Este trabalho foi financiado pelo NIH concede AI56168, AI71142, AI87541 e AI100631 de MDP. Maurizio Del Poeta é Burroughs Wellcome Investigator em Doenças Infecciosas.

1. Colesterol depleção de células J774A.1 com MβCD <ol><li> Em uma cabine de segurança biológica estéril, sementes células tipo macrófagos J774A.1 5 10 por poço numa placa de 96 poços de cultura de células em 200 ul de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina / estreptomicina (P / S). Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 O / N. </li><li> Remover mídia da monocamada de células e lava-se as células duas vezes com solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) que foi filtrado e autoclavado. </li><li> Adicionar 200 ul de solução MβCD na concentração desejada (10 mM mM ou 30 em PBS) ou 1x PBS como um controlo e incubar durante 30 min a 37 ° C com agitação. Remover o sobrenadante e reserva a RT para a análise quantitativa com um kit disponível comercialmente imediatamente após o procedimento. </li><li> Lavar as células duas a três vezes com PBS 1x ou DMEM isento de soro e continuar com infecção ou lisam as células por pipetting de duas a três vezes com H2O desionizada para análise com cromatografia de camada fina ou com um kit. NOTA: Após a depleção de colesterol um kit de colesterol quantificação disponíveis comercialmente podem ser utilizados. Consulte a seção de materiais para obter detalhes. Siga as instruções do fabricante, conforme escrito. </li></ol> 2. Observação de Colesterol conteúdo por cromatografia em camada delgada (TLC) <ol><li> Lavar um tanque TLC duas vezes com acetona e uma vez com uma solução de éter de petróleo: éter dietílico: ácido acético (65: 30: 1 por volume). Saturar o tanque com o éter de petróleo: éter dietílico: ácido acético (65: 30: 1 por volume) e solução deixar S / N. NOTA: Organic solventes deve sempre ser usado sob uma coifa para evitar a inalação de vapor. Luvas e jaleco deve ser usado em todos os momentos. O ácido acético é um ácido forte e devem ser utilizados com cautela. </li><li> Em um gabinete de biossegurança estéril, semente 10 macrófagos-like 6 J774A.1 por poço em uma de 6 poços cell placa de cultura num volume de 5 ml de DMEM morno, suplementado com 10% FBS e 1% de P / S. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 O / N. </li><li> Esgotar macrófagos de colesterol, seguindo passos 1,2-1,4, substituindo 1 ml para 200 ul onde aplicável para explicar o maior tamanho bem. </li><li> Adicionar 500 ul de Tripsina-EDTA a cada poço, incubar durante 3 min a 37 ° C, e raspe as células com um raspador de células. </li><li> Transferir para um tubo de microcentrífuga e adicionar um adicional de 500 ul de DMEM morno, suplementado com 10% FBS e 1% de P / S. </li><li> Rodar as células durante 5 min a 300 xg e remover o sobrenadante. </li><li> Adicionar um adicional de 500 ul de DMEM morno, suplementado com 10% FBS e 1% de P / S para a pelete de células e ressuspender cuidadosamente, pipetando para cima e para baixo. </li><li> Retirar 10 ml de células e contagem de células em um hemocitômetro. Normalizar as concentrações de células a partir de cada amostra e adicionar um número igual de células para tubos de vidro. NOTA: Neste passo, um maioescolher a combinação de células a partir dos mesmos grupos de tratamento para se obter um extracto mais concentrado final de lípido. </li><li> Centrifugar células a 300 xg por 5 min a RT e remover mídia. </li><li> Adicionar 2 ml de metanol e vortex. Em seguida, adicione 1 ml de clorofórmio e vortex. Verifique o estado de fase para garantir que a solução em monofásico. NOTA: Os tubos podem ser armazenados a 4 ° CO / N. </li><li> Centrifugar a 1.700 xg durante 10 min à temperatura ambiente e transferir o sobrenadante para um novo tubo </li><li> Adicionar um adicional de 1 ml de clorofórmio, seguido de 1 ml de dH 2 O. Vortex duas vezes durante 30 segundos. Centrifugar a 1.700 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Pesar um tubo de vidro sobre uma balança sensível e utilizar uma pipeta de Pasteur de vidro para transferir a fase mais baixa no