Este trabalho foi suportado por um &#39;Grant em Ajuda de Pesquisa &quot;da Fundação de Crohn e Colite do Canadá para LMS, que é apoiado por uma Associação Canadense de Gastroenterologia / Canadian Association of Health Research / Crohn e da Fundação Colite do Canadá Investigator Award Nova.

1. Os macrófagos destroem Usando clodronato contendo lipossomas <ol><li> Os lipossomas são armazenados a 4 ° C. Duas horas antes da injecção, remover o clodronato contendo lipossomas, PBS contendo lipossomas, ou PBS estéril (injecção de controlo) a partir do refrigerador para permitir que eles se adapte à temperatura ambiente (18 ° C). </li><li> Inverter os tubos contendo lipossomas 8-10 vezes para assegurar uma distribuição uniforme antes de carregar 200 ul para uma seringa de 1 ml. Anexar uma agulha de calibre 26 para o topo da seringa. </li><li> Usando a sua mão esquerda nuca, o mouse logo abaixo das orelhas que prendem a pele o suficiente para imobilizar a sua cabeça e membros. </li><li> Inclinar a rato pelo que a sua cabeça é ligeiramente para o chão de modo órgãos internos afastar-se do local de injecção, que está localizado no quadrante inferior direito do abdómen. </li><li> Rolar a seringa entre as palmas das mãos e invertê-lo 6 vezes para distribuir uniformemente a solução de lipossomas antes da injeção. </li> &lt;li&gt; Inserir a agulha no lado inferior direito do abdômen do mouse em um ângulo de 30-40. Injectar 200 uL de solução de lipossoma ou PBS. </li><li> Durante um modelo de inflamação induzida, como DSS induzida colite, injectar ratinhos 4 dias antes do início da inflamação experimental para assegurar a depleção de macrófagos residentes e cada 2 dias, durante o protocolo de esgotar novos macrófagos infiltrantes. </li><li> No final da experiência, juntamente com planeadas análises experimentais, remover os tecidos a partir do local de interesse e fixar com paraformaldeído para confirmar a depleção de macrófagos por coloração imuno-histoquímica. </li></ol> 2. Derivação de macrófagos polarizadas de aspirados de medula óssea <ol><li> A medula óssea de ratinhos entre 8 e 12 semanas de idade fornece o maior rendimento de osso derivadas de medula macrófagos. Euthanize o mouse, coloque-o em suas costas, e fechar as suas patas, esticando seus membros, tanto quanto possível. </li><li> Trabalhando em um estéril hood, remova o fémur ea tíbia, cortando tanto músculo como possível. </li><li> Lave medula de ossos utilizando IMDM com FCS 10% carregado para uma seringa de 5 ml equipado com uma agulha de calibre 26. </li><li> Diluir aspirados de medula óssea para 40 ml em IMDM com FCS 10%, as células lugar em um frasco de cultura de 75 centímetros 2 de tecido, e incubar a 37 ° C, 5% de CO2 durante 4 horas. Este passo remove aderentes células mesenquimais ou macrófagos maduros a partir de progenitores hematopoiéticos. </li><li> Sobrenadante de cultura contendo transferência não-aderentes progenitores a um cónico de 50 ml tubo Falcon e centrifugar durante 5 min a 1200 rpm. </li><li> Ressuspender o sedimento de células em 5 ml IMDM, FCS 10% e contar as células nucleadas, diluindo suspensão de células em 1 20 em ácido acético. Este procedimento lisa todas as células, incluindo células vermelhas do sangue e os núcleos restante pode ser contadas num hemocitómetro. </li><li> Ressuspender as células a uma concentração de 0,5 x 10 6 células / ml em meio completo; IMDM, FCS 10%, 150 uM monotioglicerol (MTG), e 10 ng / ml de MCSF, GM-CSF, ou IL-3. MCSF macrófagos derivados de macrófagos activados são classicamente enquanto os macrófagos GM-CSF ou IL-3-derivados são alternativamente activados. </li><li> Substituir médio em dias 4, fiação para baixo as células não aderentes e devolvê-las para o balão, e no dia 7, descartando as células não aderentes. </li><li> Além disso, IFNy (10 ng / ml) ou IL-4 (10 ng / ml) podem ser adicionados para frascos contendo MCSF células derivadas ao dia 7 de macrófagos inclinar para um. Classicamente activado ou um fenótipo alternativamente activados, respectivamente