Gostaríamos de agradecer a Alex Hitchen e Meg Booth por sua ajuda com os julgamentos de acasalamento. Este trabalho foi apoiado pelo NERC concessão NE / H015604 / 1 para TP.

1. Preparação de Fly Alimentos com corante alimentar <ol><li> Pegue um frasco Drosophila padrão com cerca de 20 ml de alimento no fundo (Figura 1). Use a seguinte receita para o mix de alimentos utilizando 1 L de água fervente: 10 g de ágar, 85 g de dextrose, 60 g de farinha de milho, 40 g de fermento, e mexa por 5 min de chiar. Adicionar 25 ml de 10% nipagen uma vez que a mistura tenha arrefecido a 75 ° C. </li><li> Após o alimento ter arrefecido e solidificado adicionar duas gotas (aproximadamente 0,5-1 ml) de corante azul para o início da comida e distribuídos por toda a superfície do frasco (Figura 1). Use um corante de cor diferente, se preferir. </li><li> Deixar a comida durante dois dias no frigorífico de modo a que o corante é absorvido pela camada de topo de alimentos; isso evita a umidade excessiva danificar as moscas durante o período de maturação. Adicionar um pequeno pedaço de papel de seda, se a umidade excessiva ainda é um problema para desfazer-se umidade extra e posteriormenteremova. </li><li> Transferência voa para a comida, individualmente ou em grupos. Nota: As moscas ganhará coloração intestinal dentro de 1 dia de serem colocados sobre os alimentos. Alternativamente, as moscas totalmente maduras sobre a comida tingido antes da experiência (aumento de mortalidade durante o período de maturação, não foi observada a partir de exposição ao corante alimentar). </li><li> Verifique se as moscas tingidos pode ser facilmente distinguidos dos moscas não-tingidos. Se eles não podem ser distinguidas, repetir os passos 1,1-1,4 usando uma maior concentração de corante, ou um corante diferente. </li></ol> 2. Dois ensaios de acasalamento dos machos o uso de alimentos para colorir <ol><li> Para a produção de descendência, configurar vários frascos contendo pares de moscas fêmeas e machos (pequenos grupos de machos e fêmeas também são adequados, apesar de ter o cuidado de evitar a aglomeração de larvas). Permitir que as fêmeas põem ovos e mover as moscas para novos frascos a cada 5-7 dias. Armazenar os frascos a uma temperatura adequada para a espécie de interesse (22 ° C fou D. pseudoobscura e D. subobscura e 25 ° C para D. melanogaster). </li><li> Antes da coleta de moscas experimentais remover todas as moscas dos frascos de coleta em um horário definido, antes de recolher machos e fêmeas para garantir que eles vão ser virgens (D. melanogaster - 6 horas a 25 ° C, D. pseudoobscura - 18 horas a 22 ° C, e D. subobscura - 24 h a 22 ° C). Nota: Se as moscas não são virgens esse viés vontade o seu comportamento em ensaios de acasalamento 15. <ol><li> Loja e macho maduro individualmente no padrão de 75 x 20 mm frascos de plástico (contendo ~ 20 ml de alimento). Isso evita os impactos negativos sobre o comportamento de acasalamento dos machos e fitness visto em algumas espécies em que os machos são mantidos em grupos de 16. </li><li> Expor metade dos homens para o tratamento desejado (CO 2 anestesia, neste caso). Use um tapete de CO 2 ou toque para expor as moscas durante o tempo necessário. Metade da loja do males em cada tratamento em alimentos de cor até que o acasalamento ocorre. Isto irá torná-los visualmente distinguíveis durante os ensaios de acasalamento. </li><li> Para a transferência de moscas usar um aspirador 17. Rotular cada frasco para identificar tanto o tratamento e o estado de cor do sexo masculino. Aqui, use quatro tratamentos (anestesia, não colorido = G-NC, anestesia, colorido = GC, sem anestesia, não colorida, NG-NC, e sem anestesia, colorido, NG-C). </li></ol></li><li> Transferir fêmeas recém-emergidas em frascos de alimentos frescos a amadurecer como grupos de 10. </li><li> Permitir moscas para amadurecer à idade de acasalamento (D. melanogaster - 3 dias, D. pseudoobscura - 5 dias, D. subobscura - 7 dias: 18 loja voa a uma temperatura adequada para a espécie a ser estudadas (por exemplo, 22 ° C para D. . pseudoobscura e D. subobscura e 25 ° C para D. melanogaster). </li><li> Mova fêmeas para frascos individuais (containing ~ 20 ml de alimento) um dia antes do julgamento de acasalamento para a aclimatação para o frasco de acasalamento. Identifique esses frascos para que os frascos podem ser diferenciados. Tenha cuidado para cegar o experimento usando rotulagem neutral (ie, 1-150) por isso não é possível adivinhar a identidade das moscas em qualquer frasco. Nota: A pessoa que coloca as moscas em cada frasco terá que saber a identidade das moscas colocados em cada frasco como eles vão notar que o tratamento foi manchada. No entanto, o observador que assiste o acasalamento não deve conhecer a sua identidade. Para fazer isso serão necessários pelo menos dois pesquisadores, um para configurar e uma para observar. </li><li> Início aos ensaios de acasalamento entre 10-12 horas, ou em um momento que coincide com a luz que vem no ciclo claro / escuro as moscas estão expostos a (&quot;amanhecer&quot; para as moscas). Adicione duas moscas do sexo masculino para cada frasco de acasalamento (que contém uma única mosca fêmea), utilizando um aspirador. Certifique-se de que os dois homens são de diferentes tratamentos (anestesia oucontrole) e que se tem coloração intestinal para torná-lo possível diferenciá-las umas das outras, e observe que macho é manchada. </li><li> Caso ocorra a cópula, gravar o status do macho que se encaixa (ou coloridas ou não - colorido). Se os testes duram 2 horas, assuma a fêmea não vai acasalar. Nota: 2 horas é adequado para estas espécies, mas outras Drosophila pode precisar de mais ou menos tempo. </li></ol> 3. único macho Trials Acasalamento <ol><li> Para únicos ensaios masculinos, repita Protocol 2 com duas alterações: <ol><li> No passo 2.3 não manter machos em alimentos coloridos. </li><li> No passo 2.7, adicionar apenas um único macho para cada frasco. </li></ol></li><li> No passo 2.8, gravar o momento em que a mosca é adicionada ao frasco, o tempo de acasalamento os arranques e o tempo do acasalamento acabados devem ser gravados. A partir desses valores, calcular o sucesso de acasalamento, latência e duração. </li></ol> Análise 4. Dados <ol><li> Use pacote estatístico adequado para analise. Se os dados são normais e só tem dois tratamentos, usar t-testes ou equivalente Modelo Linear Generalizado (GLM). Por dois experimentos do sexo masculino, usar testes binomial ou uma GLM binomial que estão disponíveis em qualquer pacote de estatísticas de base. Nota: Para obter os dados de exemplo, todas as análises foram realizadas em R versão 3.0.3 19. </li><li> Verifique os dados de latência de acasalamento e duração de acasalamento para a normalidade, traçando histogramas de latência e duração de frequência para cada tratamento 20, e usando um teste para a normalidade, como Shapiro-Wilk. Se não for normal, transformá-lo, ou usar as estatísticas não paramétricas equivalentes 20. Nota: Para obter os dados de exemplo a partir das experiências individuais masculinos log transformação cumpridos os requisitos de normalidade e variâncias iguais. </li><li> Se os dados podem ser normalizada, de uso de t-testes para examinar