tubo de vidro de peso conhecido. </li><li> Seque-se lipídios em um evaporador centrífugo até secar (cerca de 2 horas). Pesar tubo com lípidos secos e calcular o peso seco de lípidos. NOTA: lípidos secos podem ser armazenados em -20 ° C até estar pronto para executar TLC. </li><li> Dilui-se lípidos secos em clorofórmio suficiente para normalizar a concentração de lípido (geralmente 20 - 50 ul) e 20 ul de carga do lípido diluído em uma placa de TLC de sílica. Carga de 20 ug de colesterol diluída em 20 ul de clorofórmio como um padrão. </li><li> Adicionar placa TLC seco para o tanque TLC saturado e permitir solvente migrar até 1 cm antes da borda da placa. Retire a placa de TLC de tanque e deixe-a secar cerca de 5 min. </li><li> Visualize lipídios, colocando em um tanque de vapor de iodo para verificar a migração. Remover manchas e permitir a desvanecer-se para cerca de 10 - 15 min sob o capô. NOTA: O iodo é um perigo de inalação. Utilize sempre sob uma coifa. </li><li> Prepara-se uma solução para a coloração de lípidos neutros através da combinação de 60 ml de metanol com 60 ml de H2O desionizada, 4 ml de ácido sulfúrico, e 630 mg de cloreto de manganês. </li><li> Cuidadosa e lentamente mergulhar na placa de TLC em solução de coloração de lípidos neutros em uma bandeja e remover sem desprendendo-se a sílica layer. NOTA: A solução de coloração lípido neutro pode ser reutilizado várias vezes e por isso pode ser recuperado a partir da bandeja e colocados em um frasco de volta para uso posterior. </li><li> Permitir que a placa secar sob o capô à temperatura ambiente até que todas as bolhas desapareceu. Aquecer a placa de TLC em um conjunto de blocos de calor a 160 ° C e char para a cor desejada. NOTA: Um programa de densitometria como funciona a visão LS pode ser utilizado para quantificar as bandas carbonizados para comparar amostras de lipídios. </li></ol> 3. A infecção de macrófagos com C. neoformans (H99) <ol><li> Em uma cabine de segurança biológica estéril, semente 10 5 células semelhantes a macrófagos por cavidade em uma placa de 96 poços de cultura de células em 200 ul de DMEM suplementado com 10% FBS e 1% de P / S. Incubar a 37 ° C, 5% CO 2, 5% de CO 2 O / N. NOTA: A infecção também pode ser feito de vidro de fundo pratos confocal para imagens mais fácil; todas as quantidades permanecem as mesmas. </li><li> Crescer uma cultura de C. neoformans (H99)através da inoculação de 10 ml de YNB com uma colónia obtida a partir de uma placa atingido e incubando-O / N a 30 ° C com agitação. </li><li> Lave e contar C. neoformans (H99) células. <ol><li> Centrífuga C. neoformans cultura O / N a 1700 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Remova a mídia e descarte. Lavar as células com 5 ml de PBS 1x. Centrifugar a 1.700 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Remover PBS e lavar com 5 ml de PBS 1x filtrada. Centrifugar a 1.700 xg durante 10 min a 4 ° C. Repita este passo mais 2 vezes. </li><li> Remover PBS e ressuspender em 5 ml de PBS 1x. </li><li> Fazer uma diluição em série em PBS para obter uma diluição de 1: 500 a cultura lavada. <ol><li> Adicionar 100 ul da amostra original de 900 ul de 1x PBS para obter uma diluição de 1:10. </li><li> Adicionar 100 ul de amostra diluída a 1:10 900 ul de 1x PBS para obter uma diluição de 1: 100. </li><li> Adicionar 200 ul de 1: 100 da amostra diluída para 800 ul de 1x PBS para se obter uma mistura 1: 500 dilutiem </li></ol></li><li> Tomar 10 ul de 1: 500 de diluição e contar com hemocitómetro para calcular o número de células. </li></ol></li><li> Prepare a solução de trabalho para ativar macrófagos e opsonizantes C. neoformans. <ol><li> Diluir LPS e IFN-y 100x de soluções estoque, adicionando 10 ml para 990 mL. NOTA: LPS e IFN-y são utilizados para aumentar a absorção fagocíticas, mas não são necessárias para a fagocitose. Se houver um interesse na actividade fungicida de macrófagos, realizar activação de O / N a 37 ° C com agitação antes da infecção. </li><li> Por exemplo combinar 7,5 ul de LPS diluídas, 1,25 ul de IFNy diluída, 1,25 ul de anticorpo GXM e o volume da C. cultura