We wish to thank Peter Munro PhD for his assistance with optic nerve sectioning. This study was supported by the Medical Research Council (G0901303), and in part by the Dorothy Hodgkin Postgraduate Award/Medical Research Council, the Helen Hamlyn Trust, Fight for Sight, and Moorfields special trustess,.

Declaração de Ética: Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com cuidado e uso Comitê de animal Institucional (IACUC), e foram aprovados de acordo com as diretrizes do Reino Unido Home Office ( <a href="http://goo.gl/FLkirW" target="_blank">http://goo.gl/FLkirW</a> , acessado pela última vez a 10 de Junho de 2014) e da Declaração de ARVO para o Uso de Animais em Oftalmologia e Vision Research ( <a href="http://goo.gl/4LFOjD" target="_blank">http://goo.gl/4LFOjD</a> , acessado pela última vez dia 10 de junho de 2014). 1. Ocular Hypertension Indução <ol><li> Induzir glaucoma experimental, elevando a pressão intra-ocular (PIO) por meio de injecção unilateral de microesferas paramagnéticas para a câmara anterior de ratos Brown Norway, com base no método de Samsel et al. Outros 3 ratos pigmentados pode ser adequado, embora estes teriam de ser validado em primeiro lugar pelo utilizador. </li><li> Casa 250-300 g femininoratos ex-criador Brown Noruega em um ambiente com pouca luz constante (40-60 lux) para minimizar flutuações diurnas em IOP 7, com acesso a comida e água ad libitum. </li><li> Tome medidas de PIO basal em animais acordados 8 antes da anestesia e injeção talão, usando um tonômetro de rebote calibrado para uso no olho de rato 9. PIO é tomada como a média de cinco leituras. </li><li> Anestesiar ratos com 37,5 mg / kg de cetamina e 0,25 mg / kg de cloridrato de medetomidina entregue intraperitonealmente. Confirme profundidade da anestesia, testando reflexos nos pés traseiros do animal, antes da aplicação de iodo povidona (veja o passo 1.5), e injeção de talão (veja o passo 1.8). Administrar 0,5% de cloridrato de proparacaína para analgesia. Nota: Não dilatar a pupila em qualquer fase. Isso vai ajudar as contas para resolver melhor no ângulo iridocorneal, e impedir a ligação à lente. Aplicar pomada ocular para evitar o ressecamento da córnea on-operado un olho contralateral. </li><li> Wash o olho operativa com 5% de povidona iodo na água 10 5 min antes da injecção. </li><li> Após 5 min, o pavio de iodo povidona fora com gaze estéril, e lavar o olho com solução salina estéril a 0,9%. Mantenha o olho úmido durante a anestesia com a aplicação regular de solução salina estéril. </li><li> Coloque um ímã toroidal em torno do olho. </li><li> Injecte 25 ul de uma solução contendo 30 mg / ml de gama-irradiação esterilizado 8 mm microesferas magnéticas em Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) para a câmara anterior, usando uma agulha 33 G chanfrada. <ol><li> Para preparar os grânulos, lavagem por re-suspensão, seguida de centrifugação de 3 vezes a 10.000 xg durante 5 minutos com 1 ml de HBSS, antes de fazer a final / solução de 30 mg ml. Manter condições estéreis por toda parte. </li><li> Para injecção, ter o cuidado de evitar a inserção da agulha para a íris, para minimizar o risco de trauma íris. Isto pode ser evitado por orientar a agulha tangente à superfície da córnea, como paralelaa íris possível. Isso também irá ajudar a minimizar a perda de talão do local da injeção. NOTA: Injectar pérolas a um ritmo acelerado para garantir uma distribuição uniforme em todo o ângulo iridocorneal, o que é fundamental para o aumento da pressão intra-ocular. Além disso, armazenar os grânulos, agulhas e anéis magnéticos separadamente, de modo que os grânulos não formarem aglomerados, o que os torna difíceis de carregar para dentro da seringa e injectar, e a agulha não se torna magnetizado. </li></ol></li><li> Deixar a agulha no lugar durante 1 min pós-injecção para assegurar que os grânulos resolver no ângulo iridocorneal para impedir a drenagem aquosa a partir da rede trabecular. Um pouco ângulo a agulha depois de as contas tenham estabelecido inicialmente para permitir algum vazamento do humor aquoso, para minimizar aumentos transitórios da pressão intra-ocular. No final da cirurgia, o expulsar através da agulha com o primeiro tampão de fosfatos salino (PBS), em seguida etanol a 70%, seguido por água destilada, para assegurar o uso continuado da agulha em procedimentos separados. Alternativamente, pode-se utilizaragulhas descartáveis, se a combinação correta de calibre