as diferenças entre a latência de acasalamento e duração nos ensaios de acasalamento dos machos solteiros quando se usa dois tratamentos 21. Se forem utilizados vários tratamentos,tentar uma análise de variância (ANOVA) 20. Se os dados não podem ser normalizada, tente testes não-paramétricos equivalentes 21. </li><li> Use testes binomial para testar um efeito de qualquer corante alimentar ou 2 anestesia CO sobre o sucesso de acasalamento dos machos competem 20. Se são utilizados vários tratamentos, como é o caso com os dados de exemplo, utilizar uma estrutura com GLM erro binomial 21. </li><li> Para os dois ensaios masculinos nos dados de exemplo, use MLG com estruturas de erro binomial. Um GLM examinou a cor como uma variável de resposta (colorido = 0 e incolor = 1) com as espécies, o estado de gás e tratamento de gás instalado como explicativo variables.One GLM examinado CO 2 como uma variável de resposta (gaseados = 0 e não-gaseados = 1) com as espécies, o estado de cor e tratamento de gás instalados. Em cada caso, o modelo de produzir máxima, e executar simplificação do modelo baseia-se AIC 20. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Estes dados mostram que o impacto da anestesia CO 2 é inconsistente entre as espécies, com duas das três espécies com pouco impacto. Nossos resultados sugerem marcação com corante alimentar teve um impacto menor sobre o sucesso de acasalamento dos machos do que o CO 2 anestesia para D. melanogaster. Estas experiências demonstram que os corantes alimentares podem facilmente e barato para ser usado moscas etiqueta para ensaios de acoplamento envolvendo vários machos. Das espécies Drosophila três modelos examinados, apenas D. melanogaster mostrou um efeito de CO 2 anestesia sobre o desempenho do acasalamento em uma situação competitiva. Em contrapartida, nenhuma das espécies mostrou um efeito da coleta do gás em ensaios de acasalamento individuais em termos de latência de acasalamento, contrariamente aos resultados anteriores para D. melanogaster 5. O efeito da concorrência poderia, portanto, ser destacando efeitos de fitness mais sutis de anestesia CO 2, que só são detectáveisem situações em que há competição masculina por homens. Exposição a coleção no início e um dia antes de o julgamento ter um efeito negativo sobre a capacidade dos machos de D. melanogaster para obter um acasalamento. Exposição dois dias antes do julgamento, contudo, não mostrou qualquer efeito. Tanto D. pseudoobscura e D. subobscura não mostrou qualquer efeito da exposição a gás em qualquer dos ensaios. Uma explicação é que D. melanogaster era vulnerável a exposição precoce ao CO 2, porque devem ser recolhidos mais cedo na vida (0-6 hr de idade) do que as outras espécies para garantir os machos são virgem. Daí masculino D. melanogaster desta idade podem ser mais sensíveis como a cutícula da mosca ainda é o endurecimento, em comparação com as outras espécies que tiveram mais tempo para a sua cutícula para endurecer. Em geral, isso apóia a idéia de que os efeitos do CO 2 anestesia são espécies específicas e os investigadores devem testar adequadamente o efeito em suas espécies-alvo. Currently, a maioria dos trabalhos sobre o efeito do CO 2 anestesia foi realizada em Drosophila melanogaster 5,11,22 e, por conseguinte, pode não ser apropriado aplicar a outras espécies relacionadas. O método não-invasivo alternativo apresentado para diferenciar as moscas é corante alimentar. Os resultados sugerem que este tratamento não teve efeito em toda a todas as espécies examinadas. No entanto, enquanto que a sua utilização foi bem sucedida em proporcionar um marcador mais barato e facilmente visível para distinguir entre indivíduos deve notar-se que o corante foi mais fácil de distinguir em D. pseudoobscura e D. subobscura do que em D. melanogaster. Anterior autores têm usado várias cores (vermelho, verde e azul) 4,6. Encontramos coloração azul para ser o mais fácil de distinguir em todas as espécies, em particular D. pseudoobscura e D. subobscura. Usando várias cores permitiria potencialmente experimentos mais complexos, com muitos flie marcados individualmentes. No entanto, os testes preliminares de diferentes corantes são essenciais, já que alguns corantes alimentares não conseguem colorir as moscas, possivelmente ser digerida quando consumidos. Outros corantes podem ter efeitos tóxicos e reduzir a sobrevivência das moscas, e deve ser evitado 14). Métodos de coloração de alimentos alternativos usando manchas mais caras também têm sido utilizados para examinar a integridade intestinal para D. melanogaster 23. Estes podem fornecer uma alternativa, embora mais caro, método de tingimento 23. O método de corante é tão rápido como CO 2 recorte asa como moscas podem ser armazenados em alimentos tingidos da coleção. A absorção dos alimentos foi rápida (~ 3 horas), assim que o armazenamento O / N em alimentos de cor também seria suficiente para marcar moscas, como usado em outros estudos 6. No entanto, a duração da coloração é relativamente curto (~ 4-5 h) em relação ao recorte de asa (permanente) ou de pó fluorescente marcação (10 - 12 dias) 24. Como espécie Drosophilavariar em aparência, corantes diferentes serão mais ou menos eficazes para diferentes espécies, e dado que algumas estirpes (por exemplo, mutantes de knock-out) pode ser vulnerável a alterações na dieta, qualquer utilização do corante requer um teste preliminar da sua eficácia particularmente se mais exposição prolongada a corantes podem ser tóxicos 14. Em contraste com o estudo realizado por Kalaw et al. 14, não foi encontrada uma mortalidade significativa após o armazenamento por vários dias em alimentos coloridos para D. melanogaster (3 dias), D. pseudoobscura (5 dias), ou D. subobscura (7 dias), provavelmente devido à diferença de corante utilizado. O passo crítico para a utilização com sucesso do corante é a etapa 1.5, validando que o corante escolhido funciona bem com as espécies e da estirpe a ser utilizada. Uma técnica alternativa envolve a aplicação de pó colorido para o exterior da mosca antes do uso em experiências de campo 24. Este método tem sido utilizado para rastrear indivíduos no campo devido to da duração da marcação e da facilidade de massa marcação voa 24. Embora não tenhamos explicitamente testado esse método em ensaios de acasalamento, seria importante analisar os efeitos que a poeira poderia ter sobre os sentidos importantes no acasalamento, particularmente em Drosophila 25, 26. Na espécie, no entanto, onde tingimento intestinal não é possível, estes métodos podem ser apropriados. Em conclusão, descobrimos que em duas das três espécies testadas (D. pseudoobscura e D. subobscura) não houve efeito encontrado tanto de CO 2 anestesia ou corante alimentar na capacidade de acasalamento dos machos. Para D. melanogaster um efeito negativo de CO 2 a anestesia foi detectado, mas a coloração de alimento não afetou o sucesso de acasalamento dessa espécie. Em geral, o método do corante proporciona um método não-invasivo, de simples e barata para a identificação de Drosophila indivíduo que é equivalente ou melhor do que os métodos que requerem anestesia de CO 2. Eleé provável que este método poderia funcionar em uma variedade de espécies.

