Gostaríamos de agradecer ao Dr. Claycomb para fornecer células HL-1 e protocolo de manutenção detalhado. Gostaríamos também de agradecer Ms. Elena Carrillo e Dr. Seth Robia por sua assistência com a geração de o filme celular e Mr. Pete Caron por sua ajuda com fazer alguns acessórios para o nosso sistema de mapeamento óptico de canal duplo. Este trabalho foi financiado pela American Heart Association (10GRNT3770030 &amp; 12GRNT12050478 para XA), os Institutos Nacionais de Saúde (HL113640 para XA) e Loyola Fundo de Desenvolvimento Research University (a XA).

1. Preparação de Solução <ol><li> Solução Norepinefrina (NP) <ol><li> Dissolver 40 mg de NP em 25 ml de ácido ascórbico 30 mM (0,1475 g de ácido ascórbico em 25 ml de água purificada Milli-Q (MQ). Evite a exposição à luz directa durante esta preparação solução porque norepinefrina (NP) é sensível à luz. </li><li> Filtra-se a solução de NP com um filtro de seringa de 0,22? M. Alíquota da solução em 1 ml microtubos estéreis e armazenar a -20 ° C. Uma vez congelado, NP é estável durante um mês. </li></ol></li><li> Meios suplementados Lave e Final Claycomb <ol><li> Comece com 43,5 ml de meio Claycomb e suplementar com 5 ml de soro fetal bovino (FBS), 0,5 ml de penicilina / estreptomicina, 0,5 ml de NP e de 1: 100 diluído L-glutamina para fazer 50 ml de meio suplementado Claycomb final. Evite a exposição à luz directa durante esta preparação solução porque médio Claycomb é sensível à luz. </li><li> Preparar o meio de lavagem Claycomb usando a mesma receita que a supmédio mentado Claycomb exceto adicionar 5% FBS e omitir o NP e componentes L-glutamina. NOTA: A mídia Final e Wash Claycomb complementado são boas por duas semanas, quando armazenado a 4 ° C, sem exposição à luz direta. </li></ol></li><li> Soja solução inibidora de tripsina <ol><li> Dissolve-se 25 mg de inibidor de tripsina de soja em 100 ml de Ca e Mg livre-livre de soro fisiológico tamponado com fosfato de Dulbecco (PBS). </li><li> Filtrar a solução através de um filtro de seringa de 0,22? M. NOTA: A solução esterilizada é estável durante vários meses, quando armazenada a 4 ° C. </li></ol></li><li> Solução de gelatina / Fibronectina revestimento prato <ol><li> Dissolve-se 0,1 g de gelatina em 500 ml de água para fazer MQ 0,02% de gelatina. </li><li> Autoclave, então diluir 1 ml de fibronectina em 199 ml de 0,02% de gelatina e misture delicadamente. </li><li> Aliquota 6 ml de solução de gelatina em tubos separados e armazenar a -20 ° C. </li></ol></li><li> Solução de sal de Hanks <ol><li> Usando um rebuliçoplaca, dissolver os seguintes sais em água MQ (mmol / L), NaCl (136,9), KCl (5.366), KH 2 PO 4 (0,4409), NaH 2 PO 4 (0,4 mil), MgSO 4 (0,8142), D-Glc (5.051), NaHCO 3 (4.162), HEPES (5.042), CaCl 2 (1,261). </li></ol></li><li> Solução corante sensível ao cálcio (Rhod2) <ol><li> Dilui-se 1 mg de pó seco Rhod2 em 400 ul de 20% de Pluronic F-127 em DMSO para fazer uma solução estoque Rhod2 tingir e armazenar a -20 ° C. </li><li> Dilui-se esta solução de reserva de 1: 1000 com uma solução de sal de Hanks para fazer uma solução de trabalho final antes do início da experiência. </li></ol></li><li> Solução de corante sensível Tensão (Rh237) <ol><li> Dilui-se 5 mg de Rh237 com 2 ml de DMSO para fazer uma solução estoque e armazenar a -20 ° C. Dilui-se a solução stock de 1: 1000 com uma solução de sal de Hanks para fazer uma solução de trabalho final antes do início da experiência. </li></ol></li></ol> &amp; #160; NOTA: 1-4 soluções baseiam-se no protocolo de HL-1 de cultura de células Claycomb com pequenas modificações. 