Incubar as células durante 3 dias. </li><li> No dia 10, meios de comunicação e remover levantar células fora do balão de cultura de tecidos utilizando tampão de dissociação celular (Gibco-BRL). O local de 5 ml de tampão em células durante 5 min à temperatura ambiente (18 ° C) e, em seguida, bater a parede lateral do balão com o calcanhar da palma da mão vezes firmemente vários. Assegurar que as células têm levantado para fora do frasco através da análise do balão sob umamicroscópio. Pipetar ressuspensas células em uma cónico de 15 ml tubo Falcon e lavar o frasco com um adicional de 10 ml de IMDM, 10% de FBS. Piscina e girar as células por 5 min a 300 × g. </li><li> Contar as células viáveis ​​utilizando um hemocitómetro e ressuspender a uma concentração de 10 7 células / ml em PBS estéril pH 7,4. Os macrófagos estão prontos para injeção em ratos. </li><li> Reserve 1,0 × 10 6 macrófagos para a avaliação do fenótipo de macrófagos. Macrófagos activados Classicamente estimuladas com níveis elevados de lipopolissacarídeo secretam óxido nítrico e os níveis de IL-12p70 e baixos de IL-10 em comparação com os macrófagos alternativamente activados. Macrófagos alternativamente activados expressam constitutivamente YM1 e arginase I (Argi), que pode ser detectado por inmunotransferência. </li></ol> 3. Tranferring Macrófagos em Ratos <ol><li> Ressuspender macrófagos em PBS estéril a uma concentração de 10 7 células / ml. Isto permite a um eminjecção venosa de 10 6 macrófagos em um volume total de 100 uL, que é um volume que pode ser segura e confortavelmente injectada em ratinhos pela veia da cauda. </li><li> Ratinhos quente usando uma almofada de aquecimento ou colo de calor durante 5-10 min para dilatar a veia da cauda. Monitore o mouse em todos os momentos de sinais de hipertermia. </li><li> Transferir o rato para um dispositivo de retenção que permite o acesso para as veias da cauda. </li><li> Rodar a cauda 90 ° de modo que a veia é voltada para cima. Veias corre lateralmente para baixo ambos os lados da cauda e, ou veia pode ser usado. </li><li> Limpar o local de injecção com uma compressa com álcool e injectar lentamente 100 ul (10 6 macrófagos) usando uma seringa de 1 ml com uma agulha de calibre 26 ou 28. Inserir a agulha com o lado voltado para cima bisel e com um ângulo ligeiro, quase paralelamente à veia. </li><li> Se a agulha é inserida corretamente nenhuma resistência deve ser sentida e da veia deve ficar claro após a injeção. Se a agulha não se encontra naveia, a cauda vai bojo. Se isso acontecer, remover a agulha e tente novamente proximal para a última tentativa ou na veia outro. Uma nova agulha deve ser utilizada para cada injecção como a cauda é resistente e as agulhas se tornar opaca rapidamente durante a injecção veia da cauda. </li><li> Após a injecção, retire a agulha, aplique uma leve pressão ao local da injeção até o sangramento parar, e monitorar o mouse para um 5min adicional para garantir que o sangramento parou. </li><li> Repita injecções de macrófagos cada 4 dias para assegurar um fornecimento contínuo de macrófagos polarizadas durante o procedimento experimental. </li><li> No final da experiência, juntamente com análises experimentais, remover os tecidos a partir do local de interesse e fixar com paraformaldeído ou de formalina para confirmar a entrega eficaz de macrófagos polarizados por coloração imuno-histoquímica. </li></ol> 4. Os resultados representativos O número e fenótipo das macrop residentehages em qualquer dado tecido depende do tecido a ser examinado e irá alterar durante a infecção ou inflamação. Do mesmo modo, a capacidade do clodronato lipossomas contendo a esgotar macrófagos de um tecido vai depender da via de administração e entrega eficaz para o tecido alvo. Injecção intraperitoneal de resultados clodronato contendo lipossomas em uma diminuição no F4/80 + macrófagos no cólon do rato durante DSS induzida colite evidente por coloração imuno-histoquímica para o marcador de macrófagos, F4/80 (Figura 1A). Coloração histológica também pode ser