Ao longo das últimas décadas tem havido um interesse crescente em como a seleção sexual e competição entre machos impacto na evolução 1,2. Experiências sobre o comportamento de acasalamento têm desempenhado um papel importante no desenvolvimento e teste de teorias da seleção sexual 3,4. Em particular, a pesquisa com espécies do gênero Drosophila, tem contribuído grandemente para a compreensão da seleção e comportamento sexual. No entanto, é importante investigar se técnicas comumente utilizadas poderia influenciar artificialmente os resultados de experiências de acasalamento padrão 5,6. A anestesia é frequentemente utilizado para o manuseio e identificação em experimentos 7. Por exemplo, as moscas são comumente coletadas antes do acasalamento, ou classificados em genótipos ou tratamentos experimentais utilizando dióxido de carbono (CO 2) anestésico. Em experiências em que dois ou mais indivíduos precisam ser distinguidos, é prática comum para anestesiar a flies e clip parte da ala off para identificar cada indivíduo ou grupo de tratamento 5,8. É fundamental, no entanto, para entender como CO 2 tratamento irá afetar o comportamento. O efeito do CO 2 anestesia foi examinado em Drosophila melanogaster em que os machos expostos ao CO 2 foi significativamente mais longo para acasalar e que teve sucesso de acasalamento menor que os homens ou machos não anestesiados anestesiados utilizando a exposição ao frio 5. Este efeito foi observado tanto quando a anestesia foi aplicado no dia da experiência e quando as moscas foram um dia para se recuperar. No entanto, este estudo foi limitado em ensaios apenas examinando em que um único macho foi apresentado para cada fêmea 5. Um cenário mais realista é para uma mulher encontrar vários machos 9,10, permitindo que a concorrência entre os homens, o que pode permitir a detecção de perdas mais sutis de ginástica masculina devido à anestesia. O uso de anestesia CO 2 também seren encontrada para reduzir a fecundidade e longevidade de adultos de D. melanogaster quando eles são expostos logo após a eclosão, como é comum na recolha virgem voa 11. Uma alternativa para o CO 2 anestesia é marcar moscas alimentando-os alimentos coloridos com corante 4,6,10,12,13. Este corante entra no intestino da mosca e é visível através do abdómen, permitindo moscas coloridas para ser distinguido de moscas sem cor, ou a partir de moscas marcadas com uma cor diferente. Métodos diferem na forma como esta pode ser aplicada: a ser adicionado directamente à alimentação 12, através tingido levedura complementar colar 6, ou através de exposição a um novo substrato tingido comida 13. Essas técnicas de marcação parecem mostrar nenhum efeito sobre o desempenho 4,6 acasalamento. No entanto, um papel examinar directamente os efeitos do mesmo corante alimentar sobre adulto D. melanogaster encontrou uma forte redução na expectativa de vida 14. Trabalhos anteriores também se concentrou almost inteiramente em D. melanogaster, tanto no que diz respeito aos efeitos do CO 2 anestesia 5,11 e corante alimentar 14 métodos. Actualmente, há pouca informação sobre a forma de CO 2 a anestesia ou a utilização de coloração intestinal afecta o comportamento de acasalamento dos outros Drosophila. O seguinte estudo avalia o efeito do CO 2 anestesia sobre o comportamento de acasalamento de três espécies de Drosophila melanogaster (D., D. pseudoobscura, e D. subobscura). O efeito de coleta de moscas em CO 2 foi examinado em ambos solteiros e dois ensaios de acasalamento dos machos. O efeito do CO 2 também tem sido observadas variações significativas em D. melanogaster 5 e assim por diferentes períodos de latência entre a exposição ao CO 2 e acasalamento foram testados. Um método de recorte anestesia e asa marcação alternativa: é também avaliada a utilização de corantes alimentares para manchar as moscas.