2. Passaging e Cultivo HL-1 atriais miócitos em lamelas NOTA: As células HL-1 pode ser obtido a partir de Dr. Claycomb (Louisiana State University). <ol><li> Crescer HL-1 células em frascos T25 e alimentar com 5 ml de suplementado Claycomb Medium diárias. Passagem as células em frascos T25 de cinco em cinco dias de acordo com o protocolo de HL-1 de cultura de células Claycomb (descrito abaixo) 10. </li><li> Coloque as lamelas circulares (20 mm de diâmetro) em 12 placas de cultura de 24 horas antes das células no frasco T25 confluente são totalmente e pronto para ser passado, e então cobrir as lamelas com gelatina / fibronectina durante a noite a 37 ° C. </li><li> No dia seguinte, aspirado e descartar a gelatina / fibronectina a partir das placas de cultura e substitua com 1,5 ml de meio suplementado Claycomb final em cada poço. </li><li> Dividir células de uma cultur T25e após atingir confluência balão cheio no dia 5. Aspirar o meio do frasco T25 contendo a cultura confluente e enxaguar a cultura brevemente com PBS a 37 ° C. </li><li> Aspirar PBS e adicionar 3 ml de 0,05% de tripsina / EDTA a 37 ° C por pipetagem a tripsina / EDTA para o fundo do frasco T25 para evitar o contacto directo com as células. Incubar a 37 ° C durante 1 min. </li><li> Remover tripsina / EDTA por aspiração e adicionar outros 1,3 ml de tripsina / EDTA por frasco T25. Incubar à temperatura ambiente durante 1 min. Examinar ao microscópio e se as células que ainda estão presos ao balão, toque para desalojar completamente as células restantes. </li><li> Adicionar 1,3 ml de inibidor de tripsina de soja para as células e as células de transferência de balão para um tubo de centrífuga de 15 ml. Lavar o balão vazio com 5 ml de meio de lavagem Claycomb. Adicionar a água para as células no tubo de centrifugação de 15 ml. Centrifugar a 500 xg durante 5 min. </li><li> Após a centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento celularem 6 ml de meio suplementado Claycomb final. </li><li> Semente cada poço de uma placa de 12 poços com 0,5 ml de suspensão de células a partir de passagens em células. Alimente as células com meio suplementado final Claycomb fresca diariamente. NOTA: Estreitamente monitorar o crescimento das células, tipicamente as monocamadas de células confluentes atingir o estatuto no dia 4 e as actividades espontâneas permanecem visíveis. Em seguida, a monocamada cultivadas estará pronto para mapeamento óptico no dia 4-5. </li></ol> 3. Carregamento de cálcio e de tensão Corantes sensíveis às células <ol><li> Para os estudos de mapeamento de óptica, remova cuidadosamente a lamela do 12-placa de cultura de células e enxaguar com solução salina de Hanks. </li><li> Para corar as células com o corante sensível ao Ca Rhod2, incubar a monocamada de células na lamela com 3 ml da oxigenado (borbulhar com 