neoformans que dá 1,25 x 10 5 células. Levar o volume até 250 ul multiplicado pelo número de amostras com DMEM suplementado com 10% FBS e 1% de P / S. </li><li> Vortex e incubar solução durante 20 min a 37 ° C com agitação. NOTA:Depleção de colesterol (passos 1,2-1,4) pode ser feita simultaneamente com o passo de opsonização. Certifique-se de tratar os macrófagos antes de se combinar a solução de trabalho, como as células opsonizadas deve ser otimamente não é mais usado do que 20 minutos após o passo 3.4.3 incubação. </li></ol></li><li> Infectam macrófagos <ol><li> Macrófagos lavar duas vezes com DMEM isento de soro e adicionar 200 mL de opsonizado C. neoformans solução de trabalho a cada poço. </li><li> Incubar durante 2 horas a 37 ° C. </li></ol></li><li> Fixar e corar as células <ol><li> Remova a mídia e lavar as células duas vezes com DMEM. </li><li> Secar a monocamada de células durante 10 min e adicionar 200 uL de metanol arrefecido em gelo para fixar as células. </li><li> Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente e remover qualquer metanol remanescente. </li><li> Adicionar 200 ul de 10x Giemsa e incubar durante 5 min à TA. </li><li> Lave 2-3 vezes com água deionizada e seco O / N com tampa off. NOTA: Imagem pode ser feito no dia seguinte ou até uma semana followicoloração ng. </li></ol></li><li> Visualize e Contagem <ol><li> Usando um microscópio, a contagem de 300 células por ponto de dados (se houver 2 do mesmo tratamento contar 150 por poço) e anote o número de macrófagos infectados e número de células Cryptococcus engoliram. NOTA: Para garantir ainda amostragem per use ponto de dados 2 placas por estado, escolher 3 áreas não sobrepostas por placa e conte 50 células por área. </li><li> Calcular o índice fagocitário multiplicando a percentagem de macrófagos infectados pelo número significativo de C. neoformans por macrófago. Normalizar o índice fagocitário, expressando os valores como uma percentagem do controlo tratado com PBS 1x. Depois de vários ensaios calcular o valor médio e o desvio padrão da média para determinar as tendências no índice de fagocitose. Use t de Student para determinar a significância. </li><li> Tome micrografias das células de 1000X ou aumento de 400X. </li></ol></li></ol> 4. Ensaio de Azul de Tripano <ol><li> Em uma cabine de segurança biológica estéril, semente 10 6 células tipo macrófagos por cavidade em uma placa de 6 poços de cultura de células num volume de 5 ml de meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina / estreptomicina . Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 O / N. </li><li> Esgotar macrófagos de colesterol, seguindo passos 1,2-1,4 substituindo 2 ml para 200 ul onde aplicável para explicar o maior tamanho bem. NOTA: Certifique-se de incluir um controle tratado com 1x PBS, bem como um controle que é raspado antes de qualquer tratamento. </li><li> Adicionar 500 ul de 1x PBS a cada poço e suavemente raspar as células com um raspador de células. Transferir para um tubo de microcentrífuga e suspender as células cuidado pipetando para cima e para baixo. </li><li> Retirar 10 ml de células e mancha com 1 ml de 4% Trypan azul. </li><li> Contagem de células em um hemocitômetro e calcular a viabilidade usando a seguinte equação:% de viabilidade = [1 - (células azuis / células totais)]x 100. Os valores de normalização para o controle que não foi tratado. Depois de vários ensaios calcular o valor médio eo desvio-padrão para determinar as tendências da viabilidade. Use t de Student para determinar a significância. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Ao trabalhar com este protocolo é importante para obter a contagem de células precisos ao cultivo de células de mamíferos e opsonizantes C. células neoformans. Isto minimiza a variação entre ensaios e garante uma precisas 1: 1 de alvo da razão efector ao longo do estudo. Também é crítico para coordenar o momento da depleção de colesterol e para prevenir a infecção das células de levedura ou células opsonizadas macrófagos tratados de repouso à temperatura ambiente entre os processos. ...