<table><tbody><tr><td>Plastic tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>TWT-200-061G</td><td>Other tubing may be suitable however it must fit within a 1ml pipette tip.</td></tr><tr><td>Fine mesh</td><td>Any haberdashery</td><td>-</td><td>Fine curtain mesh is suitable</td></tr><tr><td>1 ml pipette tips</td><td>VWR</td><td>83007-376</td><td>Various brands of pipette tips would be suitable</td></tr><tr><td>Plastic Vials</td><td>Sarstedt</td><td>58.49</td><td>Larger vials or bottles could also be used.</td></tr><tr><td>Cotton Balls</td><td>Lewis Medical Solutions</td><td>28170</td><td>The size of cotton will vary depending on the size of vials used</td></tr><tr><td>Blue Food colouring</td><td>Thesugarcraftcompany</td><td>-</td><td>Other dye colours and brands can have variable results.</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Tank</td><td>BOC</td><td>BOC 40VK</td><td></td></tr><tr><td>Sharpie Markers</td><td>Steadtler</td><td>Lumocolor 313 S</td><td>Various colours can be used, but Lumocolor S give an excellent combination of durability and fineness</td></tr><tr><td>Stopwatch</td><td>Salter</td><td>SL3920</td><td>Any stopwatch with a good digital display would be fine</td></tr></tbody></table>