5% de CO 2/95% O 2 gás) a solução de trabalho Rhod2 a 37 ° C em banho-maria durante 30 min . </li><li> Para manchar as células com corante sensível V mRh237, imergir o Rhod2 monocamada celular carregado em 3 ml de solução de trabalho de Rh237 oxigenada a 37 ° C num banho de água durante mais 15 min. </li></ol> Mapeamento 4. Dual Channel Optical <ol><li> Coloque a monocamada de células, que é o dobro-coradas com corantes V m e Ca, em uma câmara de circulação de um microscópio de fluorescência invertido. Usar um sistema de circulação aquecido para manter a temperatura da câmara da célula, a 35 ± 1 ° C. Controlar cuidadosamente a temperatura do perfusado, ajustando a velocidade do fluxo que circula através da câmara, para evitar um gradiente de mais do que 0,3 ° C ao longo da câmara. <ol><li> Antes de gravar V m / sinais de Ca, lava-se a monocamada de células com solução de Hanks fresco durante aproximadamente 5 minutos para remover o corante que permanece nos passos anteriores de coloração. </li></ol></li><li> Pace monocamadas de células saudáveis, usando um eletrodo bipolar composta de uma pipeta de vidro preenchido com solução salina de Hanks e um silver fio espiral ao redor da ponta da pipeta, como descrito anteriormente 12,17. </li><li> Pace monocamadas de células saudáveis ​​em um comprimento de ciclo de 200-500 ms e pulso largura de 2 ms, à espera de um limiar de estimulação em aproximadamente 1 mV. NOTA: Para cada lote de monocamadas de cultura, pelo menos, duas monocamadas não tratadas devem ser utilizados para testar o estado do lote de células. As monocamadas de controlo saudáveis ​​deve ser capaz de ser capturada por estimulação eléctrica em comprimentos de ciclo de 200-500 ms. Se as monocamadas de controlo falhar para ser electricamente estimulado, isto sugere que o lote de célula inteira pode não ser adequado para as experiências de mapeamento óptico. </li><li> Para excitar tanto V m e corantes sensíveis Ca, use uma fonte de luz LED (520 nm de comprimento de onda), acoplado com um filtro de excitação (510 nm / 40) e um espelho dicróico (561 nm). <ol><li> Recolha os sinais fluorescentes emitidos pelas células através de uma objetiva de 40X e dividir com um espelho dicróico (594 nm) em um componente V m e um componente Ca.Filtra-se a luz emitida no canal de m V com um filtro de passagem longa (700 nm) e a luz emitida no canal de cálcio, com um filtro de passagem de banda (585/40 nm). </li><li> Coletar a luz fluorescente filtrada usando duas câmeras CCD (80 x 80 pixels, 1.000 fps; RedShirt imagem). </li><li> Para evitar a fotodegradação de corante, para fazer gravações de menos de 2 segundos em cada campo de vista a limitar o tempo de exposição à luz. Aqui, normalmente imagem quatro áreas diferentes para cada monocamada. </li></ol></li></ol> 5. Processamento de Dados do V m ou Ca Recordings <ol><li> Para ambos os sinais Ca V (80 x 80 pixels) e m, calcular a média dos valores de intensidade de vinte e cinco (5 x 5) pixels vizinhos para um valor de intensidade, em diferentes pontos no tempo de gravação para reduzir o ruído de fundo. NOTA: Após a média de dados, cada ponto de um potencial de ação individual ou Ca transitória tempo de gravação gera uma matriz de dados que contém 16 x 16 em média valores de intensidade (médiacanais de dados) com uma resolução espacial de 50 um. </li><li> Definir o tempo de ativação (AT) de sinais de Ca gravado V m or. <ol><li> Para definir um tempo de activação (AT) de um potencial de acção individual ou Ca transiente, determinar o tempo de 50% da amplitude de pico do V, sinais de Ca utilizando um algoritmo baseado no MATLAB feito por encomenda ou m, tal como descrito anteriormente. 