cotton is composed of cellulose fibers with natural absorptive properties that can be leveraged for flow-based analysis. The simple but elegant fabrication process of our cotton-based analytical device is described in this study. The arrangement of the cotton structure and test pad takes advantage of the hydrophobicity and absorptive strength of each material. Because of these physical characteristics, colorimetric results can persistently adhere to the test pad. This device enables physicians to receive clinical information in a timely manner and shows great potential as a tool for early intervention.

To investigate simple fabrication approaches for multiple assay needs, we created a fluid-absorbing channel system made of cotton material. This device was used to establish a multiple detection platform, and solve contamination issues that commonly affect lateral flow-based biomedical devices, for clinical urinalysis of nitrite, total protein, and urobilinogen.

Fabricação de algodão dispositivos analíticos

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

Expansão Nanopatterned Substratos usar a técnica do ponto de Nanotopographical modulação do comportamento celular

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Fabricando um rim córtex Extracellular Matrix-derivado hidrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Four-Dimensional CT Analysis Using Sequential 3D-3D Registration

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data remains difficult because segmentation in all volumetric frames is time-consuming. We aimed to analyze joint kinematics using a sequential 3D-3D registration technique to provide the kinematics of the moving bone with respect to the fixed bone semiautomatically using 4DCT DICOM data and existing software. Surface data of the source bones are reconstructed from 3DCT. The trimmed surface data are respectively matched with surface data from the first frame in 4DCT. These trimmed surfaces are sequentially matched until the last frame. These processes provide positional information for target bones in all frames of the 4DCT. Once the coordinate systems of the target bones are decided, translation and rotation angles between any two bones can be calculated. This 4DCT analysis offers advantages in kinematic analyses of complex structures such as carpal or tarsal bones. However, fast or large-scale motions cannot be traced because of motion artifacts.

We analyzed joint kinematics from four-dimensional computed tomography data. The sequential 3D-3D registration method semiautomatically provides the kinematics of the moving bone with respect to the subject bone from four-dimensional computed tomography data.

Análise de TC quadridimensional usando registro 3D-3D sequencial

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data ...

Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous lipid tubules found in eukaryotic cells. However, in vivo LNTs are highly non-equilibrium structures that require chemical energy and molecular motors to be assembled, maintained, and reorganized. Furthermore, the composition of in vivo LNTs is complex, comprising of multiple different lipid species. Typical methods to extrude LNTs are both time- and labor-intensive, and they require optical tweezers, microbeads, and micropipettes to forcibly pull nanotubes from giant lipid vesicles. Presented here is a protocol for the gliding motility assay (GMA), in which large scale LNT networks are rapidly generated from giant unilamellar vesicles (GUVs) using kinesin-powered microtubule motility. Using this method, LNT networks are formed from a wide array of lipid formulations that mimic the complexity of biological LNTs, making them increasingly useful for in vitro studies of lipid biophysics and membrane-associated transport. Additionally, this method is capable of reliably producing LNT networks in a short time (&#60;30 min) using commonly used laboratory equipment. LNT network characteristics such as length, width, and lipid partitioning are also tunable by altering the lipid composition of the GUVs used for fabricating the networks.

This protocol describes a process for fabricating lipid nanotube networks using gliding kinesin motility in conjunction with giant unilamellar lipid vesicles.

Fabricando redes nanotubos lipídes de lipídicas multi-componentes usando o ensaio de motilidade de mobilidade de cinévola gliding

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

Manipulation of Single Neural Stem Cells and Neurons in Brain Slices using Robotic Microinjection

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, manipulate, and follow single cells in the brain tissue with high resolution over time. This task is extremely challenging due to the complexity of tissues in the brain. We have recently developed a robot, that guide a microinjection needle into brain tissue upon utilizing images acquired from a microscope to deliver femtoliter volumes of solution into single cells. The robotic operation increases resulting an overall yield that is an order of magnitude greater than manual microinjection and allows for precise labeling and flexible manipulation of single cells in living tissue. With this, one can microinject hundreds of cells within a single organotypic slice. This article demonstrates the use of the microinjection robot for automated microinjection of neural progenitor cells and neurons in the brain tissue slices. More broadly, it can be used on any epithelial tissue featuring a surface that can be reached by the pipette. Once set up, the microinjection robot can execute 15 or more microinjections per minute. The microinjection robot because of its throughput and versality will make microinjection a broadly straightforward high-performance cell manipulation technique to be used in bioengineering, biotechnology, and biophysics for performing single-cell analyses in organotypic brain slices.

This protocol demonstrates the use of a robotic platform for microinjection into single neural stem cells and neurons in brain slices. This technique is versatile and offers a method of tracking cells in tissue with high spatial resolution.

Manipulação de células-tronco neurais únicas e neurônios em fatias cerebrais usando microinjeção robótica

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, ...