dyeing insects for behavioral assays: the mating behavior of anesthetized drosophila

Experiências de acoplamento usando Drosophila têm contribuído grandemente para a compreensão da seleção e comportamento sexual. Experimentos muitas vezes exigem métodos simples, fácil e barato para distinguir entre indivíduos em um julgamento. A técnica padrão para isso é CO 2 anestesia e, em seguida, a rotulagem ou a asa recorte cada mosca. No entanto, este é invasivo e tem sido demonstrado que afectam o comportamento. Outras técnicas utilizadas para identificar a coloração moscas. Este artigo apresenta um método simples e não invasivo para a rotulagem Drosophila que permite que eles sejam identificados individualmente dentro de experimentos, utilizando corante alimentar. Este método é usado nos ensaios em que dois machos competem para acasalar com a fêmea. Tingimento permitiu a identificação rápida e fácil. Houve, no entanto, alguma diferença na força da coloração nas três espécies testadas. Os dados são apresentados mostrando o corante tem um menor impacto no comportamento de acasalamento de CO 2 em Drosophila melanogaster. O impacto da anestesia CO 2 é mostrada a depender da espécie de Drosophila, com D. pseudoobscura e D. subobscura mostrando nenhum impacto, enquanto que D. machos melanogaster tinha reduzido sucesso de acasalamento. O método do corante apresentado é aplicável a uma vasta gama de modelos experimentais.