12 </li><li> Corrigir manualmente o ATs analisados ​​para eliminar quaisquer erros que possam ocorrer durante a análise do programa. </li><li> Armazenar o definido AT matriz (16 x 16 canais de dados média) de potencial de acção gravado e transiente de cálcio, respectivamente, no software usado. </li></ol></li><li> Calcular potencial de acção ou transientes de cálcio a velocidade de condução (CV) na matriz de vectores AT usando o método de análise do campo de vectores como descrito anteriormente com modificações menores 12,18. <ol><li> Calcula-se o vector de CV de um canal de dados em relação ao seu redor AT pontos de dados (5 ×; 5 vizinha média de canais de dados) para simular uma superfície lisa polinomial dos tempos de ativação (na superfície) usando um algoritmo de mínimos quadrados dentro do programa MATLAB 12,18. </li><li> Calcular condução vector utilizando as fórmulas abaixo Fórmula 1: <img alt="Equação 1" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52542/52542eq1.jpg" /> Fórmula 2: θ = arctan [(dy / dT) / (dx / dT)] NOTA: Ve é um vetor CV projetada em xey eixos; dx / dT é a projeção do vetor CV no eixo-x; dy / dT é a projeção do vetor CV no eixo-y. T é a superfície da AT; x, y referem-se a 2-D coordenadas; T x = ∂t / ∂x é a derivada parcial de T em relação a x; T y = ∂t / ∂y é a derivada parcial de T em relação à y; θ é a direcção final, de um vector de CV. </li><li> Grupo de todos os vetores da matriz AT em 36 vias, cada um dos quais abrange um sector de dez graus na bússola. &lt;/ Li&gt; <li> Seleccione o percurso que contém a maior população de vectores CV entre as 36 vias de condução. Calcule o CV média desta via para representar o CV da monocamada. </li></ol></li></ol> 6. A visualização da propagação da onda frontal <ol><li> Normalizar a intensidade do sinal de um potencial de acção individual ou Ca transiente em diferentes pontos de tempo de gravação em relação ao seu valor de pico utilizando o software MATLAB. </li><li> Armazenar temporariamente os dados de intensidade normalizadas de cada ponto de tempo gravado numa matriz 16 x 16 de intensidade no software Matlab utilizado. </li><li> Construa uma intensidade mapa colorido a partir da matriz de intensidade armazenado de cada ponto de tempo de gravação utilizando a função surf.m. NOTA: No mapa de intensidade, o vermelho representa alta intensidade do V sinais Ca m ou e azul reflete baixa intensidade dos sinais de fluorescência. </li><li> Criar um arquivo .avi usando a função avifile.m. </li><li> Guarde todo o imapas ntensity em momentos diferentes de gravação do potencial de ação ou Ca transiente usando a função addframe.m. NOTA: Neste ponto, dois arquivos AVI separadas de V m e propagação Ca será gerada. </li></ol>