utilizado para determinar diferenças quantitativas em número de macrófagos e fenótipo em secções de tecido. A Figura 1B mostra que uma média de 55% de macrófagos é esgotada por clodronato lipossomas contendo comparação com nenhuma depleção detectada em dois pontos de rato quando os ratinhos são injectados com PBS sozinho como um controlo de injecção. Cada valor é determinado pela contagem de F4/80 e Argi manchaed células positivas em cortes de tecido de série dos 6 camundongos com 3 pontos, em 3 seções por rato com a contagem que está sendo executada por dois indivíduos cegos para a condição experimental. Estes resultados demonstram que injecções intraperitoneais de lipossomas clodronato empobrecem macrófagos de cólon em ratinhos. Derivação de macrófagos da medula óssea na presença de factores de crescimento diferentes rendimentos macrófagos que são classicamente activados (MCSF-derivado ou MCSF-derivada e tratado com IFN-y) ou alternativamente activados (GM-CSF ou IL-3-derivada ou MCSF-derivada e tratados com IL-4). Lavagem da medula óssea a partir de 2 fémures e tíbias 2 a partir de um rato 8 semanas de idade normalmente produz 6 × 10 7 células nucleadas por rato e os rendimentos de 8 × 10 6 MCSF-macrófagos derivados de 10 × 10 6 GM-CSF-macrófagos derivados, ou 12 × 10 6 IL-3-macrófagos derivados. A Figura 2A mostra o nitrito eo rácio IL-12p70/IL-10 em macrófagos supernatants tratado com lipopolissacarídeo durante 24 horas Figura 2B mostra uma análise de mancha ocidental típica de 0,5 x 10 6 MCSF macrófagos de + / -. IL-4 condições de derivação sondadas com anticorpos para marcadores de macrófagos alternativamente activados, Argi e YM1, ou com GAPDH como um carregamento de controle. Estes dados demonstram que derivadas da medula óssea macrófagos pode ser inclinado para um fenótipo polarizada durante derivação. Transferência eficaz de ex vivo macrófagos derivados polarizados para um tecido é dependente da via de administração eo acesso ao tecido. Durante DSS induzida colite, macrófagos injectado por via intravenosa viajar para o local da inflamação e macrófagos alternativamente activados reduzir a gravidade da doença. Figura 3A mostra o número total de macrófagos e do número de macrófagos Argi + (alternativamente activados) contados em secções histológicas de ratinhos injectados com polarizada medula ósseaDerivado de macrófagos. O impacto da transferência de macrófagos polarizados para o cólon durante DSS induzida colite é mostrado pelo índice de actividade da doença, uma pontuação de aditivo com base na perda de peso, sangramento rectal, e consistência das fezes diminuiu (Figura 3B). Estes resultados demonstram que ex vivo derivado, macrófagos adotivamente transferidos podem tráfego para o cólon e inflamação induzida por impacto. Macrófagos M1 não impactar inflamação enquanto os macrófagos M2 reduzir significativamente o índice de atividade da doença. <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig1.jpg" alt="A Figura 1"/> Figura 1. Clodronato contendo lipossomas eficazmente empobrecem F4/80 + e F480 + + Argi células em dois pontos de rato in vivo. Uma geração F2 de ratinhos do tipo selvagem em um C57BL misto / 6 × fundo 129Sv foram dadas DSS 5% durante 7 dias e IP injectado com PBS (controlo) ou clodronato lipossomas contendo (clodronato) 4 dias antes da DSS tratamentoe nos dias 0, 2, 4, e 6, durante o tratamento DSS. (A) Colons foram removidos, fixados, e as secções foram coradas por imuno-histoquímica para macrófagos maduros (F4/80) eo marcador de macrófagos M2, Argi. (B) A determinação quantitativa de F4/80 + e Argi + de macrófagos. Células positivamente coradas foram contados por dois indivíduos cegos a condição experimental em uma ampliação de 40 × em 6 campos de 3 seções / mouse e de 6 ratos / grupo. * P &lt;0,01. <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig2.jpg" alt="A Figura 2"/> Figura 2. MCSF macrófagos derivados de expressar um fenótipo classicamente activado e MCSF macrófagos derivados de tratados com IL-4 expressar um fenótipo de macrófagos