A fagocitose é um processo pelo qual as entidades extracelulares são internalizados pelas células hospedeiras. É uma arma fundamental no arsenal do sistema imunológico para se defender contra patógenos, mas o processo pode muitas vezes ser subvertida por patógenos para permitir a internalização e se espalhando por todo o corpo 1. A fagocitose é mediada por vários eventos de sinalização que resultam em anexo e imersão através de rearranjos do citoesqueleto da célula hospedeira. Fagócitos &quot;profissionais&quot; são capazes de reconhecer e ligar-se a opsoninas sobre a superfície do agente patogénico invasor para sinalizar para a ligação e a formação de lamelipï¿½ios, que engolir o patógeno e formar um fagossoma 2. Entre as chamadas fagócitos &#39;profissionais&#39; são os macrófagos. Os macrófagos são células altamente especializadas que realizam funções de proteção que incluem procurando e eliminando os agentes que causam doenças, reparar tecidos danificados, e mediação da inflamação, a maioria dosestes através do processo de fagocitose 1,2. Cryptococcus neoformans é uma espécie de fungo patogênico que causa uma doença grave conhecida como criptococose. Esporos Cryptococcus são inaladas pelo acolhimento e resultar em uma infecção pulmonar, que é geralmente assintomática. Pensa-se que a exposição é extremamente predominante; uma amostra de 61 crianças a partir dos Infectologia Pediátrica do Hospital Clinic Center Bronx-Lebanon descobriu que todos os entrevistados tinham anticorpos para o glucuronoxylomannan polissacarídeo cryptococcal e outros estudos têm mostrado prevalência em ambos os vírus da imunodeficiência humana (HIV) não infectado e adultos infectados 3, 4. macrófagos alveolares são a primeira linha de resposta à infecção pulmonar e na maioria dos casos com sucesso claro o patógeno. No entanto, em indivíduos imunodeprimidos (pacientes por exemplo, HIV e AIDS) o fermento é capaz de sobreviver dentro dos macrófagos. Nestescasos, os macrófagos podem servir como um nicho para a replicação do patógeno e pode facilitar a sua difusão para o sistema nervoso central (SNC) em que a doença se torna fatal 5-8. Pensa-se que os macrófagos podem até mesmo entregar o fermento diretamente nas meninges, ajudando a levedura de atravessar a barreira hemato-encefálica através do modelo de &quot;cavalo de Tróia&quot; 3,9 - 11. Assim, é importante compreender o processo de fagocitose e os factores que a afectam, especialmente na infecção pelo fungo. Trabalhos anteriores em outros sistemas de patógenos apontam para colesterol e lipídios jangadas formadas por colesterol como tendo um papel importante a desempenhar na fagocitose 12-15. O colesterol é as espécies mais abundantes de lípidos nas células de mamíferos e compreende 25 - 50% da membrana da célula de mamífero 16. Verificou-se que desempenham um papel na modulação da BIOPpropriedades hysical de membranas, alterando a sua rigidez 17. O colesterol e esfingolípidos em conjunto formam microdomínios lipídicos dentro da membrana conhecida como jangadas lipídicas. Jangadas lipídicas foram encontrados para ser envolvida na formação de caveolas, bem como o fornecimento de um domínio isolado para certos tipos de sinalização 16-18. Devido ao seu tamanho pequeno, é difícil estudar as jangadas lipídicas in vivo. Uma forma útil para estudar o papel de jangadas lipídicas é alterar os seus constituintes. Metil-β-ciclodextrina (MβCD) é um composto que foi encontrado para esgotar o colesterol das membranas de mamíferos e é normalmente utilizado para estudar o papel das jangadas lipídicas 18. Neste protocolo, que apresentam um método para esgotar o colesterol das membranas das células hospedeiras e quantificar o efeito do esgotamento da capacidade das células hospedeiras para fagocitar C. neoformans in vitro. Este procedimento faz uso de cultura de células techniques sobre um macrófago imortalizado como linha celular (J774A.1) como um modelo para a infecção. Depleção de colesterol foi realizada por exposição a MβCD, que tem um núcleo hidrofóbico específico para o tamanho de esteróis e é capaz de actuar como um dissipador para o colesterol desenhá-lo para fora da membrana 19. Depleção de colesterol foi medida quantitativamente usando um kit disponível comercialmente e qualitativamente utilizando uma extracção de lípidos Bligh-Dyer modificado, seguidas por cromatografia em camada fina (TLC) 20. . Fagocitose foi medida através da infecção da linha celular com uma cultura de fermento opsonizado misturado com um cocktail de interferão-γ e lipopolissacárido para activar os macrófagos Cryptococcus foi opsonizadas utilizando um anticorpo glucuronoxylomannan (GXM) 21-23. A coloração e microscopia de experiências permitiu a visualização de células e do cálculo do índice de fagocitose de avaliar o grau de fagocitose. Tomados em conjunto, este protocolo describes um método de base que integra a alteração da composição lipídica com um processo fisiológico.

<table><tbody><tr><td>Class II type A2 Biosafety Cabinet</td><td>Labconco</td><td>3460009</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1 cell line</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing.</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Store at 4 &amp;deg;C and warm to 37 &amp;deg;C prior to use</td></tr><tr><td>HI Fetal Bovine Serum Performance Plus</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>Keep frozen at -20 &amp;deg;C and thaw before adding to DMEM</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Used to suplement DMEM</td></tr><tr><td>Isotemp Cell culture incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # 3530</td></tr><tr><td>96-Well culture dish</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate Buffered Saline</td><td>Fisher Scientific BioReagents</td><td>BP3994</td><td>Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use.</td></tr><tr><td>Methyl-&amp;beta;-cyclodextrin</td><td>Sigma Life Science</td><td>C4555-10G</td><td>Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10 mM and 30 mM concentrations</td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Labline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td><td>Life Technologies Molecular Probes</td><td>A12216</td><td>All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions.</td></tr><tr><td>96-Well Black Assay plate</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>FilterMax microplate reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Model F5</td></tr><tr><td>TLC chamber</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z126195-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498-4L</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-2L-R</td><td></td></tr><tr><td>TLC Paper</td><td>Whatman</td><td>3030917</td><td>Cut down to size needed for TLC tank</td></tr><tr><td>Fume hood</td><td></td><td></td><td>Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards</td></tr><tr><td>6-Well plate</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Model Alegra x-30R</td></tr><tr><td>Votex mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>Model # MS104S meaures down to 0.1 mg</td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac concentrator</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Model # SPD2010</td></tr><tr><td>Petroleum ether</td><td>Fisher Scientific</td><td>E139-1</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>TLC Silica Gel 60 with concentrating zone</td><td>Analytical Chromatograhy Millipore</td><td>1.11845.0001</td><td></td></tr><tr><td>Iodine chips</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>376558-50G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>Manganese chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>UVP EC3 Imaging System</td><td>Ultra-Violet Products Ltd.</td><td></td><td>Use the Vision Works LS software for densitometry analysis</td></tr><tr><td>Glass bottom confocal dish</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10C</td><td>www.glassbottomdishes.com</td></tr><tr><td>Cryptococcus neoformans (H99)</td><td></td><td></td><td>Obtained from Duke University Medical Center</td></tr><tr><td>YNB</td><td>BD</td><td>239210</td><td>See manufacturer for preparation instructions. Use a glucose concentration of 20 g/L.</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide</td><td>Sigma</td><td>L4391-1MG</td><td>Dissolve in 1x PBS to make 1 mg/ml stock. Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Interferon gamma</td><td>Sigma</td><td>I4777</td><td>Dissolve in 1x PBS to make 0.1 mg/ml stock solution</td></tr><tr><td>Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM)</td><td></td><td></td><td>Gift from Arturo Casadevall&#039;s Lab concentration is 1.98 mg/ml</td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>MP Biomedicals</td><td>194591</td><td>Dissolve 0.8 g of Giemsa in 25 ml of glycerol and heat to 60 &amp;deg;C for 1 hr. Add 25 ml of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month.</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images</td></tr></tbody></table>

macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of cryptococcus neoformans

A criptococose é uma infecção potencialmente fatal causada por fungos patogênicos do gênero Cryptococcus. A infecção ocorre quando da inalação de esporos, que são capazes de replicar no pulmão profundo. A fagocitose por macrófagos de Cryptococcus é uma das formas que a doença é capaz de se espalhar para o sistema nervoso central para causar meningoencefalite letal. Portanto, o estudo da associação entre Cryptococcus e macrófagos é importante para entender a progressão da infecção. O presente estudo descreve um protocolo passo-a-passo para estudar macrófagos infecciosidade por C. neoformans in vitro. Usando este protocolo, o papel de esteróis de acolhimento em interações patógeno-hospedeiro é estudado. Diferentes concentrações de metil - ciclodextrina (MCD) foram usadas para esgotar o colesterol do sarcoma murino retículo semelhantes a macrófagos linha celular J774A.1. Depleção de colesterol foi confirmada e quantificada utilizando tanto um dis comercialmentee kit de colesterol quantificação e cromatografia em camada fina. Células de colesterol empobrecido foram activadas utilizando lipopolissacarídeo (LPS) e interferão gama (IFNy) e infectados com opsonizadas com anticorpos Cryptococcus neoformans de tipo selvagem em células H99 uma razão efector-para-alvo de 1: 1. As células infectadas foram monitorados após 2 horas de incubação com C. neoformans e seu índice fagocitário foi calculado. Depleção de colesterol resultou numa redução significativa do índice de fagocitose. Os protocolos apresentados oferecer um método conveniente para imitar o início do processo de infecção em ambiente de laboratório e estudar o papel da composição lipídica alojamento na infectividade.

Colesterol Esgotamento Análise do sobrenadante reservado no passo 1.3 do protocolo, seguindo as instruções do fabricante no kit de Ensaio de Colesterol Amplex Red produz uma concentração elevada de colesterol na amostra MβCD tratados em comparação com o controlo de PBS 1x. Dependendo do tipo de célula e a depleção de colesterol concentração MβCD utilizada pode variar. Para J774 tratados com 10 mM de MβCD, foi observada uma diminuição de aproximadamente 50%. A depleção pode se...

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Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Macrófago Colesterol Exaustão e seu efeito sobre a fagocitose de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

macrophage-cholesterol-depletion-its-effect-on-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

12.7K visualizações.  Stony Brook University. In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections. 

Vídeo: Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

Depleção e reconstituição de macrófagos em Ratos

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Imunologia e Infecção

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

Live-célula Microscopia vídeo de Fagocitose patógeno fúngico

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

Avaliar a atividade anti-fúngica isolada de macrófagos alveolares por microscopia confocal

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

A visualização não-lítica exocitose de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; De macrófagos Usando Digital Microscopia de Luz

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Técnica High Throughput Fluorometric de Avaliação da macrófago fagocitose e actina Polimerização

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

Cultura de macrófagos macrófagos Colony estimulante fator diferenciado Humano monócitos derivados

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

Métodos de estudo de lipídios Alterações nos neutrófilos ea subsequente formação de neutrófilos Extracelular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics have been at the forefront. They interact with and regulate immune cell activity. The focus of this study is the MSC regulation of macrophage phagocytic activity. Macrophage (M&#934;) phagocytosis is an important part of the innate immune system response to infection, and the mechanisms through which MSC modulate this response are under active investigation. Presented here is a method to study M&#934; phagocytosis of non-opsonized zymosan particles conjugated to a pH-sensitive fluorescent molecule while in co-culture with MSC. As phagocytic activity increases and the labeled zymosan particles are enclosed within the acidic environment of the phagolysosome, the fluorescence intensity of the pH-sensitive molecule increases. With the appropriate excitation and emission wavelengths, phagocytic activity is measured using a fluorescent spectrophotometer and kinetic data is presented as changes in relative fluorescent units over a 70 min period. To support this quantitative data, the change in the phagocytic activity is visualized using dynamic imaging. Results using this method demonstrate that when in co-culture, MSC enhance M&#934; phagocytosis of non-opsonized zymosan of both naive and IFN-&#947; treated M&#934;. These data add to the current knowledge of MSC regulation of the innate immune system. This method can be applied in future investigations to fully delineate the underlying cellular and molecular mechanisms.

Presented here is a protocol to quantify and produce dynamic images of mesenchymal stem cell (MSC) mediated regulation of macrophage (M&#934;) phagocytosis of non-opsonized yeast (zymosan) particles that are conjugated to a pH-sensitive fluorescent molecule.

Regulação de células-tronco mesenquimais da fagocitose macrófago; Quantitação e Imagem

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

The Effect of Aspirin and Ibuprofen on the Phagocytic Ability of Macrophages

This video showcases a method to assess the impact of aspirin and ibuprofen, at their minimum inhibitory concentrations, on macrophage phagocytosis using pH-sensitive fluorescent dye-stained fungal cells. The drugs inhibit cyclooxygenase-2, decreasing prostaglandin formation and boosting macrophage phagocytosis, as observed through fluorescence measurements of pH-sensitive dye.

O efeito da aspirina e do ibuprofeno na capacidade fagocítica dos macrófagos

1. Safety considerations

	Personnel should use personal protective equipment (PPE).
	Handle the pathogen and macrophages in a Class II Biological safety ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Imunologia

Imunodiagnóstico

Cellular Immunodiagnostics

Effect of Aspirin and Ibuprofen on Phagocytic Ability of Macrophages

Begin with a culture of the murine macrophage cell line, grown in complete RPMI 1640 medium, as described in the text protocol.
Additionally, prepare a culture of Cryptococcus neoformans resuspended in PBS to the desired concentration, as mentioned in the text protocol.&#160;
To stain the cryptococcal cells with the phagocytosis stain, dispense 999 microliters of the cells into a microcentrifuge tube. Add 1 microliter of the stain to the tube. Incubate the cells for 1 hour at room temperature, in the dark, with slow agitation.
After incubation, wash the cells by first centrifugation. Then, discard the supernatant. Resuspend the cells with PBS and repeat the washing step two additional times.
Dispense 100 microliters of the Cryptococcus neoformans cell suspension into the wells of the 96-well plate containing the cultured macrophages.
To study the effect of the test drugs on macrophage phagocytosis, dispense 100 microliters of the desired test drug into appropriate wells of the 96-well plate as described in the text protocol.
Incubate the plate in a carbon dioxide incubator for 2 to 6 hours. At the end of the incubation, measure the fluorescence from the phagocytic stain.

Macrófago Colesterol Exaustão e seu efeito sobre a fagocitose de

Resumo

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