<ol>
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No conflicts of interest declared.

Este artigo descreve os principais aspectos do mapeamento óptico em um culto HL-1 miócitos atrial monocamada coradas com cálcio e tensão corantes fluorescentes sensíveis. Ele inclui a cultura de um HL-1 monocamada de células ideal, configuração dos equipamentos de mapeamento, o mapeamento de uma monocamada de culto, e análise de dados. Para mapear com sucesso células em cultura, é a chave para preparar uma monocamada de células distribuídas uniformemente. Quando semear as célul...

A única cálcio (Ca) e tensão (V m) técnica de mapeamento óptico de canal duplo 1-5 está a emergir como uma ferramenta eficiente para gravar simultaneamente sinais V m e Ca em ambos os corações intactos e monocamadas de células em cultura. Esta técnica torna possível obter informações poderoso sobre a relação entre transientes de cálcio e os potenciais de acção para compreender melhor os mecanismos subjacentes electrofisiológicas de arritmias cardíacas. As monocamadas de células cultivadas têm provado ser um modelo útil para estudar celular electrofisiologia cardíaca e o mecanismo subjacente de arritmias. 4,6-8 células HL-1 são uma linha de cultura dos miócitos atriais bem caracterizado. Células HL-1 também manter um genótipo e fenótipo diferenciado com exclusividade, que inclui morfológica, eletrofisiológico, e as características farmacológicas dos miócitos atriais adultos. Estas células expressam genes e proteínas cardíacas, incluindo important canais iónicos cardíacos (ou seja, L e canais de cálcio do tipo T) 9 e isoformas de proteínas maduras contrácteis sarcoméricas normalmente encontrado nos miócitos atriais adultos como os outros e que têm relatado anteriormente. 10-13 Além disso, as células HL-1 pode ser cultivadas para formar uma 2-dimensional (2-D) monocamada de miócitos. Assim, as vantagens de usar cultivadas monocamadas de HL-1 incluem: 1) custo relativamente mais baixo e mais fácil de manter uma linha de cultura de miócitos de isolar e cultivar os miócitos neonatais primários; 2) uma monocamada confluente de células reduz as complexidades estruturais que resultam da estrutura 3-D do coração; 3) uma monocamada de células pode eliminar a interferência de fibrose intersticial que ocorre no coração intacto. Isto pode ser utilizado para dissecar funções específicas electrofisiológicas de um grupo de miócitos, sem interferência de fibroblastos e da matriz intersticial; 4) avaliação das consequências funcionais a partir de manipulação farmacológica ou genética na culmonocamadas de células Tured pode ser efetivamente alcançado. Portanto, HL-1 células tornaram-se um modelo celular amplamente utilizado para estudar diversos aspectos da fisiologia dos miócitos, bem como atividades elétricas anormais induzida por estimulação. 13-16 No entanto, manuseio e cuidados especiais são necessários para a cultura monocamadas de células saudáveis ​​que respondem a externo A estimulação eléctrica para estudos de mapeamento óptico. Além disso, o processo de coloração do corante fluorescente dupla pode facilmente danificar a integridade de monocamadas confluentes de células cultivadas. Assim, a realização V m / CA dual channel mapeamento óptico no cultivadas HL-1 monocamadas tem sido um grande desafio. O objetivo deste método é fornecer os principais passos para a realização com êxito mapeamento óptico de canal duplo em cultivadas HL-1 monocamadas. Aqui nós fornecemos detalhes abrangentes sobre um protocolo otimizado para preparação monocamada HL-1 celular, mapeamento óptico de canal duplo de uma monocamada de células cultivadas, e processamento de dados de mapeamento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhod2 dry powder</td>
			<td style="width:103px;">&#160;AAT Bioquest</td>
			<td style="width:119px;">21062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pluronic</td>
			<td style="width:103px;">AAT Bioquest</td>
			<td style="width:119px;">20050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">DMSO</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rh237</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">&#160;S-1109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KH2PO4&#160;</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4&#160;</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPEs</td>
			<td style="width:103px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

voltage and calcium dual channel optical mapping of cultured hl-1 atrial myocyte monolayer

Mapeamento Optical tem provado ser uma técnica valiosa para detectar a atividade elétrica cardíaca em ambos intacta ex vivo corações e em monocamadas miócitos em cultura. Células HL-1 têm sido amplamente utilizados como um modelo celular de 2-dimensional para o estudo de diversos aspectos da fisiologia cardíaca. No entanto, tem sido um grande desafio para o mapa opticamente cálcio (Ca) transientes e potenciais de ação simultaneamente a partir do mesmo campo de visão em um HL-1 monocamada de células cultivadas atrial. Isto porque manuseio e cuidado especial é necessário para preparar as células saudáveis ​​que podem ser eletricamente capturados e opticamente mapeadas. Por conseguinte, foi desenvolvido um protocolo de trabalho óptima para o mapeamento óptico de canal duplo. Neste manuscrito, temos descrito em detalhes como realizar o experimento mapeamento óptico de canal duplo. Este protocolo é uma ferramenta útil para melhorar a compreensão da propagação do potencial de ação e cinética de Ca no desenvolvimento de arritmia.

A monocamada confluente cultura apresenta um ritmo intrínseco regular como demonstrado no filme 1. Nós, então, realizada V m / Ca mapeamento óptico de dois canais em um totalmente confluente HL-1 monocamada. A Figura 1A mostra exemplo vestígios de V sinais Ca m e a partir de um único gravado bater. Mapas isócronos representativos de sinais de Ca utilizando o sistema de mapeamento óptico de duplo canal uniformemente propagadas V m e estão apresen...