e seringa está disponível. Opcionais: agulhas podem ser afiada usando um beveller para prolongar o seu uso. </li><li> Nesta fase, se necessário, retire o ímã, e usá-lo para desenhar grânulos em áreas de cobertura incompleta. </li><li> Deixe o ímã no lugar em torno do olho por mais 10 minutos após a injecção de assegurar contas de resolver bem no ângulo iridocorneal. </li><li> Anestesia reversa usando 0,25 mg / kg de cloridrato de atipemezole. </li><li> Administrar o cloranfenicol, ou outra pomada de antibiótico, por exemplo, gentamicina ou terramicina topicamente para evitar a infecção, e 0,5% de cloridrato de proparacaína para analgesia. Deixe os animais para se recuperar em uma esteira de calor até que recuperar o movimento, então a transferência para uma caixa quente e abastecimento com a nutrição adicional, como um suplemento alimentar ou dieta regular umedecido até a recuperação é completa. Analgesia sistêmica ou local deve ser dada aos animais que apresentam sinais de dor 24 horas após a cirurgia. Se these os sintomas persistirem apesar do tratamento, os animais devem ser humanamente abatidos. </li><li> Use o olho contralateral como controle não operado. </li><li> Efectuar as medições de IOP cada 2-3 dias após a administração do grânulo, e em seguida cada 2-3 dias utilizando um tonómetro rebote calibrado para utilização no olho de rato 9. </li><li> Os critérios para a inclusão de olhos em estudos pode ser: se: 1) o IOP é elevada acima da pressão de controlo contralateral por 5 mmHg, e 2) não excede 60 mmHg. </li><li> Olhos, onde a pressão de retorno à linha de base (normalmente de 1 semana de pós-injecção) não devem ser incluídos nos estudos, no entanto, é possível re-injectar grânulos em olhos que não conseguem desenvolver PIO elevada se desejado. </li><li> Eutanásia animais por asfixia com CO 2 no final da experiência. </li><li> Dissecar olhos e nervos ópticos, e fixar em 4% de paraformaldeído (PFA) durante a noite, para posterior análise histológica. </li></ol> 2. Avaliar Retinal Neuron Danos Utilizando TUNEL Staining <ol><li> Para quantificar células em apoptose em todo mount retinasuse o ensaio deoxynucleotidyl terminais mediada-transferase dUTP nick-rotulagem (TUNEL), de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Dissecar a retina a partir da taça para os olhos, para lavagem de 3 x 5 min em 0,3% de Triton X-100 em solução salina de fosfato tamponada (PBS-T). </li><li> Permeabilizar o tecido em 3% de T-PBS durante 2 h. </li><li> Pré-equilibrar retinas em Tampão de Equilíbrio de 10 min, antes da incubação em solução de reacção TUNEL durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Lave o tecido para 3 x 5 min em 0,3% T-PBS, lavar em 0,3% T-PBS contendo 5 mM DAPI, e flat-montagem em meios de montagem. </li><li> Para quantificar TUNEL núcleos positivos usar um microscópio confocal para ter 10 mm z pilhas através da camada de células ganglionares com ampliação de 20x. Tome 3 imagens em cada uma das quatro pétalas, em locais próximos do nervo óptico, em meados da década de periferia, e na periferia longe da retina, dando um total de 12 imagens por toda Mount, a amostragem cerca de 7.000 células. Critérios morfológicos discriminados não neuronal (endotelial e da glia) células a partir de células neuronais. </li><li> Selecionar áreas para imagens usando apenas o canal DAPI, e os investigadores de máscara para os grupos de tratamento. </li></ol> 3. Avaliação Optic Nerve Damage Usando Toluidine azul Coloração <ol><li> Fix nervos ópticos durante a noite em solução de Karnovsky a 4 ° C. </li><li> Tratar as amostras durante 2 horas em 1% (w / v) de tetróxido de ósmio e, em seguida desidratar em etanol a 100%. </li><li> Incubar nervos ópticos em óxido de propileno durante 30 min, e em colocar uma mistura de óxido de propileno de 50:50: durante a noite araldite. </li><li> Alterar esta solução a 100% de araldite, seguido por incubação durante a noite a 60 ° C. </li><li> Corte cortes semifinos seções (0,75 mm de espessura) e mancha com 1% de azul de toluidina / bórax (TB) em etanol a 50% antes do exame por microscopia de luz. </li></ol> 4. Análise estatística <ol><li> Realizar ana estatísticalisa usando um pacote de software estatístico adequado. A two-way ANOVA com teste post-hoc de Newman-Keul pode ser usado para calcular a significância estatística para IOP muda ao longo do tempo. </li><li> Um valor de p inferior a 0,05 pode ser considerado significativo. </li></ol>

