O glaucoma é a principal causa de cegueira irreversível, caracterizada pela morte celular gânglio da retina e pela opto-neurodegeneração. A elevação da pressão intraocular, também chamada de hipertensão ocular, é o fator de risco mais reconhecido para glaucoma. Um modelo simples, mas eficaz de hipertensão ocular em animais experimentais como camundongos, é importante para investigar glaucometros em neurodegeneração e testar o tratamento para neuroproteção.
Assim, com os resultados, desenvolvemos um modelo de hipertensão ocular do camundongo que imita de perto o glaucoma secundário observado em pacientes humanos. Este modelo replica fielmente o glaucoma secundário causado pelo óleo de silicone induzido pelo bloqueio pupilar. O procedimento é simples a elevação do IOP é estável, e se a neurodegeneração associada à hipertensão ocular for grave nos olhos do rato, mais importante, a hipertensão ocular é reversível porque o óleo de silicone pode ser facilmente removido dos olhos do rato.
Demonstrando o procedimento será o Dr. Fang Fang, um sujeito pós-operatório do meu laboratório. Para começar, faça uma micropipette de vidro para injeção intracameral de óleo de silicone puxando um capilar de vidro com um puxador de pipeta. Corte uma abertura na ponta da micropipette e afie a ponta usando uma máquina de bipartida micro-moedor para fazer um bisbilhoteiro de 35 a 40 graus.
Polir as bordas do bisel e lavá-lo com água para remover todos os detritos. Autoclave a micropipette antes de usar. Para preparar a agulha de paracentese para a entrada da córnea, conecte uma agulha de calibre 32 a uma seringa de cinco mililitros em uma fechadura de isca e fixe-a ainda mais com fita adesiva.
Dobre a ponta de bevel agulha, de frente para cima, a 30 graus. Para preparar o injetor de óleo de silicone, conecte e fixe uma agulha de ponta 18 em uma seringa de 10 mililitros. Em seguida, conecte um tubo plástico com a agulha de calibre 18 em uma extremidade e encha com óleo de silicone conforme necessário através da outra extremidade.
Depois de anestesiar um rato C57 preto 6J de nove a 10 semanas, verifique se há falta de resposta ao aperto do dedo do dedo com a falta de movimento dos bigodes ou da cauda. Coloque o mouse em posição lateral em uma plataforma de cirurgia. Aplique uma gota de 5% de cloridrato de proparacaina na córnea antes da injeção para reduzir sua sensibilidade durante o procedimento.
Use a agulha de paracentese de calibre 32 para fazer uma incisão de entrada no quadrante super temporal a cerca de 5 milímetros do limbus. Túnel através das camadas da córnea por cerca de 3 milímetros antes de perfurar na câmara anterior, tomando cuidado para não tocar na lente ou íris. Retire a agulha lentamente para liberar cerca de um a dois microliters de humor aquoso da câmara anterior através do túnel e espere cerca de oito minutos para diminuir ainda mais a pressão intraocular.
Meça o olho de controle contralateral para determinar a pressão. Insira a micropipette de vidro pré-carregada com óleo de silicone através do túnel córnea na câmara anterior com o bisel voltado para baixo na superfície da íris. Empurre o êmbolo da seringa lentamente para injetar óleo de silicone na câmara anterior até que a gota de óleo cubra a maior parte da superfície da íris, aproximadamente 2,3 a 2,4 milímetros de diâmetro.
Deixe a micropipette na câmara anterior por mais 10 segundos antes de retirá-la lentamente. Empurre suavemente a pálpebra superior para fechar a incisão da córnea para minimizar o vazamento de óleo de silicone. E então aplique pomada antibiótica na superfície dos olhos.
Mantenha o mouse na almofada de aquecimento até se recuperar totalmente da anestesia. Para remover o óleo de silicone da câmara anterior, anestesiar o mouse e, em seguida, verificar a falta de resposta ao aperto do dedo do dedo do dedo para determinar a força anestéstica e a falta de movimento dos bigodes ou da cauda. Coloque o mouse em uma plataforma de cirurgia e fixe-o na posição lateral com fita.
Aplique uma gota de 5% de cloridrato de proparacaina na córnea para reduzir sua sensibilidade. Usando a agulha de paracentese de calibre 32 pré-feita, faça duas incisões no quadrante temporal da córnea entre aproximadamente duas e cinco horas na borda da gotícula de óleo de silicone. Insira uma agulha de irrigação de calibre 33 conectada à solução de irrigação através de uma incisão córnea em velocidade máxima.
Insira outra agulha de drenagem de calibre 33 presa à seringa sem um êmbolo através da outra incisão córnea para permitir que a gota de óleo de silicone saia da câmara anterior enquanto irriga com solução irrigante. Retire a agulha de drenagem e depois a agulha de irrigação. Use uma micropipette de vidro conectada a uma seringa Hamilton para injetar uma bolha de ar na câmara anterior para manter sua profundidade normal e pressione para fechar a incisão da córnea.
Aplique pomada antibiótica em ambos os olhos e mantenha o rato na almofada de recuperação de aquecimento até que esteja totalmente recuperado da anestesia. Coloque o mouse em uma câmara de indução. Anestesia-o como descrito no manuscrito e mantenha sua córnea úmida aplicando lágrimas artificiais durante todo o procedimento.
Aguarde cerca de 15 minutos para permitir que o aluno dilatar completamente. Meça o IOP de ambos os olhos usando um tonômetro de acordo com as instruções do produto. Leve o tonômetro perto do olho do rato, mantendo a distância da ponta da sonda até a córnea do rato em cerca de três a quatro milímetros.
Pressione o botão de medição seis vezes para gerar uma leitura e obter três leituras geradas por máquina de cada olho para adquirir o IOP médio. Realize a imunohistoquímica de células gânglios de retina de montagem inteira contando seções semifinais do nervo óptico e quantificação de axônios sobreviventes nos animais sacrificados às oito semanas após a injeção de óleo de silicone. A pressão intraocular dos olhos do rato com gotículas de óleo de silicone maiores que 1,6 milímetros foi medida uma vez por semana durante oito semanas, após uma única injeção de óleo de silicone.
A pressão do olho que recebeu o óleo permaneceu alta, principalmente o dobro da pressão do olho de controle contralateral indicando um bloqueio efetivo da pupila. Em outro grupo de camundongos, o óleo de silicone foi retirado da câmara anterior duas semanas após a injeção. Depois de esperar uma semana para permitir que a córnea se recuperasse, a pressão intraocular voltou ao normal, o mesmo que o olho de controle.
Para determinar os efeitos da hipotensão ocular induzida pelo óleo de silicone nas células gânglios da retina, a somata sobrevivente nas regiões periféricas dos montagems inteiras da retina foi quantificada pela coloração RBPMS mostrando dramática morte celular de gânglio da retina após injeção de óleo de silicone. Os axônios sobreviventes nas seções transversais semi-finas do nervo óptico foram quantificados pela coloração da PBD oito semanas após a injeção. Houve uma grande degeneração de axônio na hipertensão ocular induzida pelo óleo de silicone.
Os animais podem ser imagens com SLOOCT para determinar a mudança na retina. A função visual dos animais também pode ser avaliada pelo padrão ERG e OKR. Este modelo de hipertensão ocular facilitará a investigação da neurodegeneração de glaucometros induzidos pelo IOP.
Também pode ser usado para testar terapias neuroprotetoras promissoras pré-clínicas.