Dois ensaios de acasalamento dos machos - O efeito do CO 2 anestesia no comportamento de acasalamento O melhor modelo encontrado para explicar a variação do efeito do CO 2 anestesia continha espécies como um factor (com pseudoobscura D. e D. subobscura fundido, como eles não mostraram diferenças entre si). Em D. pseudoobscura e D. subobscura não houve efeito significativo de CO 2 anestesia no sucesso de acasalamento em dois ensaios do sexo masculino (1.589 Z = 0,087, P = 0,931). Para D. melanogaster, os machos expostos ao CO 2 anestesia teve significativamente menor sucesso de acasalamento (Z1,589 = 2,467, P = 0,014). Houve também uma interação significativa entre espécies e de tratamento (χ 2 = 1,589 6,83, P = 0,009), com um efeito maior a ser visto quando D. melanogaster foram expostos ao gás à cobrança ou 1 dia antes os ensaios (Tabela 1). However, D. machos melanogaster expostos a CO 2 dois dias antes do ensaio experimental não mostrou um efeito de CO 2. Dois ensaios de acasalamento dos machos - O efeito da coloração intestinal no comportamento de acasalamento Modelo simplificação não mostrou efeito significativo de corante alimentar sendo encontrados para qualquer uma das três espécies (P&gt; 0,1). Quando o tratamento ou estado de gás foram incluídos na análise estes foram também não significativo (P&gt; 0,1). As proporções de acasalamentos bem sucedidos para moscas de cor em todos os tratamentos estão apresentados na Tabela 2. A diferença na coloração entre moscas mantidos em alimento colorido e incolor pode ser visto na Figura 1. A intensidade da coloração de alimentos do intestino foi maior em D. pseudoobscura e D. subobscura do que em D. melanogaster. Ensaios de acasalamento única - o efeito do uso de CO 2 anestesia sobre mcomportamento ating Não houve diferença na latência de acasalamento para qualquer uma das três espécies quando o CO 2 anestesia foi usada para recolher recentemente emergiram adultos. Um efeito foi encontrado para a duração do acasalamento em D. subobscura quando foi exposta ao CO 2 dois dias antes de ensaios de acasalamento (Figuras 2 e 3 e Tabela 2). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52645/52645fig1.jpg" /> Figura 1. Fotografia que mostra frascos de colorido e não colorido Fly Alimentos (A) e da Força de Intestinal Coloração em Male D. Subobscura (B). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52645/52645fig2.jpg" /> Figura 2. A média e 95% de intervalo de confiança para a cópula Latência para as três espécies investigadas em ensaios Homem Solteiro, quando os machos eram anestesiard (barras claras) ou não anestesiados (barras escuras) quando recolhido como Virgins antes da maturidade sexual. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52645/52645fig3.jpg" /> Figura 3. A média e 95% Intervalos de Confiança para Cópula Duração para as três espécies investigadas em ensaios Homem Solteiro, quando os machos foram anestesiados (barras claras) ou Não anestesiados (barras escuras) quando recolhido como Virgins antes da maturidade sexual. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Tratamento </td><td> Espécies </td><td> Ensaios No. </td><td> No. moscas colorido que acasalaram </td><td> p-valor </td><td> No. moscas gaseados que acasalou </td><td> p-valor </td></tr><tr><td rowspan="3"> Coleção de CO 2 </td><td> D. mel </td><td> 73 </td><td> 36 </td><td> 1 </td><td> 27 </td><td> 0,0344 </td></tr><tr><td> D. PSE </td><td>79 </td><td> 41 </td><td> 0,8221 </td><td> 44 </td><td> 0,3682 </td></tr><tr><td> D. sub </td><td> 71 </td><td> 40 </td><td> 0,3425 </td><td> 33 </td><td> 0,6353 </td></tr><tr><td rowspan="3"> Expostos ao CO 2 de 18 horas antes </td><td> D. mel </td><td> 57 </td><td> 28 </td><td> 1 </td><td> 19 </td><td> 0,0163 </td></tr><tr><td> D. PSE </td><td> 65 </td><td> 32 </td><td> 1 </td><td> 31 </td><td> 0,8043 </td></tr><tr><td> D. sub </td><td> 68 </td><td> 38 </td><td> 0,3961 </td><td> 35 </td><td> 0,9036 </td></tr><tr><td rowspan="3"> Expostos ao CO 2 dois dias. </td><td> D. mel </td><td> 56 </td><td> 19 </td><td> 0,0222 </td><td> 32 </td><td> 0,3497 </td></tr><tr><td> D. PSE </td><td> 70 </td><td> 32 </td><td> 0,5504 </td><td> 33 </td><td> 0,7202 </td></tr><tr><td> D. sub </td><td> 56 </td><td> 29 </td><td> 0,8939 </td><td> 26 </td><td> 0,6889 &lt;/ Td&gt; </tr></tbody></table> Tabela 1. Os resultados de dois experimentos Masculino escolha para todas as espécies e tratamentos examinados. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Espécies </td><td> Traço </td><td> df </td><td> t-value </td><td> p-valor </td></tr><tr><td rowspan="2"> D. melanogaster </td><td> Latência </td><td> 58 </td><td> 1.379 </td><td> 0,174 </td></tr><tr><td> Duração </td><td> 58 </td><td> 1.243 </td><td> 0,221 </td></tr><tr><td rowspan="2"> D. pseudoobscura </td><td> Latência </td><td> 109 </td><td> 0,419 </td><td> 0,676 </td></tr><tr><td> Duração </td><td> 109 </td><td> 0,436 </td><td> 0,664 </td></tr><tr><td rowspan="2"> D. subobscura </td><td> Latência </td><td> 83 </td><td> 0,098 </td><td> 0,922 </td></tr><tr><td> Duração </td><td> 83 </td><td> 1.767 </td><td> 0,081 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Os resultados de experimentos de conjugação de solteiro examinar o efeito de Coleta em CO 2 Anaesthesia no Acasalamento Latência e duração. Os testes foram realizados em três espécies de Drosophila melanogaster (D., D. pseudoobscura e D. subobscura).

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Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

Tingimento Insetos para Comportamentais Ensaios: o comportamento de acasalamento dos anestesiado<em&gt; Drosophila</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

dyeing-insects-for-behavioral-assays-mating-behavior-anesthetized

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

9.8K visualizações.  University of Liverpool. This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

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A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

An individual's sexual drive is influenced by genotype, experience and environmental conditions. How these factors interact to modulate sexual behaviors remains poorly understood. In Drosophila melanogaster, environmental cues, such as food availability, affect mating activity offering a tractable system to investigate the mechanisms modulating sexual behavior. In D. melanogaster, environmental cues are often sensed via the chemosensory gustatory and olfactory systems. Here, we present a method to test the effect of environmental chemical cues on mating behavior. The assay consists of a small mating arena containing food medium and a mating couple. The mating frequency for each couple is continuously monitored for 24 h. Here we present the applicability of this assay to test environmental compounds from an external source through a pressurized air system as well as manipulation of the environmental components directly in the mating arena. The use of a pressurized air system is especially useful to test the effect of very volatile compounds, while manipulating components directly in the mating arena can be of value to ascertain a compound's presence. This assay can be adapted to answer questions about the influence of genetic and environmental cues on mating behavior and fecundity as well as other male and female reproductive behaviors.

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

We demonstrate an assay to analyze the environmental and genetic cues that influence mating behavior in the fruit fly Drosophila melanogaster.

Um método para testar o efeito de sugestões ambientais no comportamento de acoplamento em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

An individual's sexual drive is influenced by genotype, experience and environmental conditions. How these factors interact to modulate sexual behaviors ...

Comportamento

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Métodos de Ensaio para Drosophila Comportamento

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Neurociência

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

A Single-fly Ensaio para comportamento de forrageamento em<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

An Adjustable High-Definition Imaging System for Behavioral Studies of Drosophila Adults

Drosophila melanogaster is a very powerful model in biological research, but a bad model for photography or videography. This paper describes a simple but effective method to observe and document the behavior or morphology of flies. Flies were placed in a translucent observation chamber c.a. &#216;15 x 5mm (no food inside) or &#216;15 x 12 mm (with an 8 mm-high piece of food inside). After covering with an ultraviolet (UV)/clear filter with high light transmittance, the chamber was placed under a 5-50x zoom stereo microscope, and mini light-emitting diode (LED) video lights were placed on both sides of the microscope to illuminate the chamber to obtain uniform, soft, bright, and nearly shadow-free light. Then, a compact digital camera with 3-5x optical zoom, which can record 1080 P high-definition or higher resolution video (at a frame rate of &#8805;30 fps), was connected to the eyepiece of microscope through a bracket, and photographs or videos were taken through the eyepiece. By adjusting the zoom knob of the zoom stereo microscope, it was very easy to track the flies and take panoramic or detailed close-up images as needed, while the camera recorded everything under the microscope. Because the flies can stay at any position in the chamber, they can be observed and recorded from all directions. The photographs or videos taken are of good image quality. This method can be used both for scientific research and teaching.

An Adjustable High-Definition Imaging System for Behavioral Studies of Drosophila Adults

This protocol describes how to make a simple adult Drosophila behavior observation chamber, and how to take high-definition photographs/videos of the morphology or behavior of different types of fruit flies in the observation chamber through relatively simple and affordable methods.

Um sistema de imagem de alta definição ajustável para estudos comportamentais de adultos drosophila

Drosophila melanogaster is a very powerful model in biological research, but a bad model for photography or videography. This paper describes a simple but ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by stressed conspecifics due to an odorant released during stress known as the Drosophila stress odorant (dSO). Through the use of the T-maze apparatus, one can quantify the avoidance of the dSO by responder flies in a very affordable and robust assay. Conditions necessary to obtain a strong performance are presented here. A stressful experience is necessary for the flies to emit dSO, as well as enough emitter flies to cause a robust avoidance response to the presence of dSO. Genetic background, but not their group size, strongly altered the avoidance of the dSO by the responder flies. Canton-S and Elwood display a higher performance in avoiding the dSO than Oregon and Samarkand strains. This behavioral assay will allow identification of mechanisms underlying this social behavior, and the assessment of the influence of genes and environmental conditions on both emission and avoidance of the dSO. Such an assay can be included in batteries of simple diagnostic tests used to identify social deficiencies of mutants or environmental conditions of interest.

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Here, we present a protocol to quantify the avoidance of stressed individuals. This paradigm is powerful yet user-friendly and can be used to assess the influence of genes and environment on one kind of social interaction in Drosophila melanogaster.

Ensaio simples para Quantificação de Prevenção Social<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

Clones em um ensaio comportamental para Mechanosensation de MarcM baseada em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a grooming assay protocol and novel chamber design that is cost-efficient and scalable for either small or large-scale studies of Drosophila grooming. Flies are dusted all over their body with Brilliant Yellow dye and given time to remove the dye from their bodies within the chamber. Flies are then deposited in a set volume of ethanol to solubilize the dye. The relative spectral absorbance of dye-ethanol samples for groomed versus ungroomed animals are measured and recorded. The protocol yields quantitative data of dye accumulation for individual flies, which can be easily averaged and compared across samples. This allows experimental designs to easily evaluate grooming ability for mutant animal studies or circuit manipulations. This efficient procedure is both versatile and scalable. We show work-flow of the protocol and comparative data between WT animals and mutant animals for the Drosophila type I Dopamine Receptor (DopR).

This protocol describes a scalable individual grooming assay technique in Drosophila that yields robust, quantitative data to measure grooming behavior. The method is based on comparing the difference in dye accumulation on the bodies of un-groomed versus groomed animals over a set period of time.

Quantificação do comportamento de higienização da Drosophila

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

Despite decades of investigation, the neuronal and molecular bases of motivational states remain mysterious. We have recently developed a novel, reductionist, and scalable system for in-depth investigation of motivation using the mating drive of male Drosophila&#160;melanogaster (Drosophila), the methods for which we detail here. The behavioral paradigm centers on the finding that male mating drive decreases alongside fertility over the course of repeated copulations and recovers over ~3 d. In this system, the powerful neurogenetic tools available in the fly converge with the genetic accessibility and putative wiring diagram available for sexual behavior. This convergence allows rapid isolation and interrogation of small neuronal populations with specific motivational functions. Here we detail the design and execution of the satiety assay that is used to measure and alter courtship motivation in the male fly. Using this assay, we also demonstrate that low male mating drive can be overcome by stimulating dopaminergic neurons. The satiety assay is simple, affordable, and robust to influences of genetic background. We expect the satiety assay to generate many new insights into the neurobiology of motivational states.

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

This article describes a behavioral assay that uses male mating drive in Drosophila melanogaster to study motivation. Using this method, researchers can utilize advanced fly neurogenetic techniques to uncover the genetic, molecular, and cellular mechanisms that underlie this motivation.

Medir e alterando Acasalamento Drive em Male<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Despite decades of investigation, the neuronal and molecular bases of motivational states remain mysterious. We have recently developed a novel, ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

Rastreamento do comportamento larval de Drosophila em resposta à estimulação optogenética de neurônios olfativos

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Behavioral Assays for Optogenetic Manipulation of Neural Circuits in Drosophila melanogaster

Optogenetics has become a fundamental technique in neuroscience, enabling precise control of neuronal activity through light stimulation. This study introduces easy-to-implement setups for applying optogenetic methods in Drosophila melanogaster. Two optogenetic tools, CsChrimson, a red-light-activated cation channel, and GtACR2, a blue-light-activated anion channel, were employed in four experimental approaches. Three of these approaches involve single-fly experiments: (1) a blue-light optogenetic thermotactic positional preference assay targeting temperature-sensitive heating cells, (2) a red-light optogenetic positional preference assay activating bitter sensing neurons, and (3) a proboscis extension response assay activating the sweet-sensing neurons. The fourth approach (4) is a fly maze setup to assess avoidance behaviors using multiple flies. The ability to manipulate neural activity temporally and spatially offers powerful insights into sensory processing and decision-making, underscoring the potential of optogenetics to advance our knowledge of neural function. These methods provide an accessible and robust framework for future research in neuroscience to enhance the understanding of specific neural pathways and their behavioral outcomes.

This paper presents methods for optogenetic manipulation in Drosophila melanogaster, utilizing CsChrimson and GtACR2 to activate and silence specific neurons. Four experiments are described to utilize optogenetics to explore thermotactic and gustatory behaviors, providing insights into the underlying neural mechanisms governing these processes.

Ensaios Comportamentais para Manipulação Optogenética de Circuitos Neurais em Drosophila melanogaster

Optogenetics has become a fundamental technique in neuroscience, enabling precise control of neuronal activity through light stimulation. This study ...

Tingimento Insetos para Comportamentais Ensaios: o comportamento de acasalamento dos anestesiado

Resumo

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Ensaios Comportamentais para Manipulação Optogenética de Circuitos Neurais em Drosophila melanogaster