<ol>
	<li>Quigley, H. A., Broman, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+number+of+people+with+glaucoma+worldwide+in+2010+and+2020.">The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020.</a> Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).</li><li>Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology+and+treatment+of+glaucoma:+a+review.">The pathophysiology and treatment of glaucoma: a review.</a> JAMA. 311 (18), 1901-1911 (2014).</li><li>Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+induction+of+experimental+glaucoma+using+magnetic+microspheres.">A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (3), 1671-1675 (2011).</li><li>Libby, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherited+glaucoma+in+DBA/2J+mice:+pertinent+disease+features+for+studying+the+neurodegeneration.">Inherited glaucoma in DBA/2J mice: pertinent disease features for studying the neurodegeneration.</a> Vis Neurosci. 22 (5), 637-648 (1017).</li><li>Morrison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+intraocular+pressure+and+optic+nerve+injury+models+in+the+rat.">Elevated intraocular pressure and optic nerve injury models in the rat.</a> J Glaucoma. 14 (4), 315-317 (2005).</li><li>Levkovitch-Verbin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translimbal+laser+photocoagulation+to+the+trabecular+meshwork+as+a+model+of+glaucoma+in+rats.">Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (2), 402-410 (2002).</li><li>Moore, C. G., Johnson, E. C., Morrison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+of+intraocular+pressure+in+the+rat.">Circadian rhythm of intraocular pressure in the rat.</a> Curr Eye Res. 15 (2), 185-191 (1996).</li><li>Morrison, J. C., Jia, L., Cepurna, W., Guo, Y., Johnson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+and+sensitivity+of+the+TonoLab+rebound+tonometer+in+awake+Brown+Norway+rats.">Reliability and sensitivity of the TonoLab rebound tonometer in awake Brown Norway rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (6), 2802-2808 (2009).</li><li>Wang, W. H., Millar, J. C., Pang, I. H., Wax, M. B., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+measurement+of+rodent+intraocular+pressure+with+a+rebound+tonometer.">Noninvasive measurement of rodent intraocular pressure with a rebound tonometer.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4617-4621 (2005).</li><li>Isenberg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ocular+application+of+povidone-iodine.">The ocular application of povidone-iodine.</a> Community Eye Health. 16 (46), 30-31 (2003).</li><li>Morrison, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+model+of+chronic+pressure-induced+optic+nerve+damage.">A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage.</a> Exp Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).</li><li>Foxton, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A+is+necessary+and+sufficient+for+retinal+neuroprotection+in+models+of+experimental+glaucoma.">VEGF-A is necessary and sufficient for retinal neuroprotection in models of experimental glaucoma.</a> Am J Pathol. 182 (4), 1379-1390 (2013).</li></ol>

David T. Shima is an employee of Hofmann-La Roche, Switzerland. The remaining authors declare they have no competing financial interests.

Aqui demonstramos um método para a indução de PIO elevada em ratos, por injecção de microesferas magnéticas para dentro da câmara anterior do olho. Este método é simples de realizar, e requer pouca experiência cirúrgica, ou horas de prática e requinte. Além disso, o procedimento é eficaz; raramente exigindo mais do que uma única injecção de grânulos para induzir um aumento forte e robusta em pressão (cerca de 10% a taxa de re-injecção). Isto pode fornecer uma vantagem sobre os métodos induzï¿½eis existentes, como a veia episceral tecnicamente desafiador esclerose 11 modelo, ou protocolo de fotocoagulação a laser 6, o que pode exigir vários procedimentos para manter levantadas IOP. Para que o método seja bem sucedido no entanto, existem alguns pequenos passos críticos que precisam de ser tomadas. Em primeiro lugar, é útil utilizar um íman em forma de toroidal para desenhar grânulos no ângulo iridocorneal. Este passo é uma modificação do protocolo original, where os grânulos foram injectados na câmara anterior, e, em seguida, movidos à mão livre em torno do olho 3. Usando um ímã toroidal significa que microesferas deve resolver uniformemente ao redor do ângulo, exigindo redistribuição manual do mínimo. Em segundo lugar, a taxa de injecção deve ser rápido - muito lento e os grânulos irão acumular-se predominantemente de um dos lados do ângulo, que conduz a uma cobertura incompleta, e, potencialmente, qualquer subida da pressão. De um modo geral, porém, o método é suficientemente simples para que o utilizador pode facilmente efectuar modificações ao protocolo, tais como a variação do tamanho ou do volume das partículas de microsferas, talvez para tentar alterar o grau de elevação da PIO. No entanto, uma desvantagem potencial do método é que se tem pouco controlo sobre a extensão da hipertensão, em que cerca de 5-10% dos casos observamos subiu acima de 60 mmHg. Aumentos excessivos na IOP pode ser muito destrutivo para os tecidos da retina, e pode fazer a estudar os mecanismos e biologia da morte celular desafiando. No entanto, o método produz uma patologia neuronal coerente, tanto na retina e nervo óptico, que pode ser manipulado farmacologicamente 12. Isto pode tornar o modelo atractivo para o desenvolvimento de novas terapias para o tratamento de glaucoma. Além disso, porque as esferas são direccionadas para o ângulo iridocorneal, esta deixa livre o eixo visual de imagens em tempo real do disco óptico ou da retina. Prevemos que este modelo será adaptado e utilizado para futuras aplicações em outras espécies, incluindo mouse.

Glaucoma primário é uma doença ocular devastador que afeta um número estimado de 60,5 milhões de pessoas em todo o mundo 1, o que pode levar à perda da visão que altera a vida e cegueira 2. A investigação sobre os mecanismos da doença e desenvolvimento de novas terapias para o glaucoma, são dependentes de bons modelos da doença que recapitulam algumas das características da patologia. Apresentamos aqui um modelo de glaucoma rato com base no método de Samsel et al., 3 O objectivo geral desta técnica é a de aumentar a pressão intra-ocular (PIO) do olho através da injecção de microesferas magnéticas para a câmara anterior, e utilizando um anel magnético, directa -los para o ângulo iridocorneal. Isto impede escoamento do humor aquoso, o que aumenta a pressão intra-ocular, levando a lesão neuronal e perda de células. O protocolo foi desenvolvido para tentar fornecer um modelo mais simples, induzível do glaucoma. Este protocolo pode ter algumas vantagenssobre as técnicas existentes. Modelos genéticos de ratinho, tais como o DBA / 2J estão disponíveis, que não requerem procedimentos para iniciar; no entanto, estes podem ter um início imprevisível da progressão da doença 4. Em contraste, os modelos indutíveis, a maioria dos quais se baseiam em elevar a PIO cirurgicamente em roedores, tem a vantagem de que a iniciação pode ser controlado pelo utilizador. Alguns destes métodos podem ter inconvenientes da sua própria no entanto, incluindo a ser tecnicamente desafiante 5, e pode requerer múltiplos procedimentos para manter 6 a PIO elevada. Em contraste, o método inducible detalhado neste manuscrito é uma técnica simples, eficaz e reprodutível, que produz estáveis, aumentos robustos na pressão, com necessidade mínima de reinjeção. Além disso, ele não envolve equipamento caro, e requer apenas habilidade cirúrgica básicos para realizar. Este protocolo pode ser apropriado para os leitores que estão à procura de criar um inducible tecnicamente menos exigentesmodelo de glaucoma em seu laboratório.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="784">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:324px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:324px;">250-300g female Brown Norway ex-breeder rats</td>
			<td style="width:175px;">Harlan UK</td>
			<td style="width:119px;">203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Tonolab Rebound Tonometer</td>
			<td style="width:175px;">Tiolat</td>
			<td style="width:119px;">TV02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:324px;">Ketaset (Ketamine)</td>
			<td style="width:175px;">Fort Dodge Animal health</td>
			<td>BN1000118</td>
			<td>37.5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Domitor (medetomidine hydrochloride)</td>
			<td style="width:175px;">Orion Pharma</td>
			<td style="width:119px;">140-999</td>
			<td>0.25 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Povidone iodine</td>
			<td style="width:175px;">Ecolab</td>
			<td>BN4369LE10</td>
			<td>5% in H2O</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Minim&#39;s Saline Solution</td>
			<td style="width:175px;">Bausch and Lomb</td>
			<td>PL00033/5017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Toroidal magnet</td>
			<td style="width:175px;">Supermagnete</td>
			<td>R-10-07-03-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Magnetic Microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Bangs Laboratories</td>
			<td>UMC4N/9692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">HBSS</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">33-guage bevelled needle</td>
			<td style="width:175px;">Hamilton</td>
			<td>7747-01</td>
			<td>Custom needle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Luer tip syringe</td>
			<td style="width:175px;">Hamilton</td>
			<td>80601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Antisedan (atipemezole hydrochloride )</td>
			<td style="width:175px;">Orion Pharma</td>
			<td style="width:119px;">141-003</td>
			<td>0.25 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Chloramphenicol ointment</td>
			<td style="width:175px;">Medicom</td>
			<td>18956-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">TUNEL staining kit</td>
			<td style="width:175px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G3250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">DAPI</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:324px;">Vectashield Mounting Media</td>
			<td style="width:175px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present here a protocol for elevating intraocular pressure (IOP) in the rat, by injecting magnetic microspheres into the anterior chamber of the eye. The use of magnetic particles allows the user to manipulate the beads into the iridocorneal angle, thus providing a very effective blockade of fluid outflow from the trabecular meshwork. This leads to long-lasting IOP rises, and eventually neuronal death in the ganglion cell layer (GCL) as well as optic nerve pathology, as seen in patients with the disease. This method is simple to perform, as it does not require machinery, specialist surgical skills, or many hours of practice to perfect. Furthermore, the pressure elevations are very robust, and reinjection of the magnetic microspheres is not usually required unlike in some other models using plastic beads. Additionally, we believe this method is suitable for adaptation for the mouse eye.

A injecção de contas magnéticas para o ângulo iridocorneal induziu consistentemente um aumento prolongado e robusto em pressão (Figura 1), que foi prontamente observável no primeiro ponto temporal, 3 dias após a injecção. Além disso, o aumento da pressão foi mantida durante toda a duração da experiência, e, embora o tempo de curso terminado aos 18 dias pós-injecção, outros relataram que a pressão persistir a longo prazo 3. A média da PIO média em toda a extensão da experiência para o controle, os olhos não talão injectados foi de 19,7 ± 0,3 mmHg, em comparação com 40,5 ± 2,8 mmHg para os olhos injetados com pérolas (P &lt;0,001). Além disso, o pico de pressão intra-ocular aumentada de 22,8 ± 0,3 mmHg, para 49,9 ± 2,3 mmHg. Para determinar se a elevação da pressão intra-ocular conduz à morte das células ganglionares da retina, foi realizada a coloração TUNEL em retinas, e histologia em secções transversais do nervo óptico (Figura 2). Na retina<html> observou-se um aumento no TUNEL coloração (Figura 2A) nos olhos com injeção de talão com PIO elevada. O número de células apoptóticas aumentou cerca de 15 vezes, de 1,6 ± 0,5 células em controlos contralaterais, para 24,5 ± 0,5 células em retinas hipertensos (Figura 2B; P &lt;0,05). Além disso, nos olhos em que as esferas magnéticas foram injectados mas não aumentou a pressão (provavelmente devido ao bloqueio incompleto do ângulo iridocorneal), os números de células positivas TUNEL não foram significativamente diferentes das dos controlos não injectados (P&gt; 0,05). Isto sugere que a morte celular foi relacionado com o aumento de pressão, não devido à toxicidade directa das microesferas magnéticas. Finalmente, foram investigadas patologia do nervo óptico no modelo de glaucoma, e vi acumulação de azul de toluidina em muitos dos axónios, indicando degeneração destes processos celulares (Figura 2C). ure 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52400 / 52400fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figura 1. A elevação da pressão intra-ocular usando microesferas magnéticas. A injecção de microesferas magnéticas para a câmara anterior induzida, um robusto aumento significativo na pressão intraocular (PIO) em comparação com o controlo contralateral, olhos não injectados. Unidades do eixo Y = milímetros de mercúrio (mmHg). Dados = média ± SEM. * = P &lt;0,001; N = 12. Este valor foi modificado a partir Foxton et al, Am.. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52400/52400fig2highres.jpg" /> Figura 2. Elevação da pressão intra-ocular, por injecção de microesferas magnéticas para o ângulo iridocorneal, morte neuronal induzida na camada de células ganglionares (GCL). (A) Imagens representativas de retinas de controle (à esquerda) e glaucoma (à direita) olhos manchados de núcleos apoptóticos por TUNEL (verde;setas brancas) e DAPI (azul), com indicação do número de núcleos apoptóticos aumentada como IOP Rose. (B) Quantificação de células TUNEL positivas no GCL, mostrando que os olhos com PIO elevada (no meio), tinham células significativamente mais apoptóticos em comparação com controle (esquerda). Em contraste, nos olhos com injeção de talão onde a pressão não subir (à direita), não foi observado aumento significativo na coloração TUNEL. Dados = média ± SEM. * = P &lt;0,05; N = 7-8 (C) Imagens representativas de coloração nervo óptico, o que demonstra um aumento na acumulação azul de toluidina (setas pretas) em axônios danificados do glaucoma (à direita), mas não controlam os olhos (esquerda).. Barras de escala = 50 um. Este valor foi modificado a partir Foxton et al., Am. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390.

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Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres

We present a method for inducing elevated intraocular pressure (IOP), by injecting magnetic microspheres into the rat eye, to model glaucoma. This leads to strong pressure rises, and extensive neuronal death. This protocol is easy to perform, does not require repeat injections, and produces stable long-lasting IOP rises.

Experimental Glaucoma induzida pela injeção de microesferas magnéticas Ocular

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

16.9K visualizações.  University College London Institute of Ophthalmology. We present a method for inducing elevated intraocular pressure (IOP), by injecting magnetic microspheres into the rat eye, to model glaucoma. This leads to strong pressure rises, and extensive neuronal death. This protocol is easy to perform, does not require repeat injections, and produces stable long-lasting IOP rises.

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Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and physical architecture. Applications include cell encapsulation, drug delivery, stem cell culture, and tissue engineering scaffolds. In fact, clinical trials are currently being performed in which islets are encapsulated in PLO coated alginate microbeads as a treatment of type I diabetes. However, large numbers of islets are required for efficacy due to poor survival following transplantation. The ability to locally stimulate microvascular network formation around the encapsulated cells may increase their viability through improved transport of oxygen, glucose and other vital nutrients. Fibroblast growth factor-1 (FGF-1) is a naturally occurring growth factor that is able to stimulate blood vessel formation and improve oxygen levels in ischemic tissues. The efficacy of FGF-1 is enhanced when it is delivered in a sustained fashion rather than a single large-bolus administration. The local long-term release of growth factors from islet encapsulation systems could stimulate the growth of blood vessels directly towards the transplanted cells, potentially improving functional graft outcomes. In this article, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. In addition, we describe a method we developed for generating multilayered alginate microbeads. Cells can be encapsulated in the inner alginate core, and angiogenic proteins in the outer alginate layer. The release of proteins from this outer layer would stimulate the formation of local microvascular networks directly towards the transplanted islets.

In the following sections, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. We specifically illustrate a technique for creating multilayered alginate microspheres for the dual purpose of cell and protein encapsulation as a potential treatment for type 1 diabetes.

Geração de alginato Microesferas para aplicações biomédicas

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

Medicina

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy and stem cell transplantations have become key therapeutic tools for treating blindness resulting from retinal degenerative diseases. Several forms of autologous transplantation for age-related macular degeneration (AMD), such as iris pigment epithelial cell transplantation, have generated encouraging results, and human clinical trials have begun for other forms of gene and stem cell therapies.2 These include RPE65 gene replacement therapy in patients with Leber's congenital amaurosis and an RPE cell transplantation using human embryonic stem (ES) cells in Stargardt's disease.3-4 Now that there are gene therapy vectors and stem cells available for treating patients with retinal diseases, it is important to verify these potential therapies in animal models before applying them in human studies. The mouse has become an important scientific model for testing the therapeutic efficacy of gene therapy vectors and stem cell transplantation in the eye.5-8 In this video article, we present a technique to inject gene therapy vectors or stem cells into the subretinal space of the mouse eye while minimizing damage to the surrounding tissue.

This surgical technique illustrates the injection of gene therapy vectors and stem cells into the subretinal space of the mouse eye.

Injeção de sub-retiniana de Vetores da terapia genética e células-tronco no olho do rato

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model of ocular hypertension to mimic human high-tension glaucoma. Here laser illumination is applied to the corneal limbus to photocoagulate the aqueous outflow, inducing angle closure. The changes of IOP are monitored using a rebound tonometer before and after the laser treatment. An optomotor behavioral test is used to measure corresponding changes in visual capacity. The representative result from one mouse which developed sustained IOP elevation after laser illumination is shown. A decreased visual acuity and contrast sensitivity is observed in this ocular hypertensive mouse. Together, our study introduces a valuable model system to investigate neuronal degeneration and the underlying molecular mechanisms in glaucomatous mice.

Chronic ocular hypertension is induced using laser photocoagulation of the trabecular meshwork in mouse eyes. The intraocular pressure (IOP) is elevated for several months after laser treatment. The decrease of visual acuity and contrast sensitivity of experimental animals are monitored using the optomotor test.

Um modelo de rato induzida por laser de crônica Ocular Hypertension para Caracterizar defeitos visuais

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

Descolamento de Retina modelo em roedores por injeção sub-retiniana de hialuronato de sódio

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events of myocardial injuries, various mouse models of myocarditis have been widely used. This study involved experimental autoimmune myocarditis (EAM) induced with cardiac myosin heavy chain (Myhc)-&#945; 334-352 in A/J mice; the affected animals develop lymphocytic myocarditis but with no apparent clinical signs. In this model, the utility of magnetic resonance microscopy (MRM) as a non-invasive modality to determine the cardiac structural and functional changes in animals immunized with Myhc-&#945; 334-352 is shown. EAM and healthy mice were imaged using a 9.4 T (400 MHz) 89 mm vertical core bore scanner equipped with a 4 cm millipede radio-frequency imaging probe and 100 G/cm triple axis gradients. Cardiac images were acquired from anesthetized animals using a gradient-echo-based cine pulse sequence, and the animals were monitored by respiration and pulse oximetry. The analysis revealed an increase in the thickness of the ventricular wall in EAM mice, with a corresponding decrease in the interior diameter of ventricles, when compared with healthy mice. The data suggest that morphological and functional changes in the inflamed hearts can be non-invasively monitored by MRM in live animals. In conclusion, MRM offers an advantage of assessing the progression and regression of myocardial injuries in diseases caused by infectious agents, as well as response to therapies.

This study demonstrates the successful establishment of magnetic resonance microscopy imaging as a non-invasive tool to assess the cardiac abnormalities in mice affected with autoimmune myocarditis. The data indicate that the technique can be used to monitor the disease-progression in live animals.

Avaliação não invasiva da Cardiac Anormalidades em Experimental Auto-imune Miocardite por Ressonância Magnética Microscopia de imagem no Rato

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events ...

A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial neurodegenerative disease. With the advent of numerous transgenic mouse lines, there is increasing interest in inducible murine models of ocular hypertension. Here, we present an occlusion model of glaucoma based on the injection of magnetic microbeads into the anterior chamber of the eye using a modified microneedle with a facetted bevel. The magnetic microbeads are attracted to the iridocorneal angle using a handheld magnet to block the drainage of aqueous humour from the anterior chamber. This disruption in aqueous dynamics results in a steady elevation of intraocular pressure, which subsequently leads to the loss of retinal ganglion cells, as observed in human glaucoma patients. The microbead occlusion model presented in this manuscript is simple compared to other inducible models of glaucoma and also highly effective and reproducible. Importantly, the modifications presented here minimize common issues that often arise in occlusion models. First, the use of a bevelled glass microneedle prevents backflow of microbeads and ensures that minimal damage occurs to the cornea during the injection, thus reducing injury-related effects. Second, the use of magnetic microbeads ensures the ability to attract most beads to the iridocorneal angle, effectively reducing the number of beads floating in the anterior chamber avoiding contact with other structures (e.g., iris, lens). Lastly, the use of a handheld magnet allows flexibility when handling the small mouse eye to efficiently direct the magnetic microbeads and ensure that there is little reflux of the microbeads from the eye when the microneedle is withdrawn. In summary, the microbead occlusion mouse model presented here is a powerful investigative tool to study neurodegenerative changes that occur during the onset and progression of glaucoma.

Here, we present a protocol to induce ocular hypertension in the murine eye that results in the loss of retinal ganglion cells as observed in glaucoma. Magnetic microbeads are injected into the anterior chamber and attracted to the iridocorneal angle using a magnet to block the outflow of aqueous humour.

A Magnetic Microbead Oclusão Modelo para induzir Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma em Ratos

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial ...

Regenerative Therapy by Suprachoroidal Cell Autograft in Dry Age-related Macular Degeneration: Preliminary In Vivo Report

This study is aimed at examining whether a suprachoroidal graft of autologous cells can improve best corrected visual acuity (BCVA) and responses to microperimetry (MY) in eyes affected by dry Age-related Macular Degeneration (AMD) over time through the production and secretion of growth factors (GFs) on surrounding tissue. Patients were randomly assigned to each study group. All patients were diagnosed with dry AMD and with BCVA equal to or greater than 1 logarithm of the minimum angle of resolution (logMAR). A suprachoroidal autologous graft by Limoli Retinal Restoration Technique (LRRT) was carried out on group A, which included 11 eyes from 11 patients. The technique was performed by implanting adipocytes, adipose-derived stem cells obtained from the stromal vascular fraction, and platelets from platelet-rich plasma in the suprachoroidal space. Conversely, group B, including 14 eyes of 14 patients, was used as a control group. For each patient, diagnosis was verified by confocal scanning laser ophthalmoscope and spectral domain-optical coherence tomography (SD-OCT). In group A, BCVA improved by 0.581 to 0.504 at 90 days and to 0.376 logMAR at 180 days (+32.20%) postoperatively. Furthermore, MY test increased by 11.44 dB to 12.59 dB at 180 days. The different cell types grafted behind the choroid were able to ensure constant GF secretion in the choroidal flow. Consequently, the results indicate that visual acuity (VA) in the grafted group can increase more than in the control group after six months.

Regenerative Therapy by Suprachoroidal Cell Autograft in Dry Age-related Macular Degeneration: Preliminary In Vivo Report

The goal of this study is to assess whether the suprachoroidal graft of adipose-derived stem cells included in the stromal vascular fraction and platelets derived from platelet-rich plasma by the Limoli Retinal Restoration Technique can improve visual acuity and retinal sensitivity responses in eyes affected by dry age-related macular degeneration.

Terapia regenerativa pela célula Suprachoroidal Autograft em seco Degeneration Macular Age-related: relatório preliminar na Vivo

This study is aimed at examining whether a suprachoroidal graft of autologous cells can improve best corrected visual acuity (BCVA) and responses to ...

An Experimental Model of Diet-Induced Metabolic Syndrome in Rabbit: Methodological Considerations, Development, and Assessment

In recent years, obesity and metabolic syndrome (MetS) have become a growing problem for public health and clinical practice, given their increased prevalence due to the rise of sedentary lifestyles and unhealthy eating habits. Thanks to animal models, basic research can investigate the mechanisms underlying pathological processes such as MetS. Here, we describe the methods used to develop an experimental rabbit model of diet-induced MetS and its assessment. After a period of acclimation, animals are fed a high-fat (10% hydrogenated coconut oil and 5% lard), high-sucrose (15% sucrose dissolved in water) diet for 28 weeks. During this period, several experimental procedures were performed to evaluate the different components of MetS: morphological and blood pressure measurements, glucose tolerance determination, and the analysis of several plasma markers. At the end of the experimental period, animals developed central obesity, mild hypertension, pre-diabetes, and dyslipidemia with low HDL, high LDL, and an increase of triglyceride (TG) levels, thus reproducing the main components of human MetS. This chronic model allows new perspectives for understanding the underlying mechanisms in the progression of the disease, the detection of preclinical and clinical markers that allow the identification of patients at risk, or even the testing of new therapeutic approaches for the treatment of this complex pathology.

We describe methods to develop an experimental model of diet-induced metabolic syndrome (MetS) in rabbits using a high-fat, high-sucrose diet. Animals developed central obesity, mild hypertension, pre-diabetes, and dyslipidemia, thus reproducing the main components of human MetS. This chronic model will allow acquisition of knowledge underlying mechanisms of disease progression.

Um modelo Experimental de síndrome metabólica induzida por dieta em coelho: considerações metodológicas, desenvolvimento e avaliação

In recent years, obesity and metabolic syndrome (MetS) have become a growing problem for public health and clinical practice, given their increased ...

A Model of Glaucoma Induced by Circumlimbal Suture in Rats and Mice

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known risk factor for glaucoma. This protocol demonstrates a step-by-step guide on this technique in Long Evans rats and C57BL/6 mice. Under general anesthesia, a "purse-string" suture is applied on the conjunctiva, around the equator and behind the limbus of the eye. The fellow eye serves as an untreated control. Over the duration of our study, which was a period of 8 weeks for rats and 12 weeks for mice, IOP remained elevated, as measured regularly by rebound tonometry in conscious animals without topical anesthesia. In both species, the sutured eyes showed electroretinogram features consistent with preferential inner retinal dysfunction. Optical coherence tomography showed selective thinning of the retinal nerve fiber layer. Histology of the rat retina in cross-section found reduced cell density in the ganglion cell layer, but no change in other cellular layers. Staining of flat-mounted mouse retinae with a ganglion cell specific marker (RBPMS) confirmed ganglion cell loss. The circumlimbal suture is a simple, minimally invasive and cost-effective way to induce ocular hypertension that leads to ganglion cell injury in both rats and mice.

Chronic ocular hypertension is induced by applying a circumlimbal suture in rats and mice, leading to functional and structural deterioration of the retinal ganglion cells consistent with glaucoma.

Um modelo de Glaucoma induzido por sutura Circumlimbal em ratos e camundongos

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known ...

A Rabbit Model of Aqueous-Deficient Dry Eye Disease Induced by Concanavalin A Injection into the Lacrimal Glands: Application to Drug Efficacy Studies

Dry eye disease (DED), a multifactorial inflammatory disease of the ocular surface, affects 1 in 6 humans worldwide with staggering implications for quality of life and health care costs. The lack of informative animal models that recapitulate its key features impedes the search for new therapeutic agents for DED. Available DED animal models have limited reproducibility and efficacy. A model is presented here in which DED is induced by injecting the mitogen concanavalin A (Con A) into the orbital lacrimal glands of rabbits. Innovative aspects of this model are the use of ultrasound (US) guidance to ensure optimal and reproducible injection of Con A into the inferior lacrimal gland; injection of Con A into all orbital lacrimal glands that limits compensatory production of tears; and use of periodic repeat injections of Con A that prolong the state of DED at will. DED and its response to test agents are monitored with a panel of parameters that assess tear production, the stability of the tear film, and the status of the corneal and conjunctival mucosa. They include tear osmolarity, tear break-up time, Schirmer&#39;s tear test, rose bengal staining, and tear lactoferrin levels. The induction of DED and the monitoring of its parameters are described in detail. This model is simple, robust, reproducible, and informative. This animal model is suitable for the study of tear physiology and of the pathophysiology of DED as well as for the assessment of the efficacy and safety of candidate agents for the treatment of DED.

This article describes the development of a method to induce acute or chronic dry eye disease in rabbits by injecting concanavalin A to all portions of the orbital lacrimal gland system. This method, superior to those already reported, generates a reproducible, stable model of dry eye suitable for the study of pharmacological agents.

Um modelo de coelho da doença aquosa-deficiente do olho seco induzida pela concanavalina Uma injeção nas glândulas lacrimal: aplicação a estudos de eficácia de drogas

Dry eye disease (DED), a multifactorial inflammatory disease of the ocular surface, affects 1 in 6 humans worldwide with staggering implications for ...