alternativamente activados. (A) Em conformidade com um fenótipo classicamente activado, MCSF macrófagos derivados de produzir níveis mais elevados de óxido nítrico em resposta a lipopolissacárido e pode ser medido pelo ensaio de Griess, que detecta o seu metabolito jusante nitrito,. Eles alsó produzir uma maior proporção IL-12p70/IL-10, que pode ser medido por ELISA. * P &lt;0,01 para n = 3. (B) Em conformidade com um fenótipo alternativamente activados, MCSF macrófagos derivados de tratados com IL-4 constitutivamente expresso YM1 e Argi, que pode ser detectado por imunotransferência Western. Os dados são representativos de 3 experiências independentes com resultados semelhantes. <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig3.jpg" alt="A Figura 3"/> Figura 3. Injectado por via intravenosa, ex-vivo derivado alternativamente activados tráfego macrófagos para o cólon e reduzir a inflamação intestinal. Uma geração F2 de ratos selvagens em um misto C57BL / 6 × 129Sv fundo foram dadas 5 DSS% na água de beber durante seis dias. Macrófagos M1 e M2 foram injetados IV nos dias 0 e 4 durante o tratamento DSS. (A) Colons foram removidos, fixados, e as secções foram coradas por imuno-histoquímica para macrófagos maduros (F4/80) e um marcador de macrófagos M2 (Argi).A determinação quantitativa dos macrófagos para ratinhos de controlo de PBS injectados (C), ratinhos injectados com macrófagos M1 (+ M1) e ratinhos injectados com macrófagos M2 (+ M2) foram realizadas por contagem de células coradas positivamente a uma ampliação de 40 × em 6 campos a partir de 3 secções / ratinho ea partir de 6 ratinhos / grupo. Contagem foi realizada por dois indivíduos cegos para a condição experimental. (B) A atividade da doença foi monitorada e marcou diário durante o tratamento e é uma pontuação aditivo com base na perda de peso, sangramento retal, e consistência das fezes diminuiu. * P &lt;0,05 para n = 6 ratos em 2 experimentos independentes.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Os macrófagos são células fagocíticas que desempenham um papel importante no sistema imune. Eles são responsáveis ​​por iniciar a resposta imune inata e direcionar a resposta imune adquirida. Tipicamente, os macrófagos activados classicamente são activados por IFNy ou LPS e são responsáveis ​​pela eliminação de patógenos e montar uma resposta inflamatória 1. Inversamente, os macrófagos alternativamente activados são activados por IL-4 ou IL-13 e desempenhar um papel na detritos de limp...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> O clodronato lipossomas contendo </td><td> <a href="http://Clodronateliposomes.org" target="_blank">Clodronateliposomes.org</a> </td><td></td></tr><tr><td> PBS contendo lipossomas </td><td> <a href="http://Clodronateliposomes.org" target="_blank">Clodronateliposomes.org</a> </td><td></td></tr><tr><td> PBS estéril pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Invitrogen </td><td> 12440 </td></tr><tr><td> Soro fetal de vitelo (FCS) </td><td> Invitrogen </td><td> 12483 </td></tr><tr><td> ácido acético </td><td> BDH Aristar </td><td> BDH3092-500MLP </td></tr><tr><td> Monotioglicerol (MTG) </td><td> Sigma </td><td> 96-275 </td></tr><tr><td> Recombinant murino MCSF </td><td> Stemcell Technologies </td><td> 02951 </td></tr><tr><td> Recombinante murino GM-CSF </td><td> Stemcell Technologies </td><td> 02935 </td></tr><tr><td> Recombinante IL-3 murina </td><td> Stemcell Technologies </td><td> 02903 </td></tr><tr><td> Recombinante murino IFN-y </td><td> Stemcell Technologies </td><td> 02746 </td></tr><tr><td> Recombinante IL-4 de murídeo </td><td> Stemcell Technologies </td><td> 02714 </td></tr><tr><td> Tampão de dissociação celular </td><td> Invitrogen </td><td> 13150-016 </td></tr><tr><td> Rato anti-F4/80 Anticorpo </td><td> Abd Serotec </td><td> MCA497GA </td></tr><tr><td> Rato de anticorpos anti-Argi </td><td> Transdução de Laboratórios BD </td><td> 610708 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Reagentes específicos utilizados neste protocolo.