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Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Tensão e cálcio Dual Channel Mapping Optical do Cultivadas HL-1 Atrial miócitos Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

voltage-calcium-dual-channel-optical-mapping-cultured-hl-1-atrial

Research

JoVE Journal

Biology

10.1K visualizações.  Loyola University Chicago. This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

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Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Cuidados e limpeza do microscópio

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Biologia

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Contraste de fase e de interferência diferencial Contrast Microscopy (DIC)

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Mapeamento óptica de corações perfundidos Langendorff-Rat

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Optical Recording of Electrical Activity in Guinea-pig Enteric Networks using Voltage-sensitive Dyes

The enteric nervous system (ENS) is a self-contained network with identified functions, capable of performing complex behaviors in isolation. Its neurons (10 to 25 &mu;m in diameter) are arranged in plexuses that are confined to distinct planes of the gut wall 1; the myenteric plexus can be found between the longitudinal and circular muscle layers, and the submucous plexus between the circular muscle layer and the mucosa. Since the effector systems for these plexuses (transporting epithelium, endocrine cells, immune elements, blood vessels and smooth muscle) are also contained within the gut wall, semi-intact preparations can be dissected that preserve individual components of different reflex pathways. The behavior of the effector systems is controlled by the submucous and myenteric plexuses acting in concert. Therefore, detailed knowledge of synaptic interactions within and between ganglia, and of communication between the plexuses, is essential for understanding normal gastrointestinal function. The ENS, as an intact nervous system, is a unique experimental model in which one can correlate molecular and cellular events with the electrical behavior of the neuronal network and its physiological outputs. Because of the quasi-two-dimensional organization of its plexuses, the ENS is particularly well suited for the study of neural networks using multiple site optical recording techniques that employ voltage-sensitive dyes 2,7,8,9. We will illustrate here the use of a relatively new naphthylstyryl-pyridinium dye (di-4-ANEPPDHQ) 3 that offers multiple advantages over its predecessors, including very low phototoxicity, slow rate of internalization, and remarkable chemical stability. When used in conjunction with a camera that permits sub-millisecond time resolution, this dye allows us to monitor the electrical activity of all the neurons in the field of view with a maximal spatial resolution of ~ 2.5 &mu;m at 100X magnification. At lower magnification (10X or 20X), the sacrifice of single-cell resolution is compensated by a gain in perspective, revealing the intricacies of the inter-ganglionic circuitry.

This protocol illustrates how voltage-sensitive dyes enable optical recording of electrical activity from intact neural networks such as the plexuses of the guinea-pig enteric nervous system, with an adjustable resolution that ranges from single-cells to multi-ganglionic circuitry.

A gravação óptica de atividade elétrica na Guiné-porco Networks Enteric usando Tensão sensível Corantes

The enteric nervous system (ENS) is a self-contained network with identified functions, capable of performing complex behaviors in isolation. Its neurons ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of fluorescence can be changed by exposure to light of a specific wavelength. Optical highlighting allows noninvasive marking of a subpopulation of fluorescent molecules, and is therefore ideal for tracking single cells or organelles.
Critical parameters for efficient photoconversion are the intensity and the exposure time of the photoconversion light. If the intensity is too low, photoconversion will be slow or not occur at all. On the other hand, too much intensity or too long exposure can photobleach the protein and thereby reduce the efficiency of photoconversion.
This protocol describes a general approach how to set up a confocal laser scanning microscope for pc-FP photoconversion applications. First, we describe a procedure for preparing purified protein droplet samples. This sample format is very convenient for studying the photophysical behavior of fluorescent proteins under the microscope. Second, we will use the protein droplet sample to show how to configure the microscope for photoconversion. And finally, we will show how to perform optical highlighting in live cells, including dual-probe optical highlighting with mOrange2 and Dronpa.

This protocol describes a general approach to perform photoconversion of fluorescent proteins on a confocal laser scanning microscope. We describe procedures for the photoconversion of puried protein samples, as well as for dual-probe optical highlighting in live cells with mOrange2 and Dronpa.

Fotoconversão de proteínas purificadas fluorescentes e Dual-sonda Destacando Optical em células vivas

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

Isolamento e gravações de canais Kv em Murino cardiomiócitos atriais e ventriculares

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

Reconstituição de uma proteína transmembrana, a voltagem-Ion Channel, KvAP, em Gigante Unilamelares Vesicles para microscopia e de Patch Estudos Grampo

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.

Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.

Single-channel Análise e cálcio Criação de imagem do Podócitos do recentemente isolados glomérulos

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

Mapeamento óptica de Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; E Potencial Transmembrane no Coração Langendorff-perfundidos

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...