depletion and reconstitution of macrophages in mice

Os macrófagos são jogadores importantes na resposta imune inata ao desafio infecciosa ou lesão, iniciando a resposta imune inata e direcionar a resposta imune adquirida. Macrófago disfunção pode levar a uma incapacidade para montar uma resposta imune adequada e, como tal, tem sido implicada em muitos processos de doença, incluindo doenças inflamatórias intestinais. Macrófagos exibir fenótipos polarizadas que são amplamente divididos em duas categorias. Macrófagos activados Classicamente, activado por estimulação com IFN-y ou LPS, desempenham um papel essencial na resposta ao desafio bacteriano enquanto os macrófagos alternativamente activados, activado por IL-4 ou IL-13, participar em detritos de limpeza e remodelação do tecido e têm sido implicados na resolução fase de inflamação. Durante uma resposta inflamatória in vivo, os macrófagos são encontrados no meio de uma mistura complexa de infiltração de células imunes e podem participar de exacerbando ou Resolvininflamação g. Para definir o papel de macrófagos in situ num modelo animal como um todo, é necessário examinar o efeito de esgotar macrófagos a partir do ambiente complexo. Para fazer perguntas sobre o papel do fenótipo de macrófagos in situ, fenotipicamente definidos macrófagos polarizadas podem ser derivadas ex vivo, a partir de aspirados de medula óssea e adicionada de volta para ratos, com ou sem depleção prévia de macrófagos. No protocolo aqui apresentado clodronato contendo lipossomas, versus controlos injectados com PBS, foram utilizados para esgotar macrófagos do cólon durante dextrano sulfato de sódio (DSS)-colite induzida em ratos. Além disso, os macrófagos foram derivados polarizadas ex vivo e transferidos para ratinhos por injecção intravenosa. Uma advertência a esta abordagem é que os lipossomas contendo clodronato esgotar todos os fagócitos profissionais, incluindo ambas as células dendríticas e macrófagos de modo a assegurar o efeito observado por depleção de macrófagos é específico a reconstituição, ofenótipo f por transferência adoptiva de macrófagos é necessário. Depleção de macrófagos sistémica em ratinhos pode também ser conseguida por ratinhos retrocruzamentos sobre um fundo CD11b-DTR, que é um excelente abordagem complementar. A vantagem da depleção de clodronato contendo mediada por lipossomas é que ele não exige que o tempo ea despesa envolvidos em ratinhos retrocruzamentos e pode ser utilizado em ratinhos, independentemente do fundo dos ratinhos (C57BL / 6, BALB / c, ou fundo misto ).

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Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Os macrófagos desempenham um papel central na homeostase e patologia em muitos tecidos. O protocolo apresentado aqui descreve métodos para esgotar macrófagos<em&gt; In vivo</em&gt;, Derivando macrófagos polarizadas de aspirados de medula óssea, e adotivamente transferência de macrófagos em camundongos. Estas técnicas permitem a determinação do papel que os macrófagos desempenham polarizadas na saúde e na doença.

Depleção e reconstituição de macrófagos em Ratos

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

depletion-and-reconstitution-of-macrophages-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

39.4K visualizações.  University of British Columbia. Os macrófagos desempenham um papel central na homeostase e patologia em muitos tecidos. O protocolo apresentado aqui descreve métodos para esgotar macrófagos In vivo, Derivando macrófagos polarizadas de aspirados de medula óssea, e adotivamente transferência de macrófagos em camundongos. Estas técnicas permitem a determinação do papel que os macrófagos desempenham polarizadas na saúde e na doença.

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Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

Esgotamento das populações de células específicas de Esgotamento Complemento

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Imunologia e Infecção

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

Estudo da fagolisossomo Biogenesis em macrófagos ao vivo

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Utilização de<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Para estudar interações Autophagy-Cytoskeleton

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

Assassino Artificial células apresentadoras de antígenos (KaAPC) para a eficiente<em&gt; In Vitro</em&gt; Depleção de células T humanas antígeno específico da

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

Proteômica Profiling de macrófagos por eletroforese 2D

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Macrófago Colesterol Exaustão e seu efeito sobre a fagocitose de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Quantificação de citosólico vs vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; Em macrófagos primários por Permeabilização Diferencial

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolamento de Salmonella typhimurium-contendo Phagosomes de macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Tuning Degradation to Achieve Specific and Efficient Protein Depletion

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting them for degradation. This system is exploited in many non-plant eukaryotes, such that a target protein, tagged with the AID motif, is degraded upon auxin addition. The level of TIR1 expression is critical; excessive expression leads to degradation of the AID-tagged protein even in the absence of auxin, whereas low expression leads to slow depletion. A &#946;-estradiol-inducible AID system was created, with expression of TIR1 under the control of a &#946;-estradiol inducible promoter. The level of TIR1 is tunable by changing the time of incubation with &#946;-estradiol before auxin addition. This protocol describes how to rapidly deplete a target protein using the AID system. The appropriate &#946;-estradiol incubation time depends on the abundance of the target protein. Therefore, efficient depletion depends on optimal timing that also minimizes auxin-independent depletion.

Here, we present a protocol to effectively and specifically deplete a protein of interest in the yeast Saccharomyces cerevisiae using the &#946;-est AID system.

Ajustando a degradação para conseguir a depleção de proteína específica e eficiente

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting ...